陳倩倩 劉 波 王階平 劉國紅 鄭雪芳 李慧敏

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所1，福州 350002)(福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院2，福州 350002)

豆粕是大豆提取油脂后的副產(chǎn)品，含其中的粗蛋白含量高達(dá)40%～50%，氨基酸豐富，尤其富含其他植物性飼料易缺的的賴氨酸，是理想的植物性蛋白飼料[1,2]。然而，豆粕中含有胰蛋白酶抑制劑等多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，如植酸、胰蛋白酶抑制劑等，阻礙了腸道內(nèi)蛋白酶的活性，降低消化率，不利于動(dòng)物消化道吸收，甚至導(dǎo)致動(dòng)物腸道失衡，造成畜禽養(yǎng)殖損失[3]。微生物在發(fā)酵過程中產(chǎn)生多種酶類，如蛋白酶、纖維素酶和植酸酶等，鈍化抗?fàn)I養(yǎng)因子，并可將蛋白質(zhì)分解為小肽，改善產(chǎn)品品質(zhì)以及適口性，促進(jìn)飼料消化吸收，提高飼料轉(zhuǎn)化率[4-6]。

豆粕接種優(yōu)良微生物菌種進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，微生物在發(fā)酵過程中分泌度多種酶類對豆粕中的有機(jī)物進(jìn)行分解和利用，同時(shí)產(chǎn)生多種維生素和活性物質(zhì)，提升豆粕營養(yǎng)價(jià)值。生產(chǎn)過程能耗低、無廢水、成本低、產(chǎn)能高，易于操作[7-9]。用發(fā)酵后的豆粕飼喂仔豬等幼畜，可以降低仔豬料重比，改善腹瀉癥狀，提高其生產(chǎn)性能[10-12]。常用發(fā)酵微生物包括芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌和曲霉等[13,14]。芽孢桿菌是能夠產(chǎn)生芽胞，抗逆性強(qiáng)，耐受高溫、高壓和強(qiáng)酸堿，可以耐受胃酸和上消化道膽鹽和消化液的破壞，抵達(dá)下消化道并定植生長。芽孢桿菌生長消耗氧氣，維持腸道厭氧環(huán)境，促進(jìn)乳酸菌等厭氧益生菌的生長，抑制好氧病原菌，維持腸道微生態(tài)平衡[15]。同時(shí)，芽孢桿菌還能夠分泌纖維素酶和淀粉酶等胞外酶，添加至飼料中可以改善動(dòng)物自身消化酶的分泌不足，促進(jìn)動(dòng)物營養(yǎng)代謝[16]。王格等[17]采用高通量測序技術(shù)分析了芽孢桿菌混合發(fā)酵豆粕過程細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及演替規(guī)律，芽孢桿菌屬相對豐度隨著發(fā)酵進(jìn)行而降低，乳酸菌先升高后趨于穩(wěn)定；芽孢桿菌混合發(fā)酵抑制有害菌如大腸桿菌和沙門氏菌的生長。

枯草芽孢桿菌是理性的微生物功能飼料添加劑，廣泛應(yīng)用于飼料生產(chǎn)，提升豆粕發(fā)酵水平和營養(yǎng)價(jià)值[15,16]。然而，枯草芽孢桿菌對發(fā)酵豆粕細(xì)菌群落的影響還需要進(jìn)一步研究?；诖?，本研究以豆粕作為主要發(fā)酵材料，添加枯草芽孢桿菌JK2進(jìn)行固體發(fā)酵，分析發(fā)酵過程的理化性質(zhì)及營養(yǎng)成分；并采用IlluminaMiseq對其中的細(xì)菌群落測序分析，研究添加芽孢桿菌對豆粕細(xì)菌群落的影響，為豆粕的開發(fā)與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)菌株：枯草芽胞桿菌FJAT-FB1(BacillussubtilusFJAT-FB1)，本實(shí)驗(yàn)室分離保藏菌株。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值至7.0～7.2。豆粕、麩皮(市售)。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵豆粕：以豆粕為主要發(fā)酵原料，加入5%麩皮，調(diào)整含水量至50%。

