王佳穎，鄭 宇，王振梅,2，楊冬臣，張 哲,3，張金林

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院，河北 保定 071001；2.河北興柏農(nóng)業(yè)科技有限公司，河北 石家莊050000；3.西湖大學(xué) 工學(xué)院，浙江 杭州 310024）

煙嘧磺?。∟icosulfuron）是玉米田常用的內(nèi)吸傳導(dǎo)型除草劑［1-2］，其通過抑制植物體內(nèi)乙酰乳酸合成酶的活性來阻止支鏈氨基酸合成，進而阻止細胞分裂使敏感植物停止生長最終導(dǎo)致死亡［3-4］。近年來，煙嘧磺隆及其復(fù)配制劑的大量使用導(dǎo)致殘留藥害問題增多，特別是敏感作物如小麥和十字花科蔬菜等更容易產(chǎn)生藥害［5］。

微生物降解是農(nóng)藥降解過程中極為重要的途徑［6-7］，已經(jīng)成為修復(fù)土壤中煙嘧磺隆殘留的重要手段［8］。趙浩宇等［9］分離出1 株硝基假單胞菌NSA02，將其接種到煙嘧磺隆處理過的土壤樣品中，煙嘧磺隆的降解率比未接種NSA02 的土壤高5 ～6倍。朱將偉等［10］從土壤中分離得到1 株短小芽孢桿菌ZHU-11，在96 h 內(nèi)對土壤中濃度為20 mg/kg的煙嘧磺隆降解率達97%，并在此基礎(chǔ)上研發(fā)了菌劑，該菌劑可以降低土壤中煙嘧磺隆的殘留。張哲等［11-12］將可降解煙嘧磺隆的枯草芽孢桿菌YB1 加工成顆粒劑，當(dāng)土壤中添加20 g/kg YB1 菌株顆粒劑，28 d 后可將土壤中濃度為1 mg/kg 的煙嘧磺隆降解至對小麥無明顯藥害水平。微生物固體菌劑還被應(yīng)用于水體凈化和誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病能力等方面［13-14］。

黑曲霉是一種絲狀真菌，被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)有機酸［15］、加工酶制劑［16］和進行污水處理［17］等方面。本實驗室前期利用富集培養(yǎng)技術(shù)從農(nóng)藥廠污泥中分離得到1 株可降解煙嘧磺隆的黑曲霉YF1［11］，并對其在液體環(huán)境對煙嘧磺隆的降解條件進行了優(yōu)化［18］。在此基礎(chǔ)上，本研究將YF1 加工為固體菌劑，并通過田間試驗驗證其在土壤中的實際降解效果，以期為解決環(huán)境中煙嘧磺隆殘留問題提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種與植物 黑曲霉（Aspergillus niger） YF1 菌株，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院農(nóng)藥實驗室保存。小麥（Triticum aestivumL.），品種為‘石新828’；白菜（Brassica pekinensisR.），品種為‘青麻葉’，供試種子均購于保定市農(nóng)資市場。

1.1.2 供試試劑及材料 煙嘧磺隆原藥（純度≥97.5%，山東京博農(nóng)化有限公司）；10%煙嘧磺隆油懸浮劑（廣東省佛山市盈輝作物科學(xué)有限公司）。固體發(fā)酵料：將麥麩與秸稈經(jīng)粉碎后過80 目篩，然后按質(zhì)量比3∶7 的比例進行配置。供試土壤：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)三園實踐地未使用過煙嘧磺隆的土壤，自然風(fēng)干過篩備用（孔徑3 mm）。

1.2 方法

1.2.1 YF1 菌株固體發(fā)酵條件優(yōu)化 ①固體發(fā)酵初始pH 對活菌數(shù)的影響。分別調(diào)節(jié)固體發(fā)酵料的pH值為6、6.5、7.0、7.5 和8.0，添加蛋白胨的量為5%，接種量為13%（使YF1 菌株固體培養(yǎng)基中初始孢子量為3.7×105cfu/g），含水量為150%，在培養(yǎng)箱中35 ℃培養(yǎng)7 d，試驗重復(fù)3 次。采用血球