選取芽孢桿菌單菌落至LB培養(yǎng)基中，35 ℃搖床180 r/min培養(yǎng)12 h。4 ℃下2 000 r/min離心5 min，用超純水重懸，調(diào)整至OD600為1.0。芽孢桿菌發(fā)酵組，添加5%的上述芽孢桿菌菌液；對照組添加等量清水。將各組置于35 ℃溫箱中靜置發(fā)酵7 d。每天進(jìn)行發(fā)酵樣品中心溫度和pH的檢測。B0(添加芽孢桿菌的豆粕)和W0(清水對照初始豆粕)經(jīng)過7 d的發(fā)酵，均呈現(xiàn)較好的發(fā)酵氣味和色澤。發(fā)酵后的豆粕顏色稍深，尤其是對照組W7樣本顏色最深，呈黃褐色；添加芽孢桿菌發(fā)酵的B7有獨(dú)特芳香氣味。

1.2.2 發(fā)酵飼料理化性質(zhì)分析

取發(fā)酵前后的豆粕10 g，加入90 mL純水，渦旋混勻，5 000 r/min離心10 min，獲得發(fā)酵上清液。上清液進(jìn)行梯度稀釋后，采用水質(zhì)儀檢測N和C指標(biāo)。

采用GC-MC檢測發(fā)酵飼料中的棕櫚酸和亞油酸：稱取2 g豆粕樣品加入4 mL丙酮，于漩渦震蕩器振蕩混勻后，超聲30 min，放于4 ℃萃取3 h，取上清液1.8 mL，離心(10 000 r/min，4 ℃)10 min，倒出上清液，棄沉淀。取上清液，過0.22 μm過濾器于GC小瓶內(nèi)，進(jìn)行GC-MS檢測，分析豆粕經(jīng)發(fā)酵前后物質(zhì)組成。

1.2.3 發(fā)酵豆粕總DNA的提取及微生物組測序

每個(gè)樣本稱取500 mg發(fā)酵豆粕，分別進(jìn)行總DNA的提取。采用細(xì)菌引物338F 和 806R擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA基因，PCR反應(yīng)重復(fù)3次，取相同體積混合后進(jìn)行目的片段回收。所用膠回收試劑盒為AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒。采用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)對回收PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量檢測。然后構(gòu)建插入片段為350 bp的paired-end(PE)文庫，經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測，HiSeq上機(jī)測序。

1.2.4 微生物組測序數(shù)據(jù)質(zhì)控與分析

對測序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過濾，得到有效數(shù)據(jù)。采用Mothur軟件(version 1.36.1)基于上述有效數(shù)據(jù)進(jìn)行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類和物種分類分析。采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析。從各個(gè)OTU中挑選出一條序列作為該OTU的代表序列，將該代表序列與已知物種數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析；根據(jù)每個(gè)OTU中序列的條數(shù)，得到各個(gè)OTU的豐度值。采用QIIME軟件的迭代算法，進(jìn)行主成分分析(PCA)。物種熱圖利用顏色梯度可以很好反應(yīng)出樣本在不同物種下的豐度大小以及物種聚類、樣本聚類信息，可利用R語言的gplots包的heatmap.2函數(shù)實(shí)現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵飼料理化性質(zhì)分析

對發(fā)酵溫度的檢測顯示，發(fā)酵1 d后溫度即有明顯升高。加入芽孢桿菌發(fā)酵在第1 d溫度即達(dá)到峰值(47 ℃)，對照組發(fā)酵2 d后，溫度達(dá)到峰值(42 ℃)，添加芽孢桿菌發(fā)酵促進(jìn)豆粕升溫。此后溫度下降，至第5 d，溫度略有回升。豆粕發(fā)酵后的pH從初始的6.45降至4.43，對照組的pH在發(fā)酵第3 d最低(5.7)，而后升高。在降到pH值最低后，各實(shí)驗(yàn)組pH值均有升高的趨勢，但有部分組后期又降低。這可能是由于剛發(fā)酵時(shí)，會(huì)產(chǎn)生一些有機(jī)酸、乳酸等酸性代謝產(chǎn)物，使得發(fā)酵豆粕pH值降低，但發(fā)酵一定時(shí)間后芽孢桿菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生蛋白酶，蛋白酶降解豆粕中蛋白質(zhì)產(chǎn)生胺類物質(zhì)，甚至產(chǎn)生一些氨氣使得產(chǎn)物pH升高。發(fā)酵飼料的pH大多在3.6～4.5之間，抑制腸道中致病菌的生長和繁殖。添加芽孢桿菌發(fā)酵，促進(jìn)豆粕中微生物產(chǎn)酸，降低豆粕pH。

發(fā)酵起始，C/N、亞油酸和棕櫚酸含量基本一致。發(fā)酵后，豆粕中的C/N呈現(xiàn)上升趨勢，對照組起始值為0.34，發(fā)酵7 d后為1.75；芽孢桿菌組起始值為0.33，發(fā)酵后為1.97。亞油酸含量隨著發(fā)酵而降低，芽孢桿菌組B7的亞油酸含量低于W7；芽孢桿菌組發(fā)酵后棕櫚酸含升高量，對照中棕櫚酸含量降低，芽孢桿菌組B7的棕櫚酸含量高于W7。豆粕中的亞油酸含量高于棕櫚酸。

圖1 豆粕固體發(fā)酵溫度變化

圖2 豆粕固體發(fā)酵pH變化

圖3 發(fā)酵飼料營養(yǎng)成分比較

2.2 不同發(fā)酵飼料細(xì)菌多樣性評估

細(xì)菌豐富度和多樣細(xì)菌最高值為最大值為B7和W7，發(fā)酵后豆粕中的細(xì)菌種類和數(shù)量都有所增加。反映群落豐富度的chao和sobs指數(shù)，范圍分別為119(B0)-148(W7)和99(W0)-121(W7)，數(shù)值越大，群落豐富度越高，W7豆粕細(xì)菌含量最高；香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)反映群落多樣性，香農(nóng)指數(shù)越高多樣性越豐富，而辛普森指數(shù)恰好相反，它們范圍分別在2.21(B0)～2.70(W7)和0.102(B7)～0.146(W0)，發(fā)酵后的豆粕中(B7和W7)細(xì)菌更具多樣性。測序覆蓋率均在99.9%以上，已經(jīng)基本覆蓋樣本中的所有物種。

表1 測序數(shù)據(jù)多樣性指數(shù)

2.3 發(fā)酵飼料中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

4種發(fā)酵豆粕中共檢測到230種OTU類型，包含11個(gè)門，17綱，34目，63科，113屬細(xì)菌。發(fā)酵豆粕中的主要細(xì)菌為厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)(圖4)。B0的厚壁菌門的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.8%，放線菌門為2.3%；發(fā)酵后的B7中，變形菌門相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.7%，厚壁菌門質(zhì)量分?jǐn)?shù)為88.9%。對照樣本中，W0的厚壁菌門細(xì)菌占比98.3%；發(fā)酵后的W7中，厚壁菌門相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)為93.3%，變形菌門相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.9%，放線菌門質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.7%。在發(fā)酵初期豆粕中厚壁菌門相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于發(fā)酵后的豆粕；發(fā)酵后的豆粕中變形菌門和放線菌門細(xì)菌相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加。

圖4 發(fā)酵飼料細(xì)菌門組成

發(fā)酵前的豆粕中，主要細(xì)菌為未分類的魏斯氏菌(unclassifiedWeissella)、耐久腸球菌(Enterococcusdurans)和類腸膜魏斯氏菌(Weissellaparamesenteroides)(圖5)。其中，未分類的魏斯氏菌的含量最高，在W0和CK0中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為19.4%和23.5%。這3種細(xì)菌經(jīng)過發(fā)酵相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)均降低，其中對照組中的未分類的魏斯氏菌由19.4%降至1.7%，耐久腸球菌和類腸膜魏斯氏菌分別降至5.7%和2.3%。在芽孢桿菌組中，未分類的魏斯氏菌和耐久腸球菌和類腸膜魏斯氏菌分別降至14.3%和1.8%；類腸膜魏斯氏菌相對含量略有升高。魏斯氏菌是參與食品發(fā)酵的重要微生物，發(fā)酵過程產(chǎn)生乳酸、短鏈脂肪酸和低聚糖等，增加食品風(fēng)味[18,19]。發(fā)酵后的豆粕中，乳桿菌屬的鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、橋乳桿菌(L.pontis)和發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum)的相對含量升高，成為發(fā)酵豆粕的優(yōu)勢菌。W7中的主要乳酸菌為嗜酸乳桿菌(L.acidipiscis)，B7主要為發(fā)酵乳桿菌和鼠李糖乳桿菌。芽孢桿菌消耗易吸收的營養(yǎng)成分，不利于生長緩慢的嗜酸乳桿菌增殖[20]，可能是導(dǎo)致其中嗜酸乳桿菌含量降低的重要原因。B7的乳酸菌種類更為豐富，發(fā)酵乳桿菌分布較廣，是傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的優(yōu)勢微生物，能夠在寡營養(yǎng)條件下增殖[21]；橋乳桿菌是豆清發(fā)酵液中的主要微生物[22]；鼠李糖乳桿菌耐酸性強(qiáng)[23]。這些乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸，增加飼料適口性，同時(shí)降低飼料pH，抑制病原微生物生長，提高食品的質(zhì)量和營養(yǎng)，廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵、水產(chǎn)養(yǎng)殖和畜牧生產(chǎn)等方面[24,25]。

圖5 發(fā)酵飼料細(xì)菌種組成

2.4 發(fā)酵飼料中細(xì)菌差異分析

在種水平，芽孢桿菌組的發(fā)酵乳桿菌、橋乳桿菌、未分類魏斯氏菌、巴氏醋酸桿菌(Acetobacterpasteurianus)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)及類腸膜魏斯氏菌含量明顯高于對照(圖6)。乳桿菌和醋酸菌廣泛分布于發(fā)酵食品，是一類重要的工業(yè)微生物，通常存在于傳統(tǒng)發(fā)酵食品如酸奶、食醋、開菲爾和紅茶菌中，促進(jìn)功能性化合物的生成，提升產(chǎn)品風(fēng)味和質(zhì)量[26,27]。乳酸片球菌是一種乳酸菌，發(fā)酵過程產(chǎn)生乳酸，廣泛應(yīng)用于發(fā)酵飼料，其代謝產(chǎn)物能夠調(diào)節(jié)胃腸道菌群，提高動(dòng)物免疫力[28,29]。嗜酸乳桿菌、未分類葡萄球菌(unclassifiedStaphylococcus)、耐久腸球菌、肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)及未分類微小桿菌(unclassifiedExiguobacterium)在對照組含量高于芽孢桿菌組。嗜酸乳桿菌培養(yǎng)物能夠抑制腸道病原菌生長，促進(jìn)腸絨毛發(fā)育，改善腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)斷奶仔豬生長[11]。耐久腸球菌多存在于動(dòng)物腸道中，作為腸道微生物產(chǎn)生蛋白酶、纖維素酶等，參與營養(yǎng)成分的水解和吸收[30,31]。但是其中葡萄球菌屬和明串珠菌屬的某些細(xì)菌為條件致病菌，存在于飼料中，對動(dòng)物安全產(chǎn)生隱患，對養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。添加芽孢桿菌發(fā)酵則能夠降低此類條件致病菌的含量，這與王格等[17]的研究結(jié)果一致。

圖6 飼料細(xì)菌種水平分布差異分析

2.5 理化因子相關(guān)性分析

環(huán)境因子相關(guān)性分析結(jié)果可以看出：C/N和棕櫚酸對豆粕發(fā)酵細(xì)菌的影響一致(圖7)。棕櫚酸的含量與葡萄球菌屬含量呈現(xiàn)顯著性負(fù)相關(guān)，棕櫚酸含量越高，該屬細(xì)菌含量越低；此外，醋酸菌屬與棕櫚酸呈現(xiàn)正相關(guān)，高含量的棕櫚酸促進(jìn)醋酸菌的生長。棕櫚酸是一種長鏈脂肪酸，作為化感物質(zhì)，能夠調(diào)節(jié)環(huán)境菌群，前人研究發(fā)現(xiàn)棕櫚酸能夠抑制病原真菌，保持土壤中的微生物多樣性[32]。本研究發(fā)現(xiàn)棕櫚酸含量升高，有助于提高飼料中醋酸菌屬細(xì)菌的數(shù)量，抑制葡萄球菌屬細(xì)菌的數(shù)量，棕櫚酸對發(fā)酵飼料微生物群落的影響以待進(jìn)一步研究。高C/N的環(huán)境同樣促進(jìn)醋酸菌的生長，同時(shí)抑制腸桿菌屬、葡萄球菌屬和鏈球菌屬細(xì)菌的生長。因此，在豆粕發(fā)酵中，調(diào)節(jié)合適的C/N能夠抑制疑似病原菌的生長，保持飼料健康發(fā)酵。pH與亞油酸對細(xì)菌有相似的影響。pH的升高與腸桿菌屬和葡萄球菌屬呈正相關(guān)，尤其是葡萄球菌屬的含量與之顯著性相關(guān)；乳桿菌屬和醋酸菌屬與pH的升高呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，含量隨pH的降低而升高，醋酸菌屬的相關(guān)性更為顯著。乳桿菌屬和醋酸菌生長過程產(chǎn)生乳酸和醋酸等有機(jī)酸，降低豆粕pH，賦予其良好的口感[33]；同時(shí)，產(chǎn)生的有機(jī)酸抑制病原菌的生長。氣球菌屬(Aerococcus)與亞油酸含量顯著相關(guān)，樣本中亞油酸含量越高，該細(xì)菌含量越高。亞油酸是一種重要的天然活性脂肪酸，具有抗氧化，降低膽固醇，提高機(jī)體免疫力的功能，同時(shí)作為飼料添加劑應(yīng)用與養(yǎng)殖業(yè)，提高畜禽品質(zhì)[34, 35]。高含量的亞油酸促進(jìn)疑似病原菌氣球菌屬細(xì)菌的含量，因此，使用亞油酸作為飼料添加劑應(yīng)控制劑量。

圖7 環(huán)境因子與發(fā)酵飼料細(xì)菌群落相關(guān)性分析

3 結(jié)論

添加芽孢桿菌FJAT-FB1促進(jìn)豆粕發(fā)酵升溫，降低pH，提高C/N和棕櫚酸含量。4種發(fā)酵豆粕中共檢測到230種OTU類型，包含11個(gè)門，17綱，34目，63科，113屬細(xì)菌。發(fā)酵后豆粕中的細(xì)菌多樣性和豐富度增加。發(fā)酵豆粕中的主要細(xì)菌為厚壁菌門、變形菌門和放線菌門，厚壁菌門的魏斯氏菌屬和乳桿菌屬是優(yōu)勢菌。添加芽孢桿菌發(fā)酵提高乳酸菌含量，降低條件致病菌的含量。相關(guān)性分析顯示乳桿菌屬和醋酸菌屬與pH降低密切相關(guān)；化感物質(zhì)棕櫚酸與醋酸菌屬細(xì)菌呈正相關(guān)，與葡萄球菌屬細(xì)菌呈負(fù)相關(guān)。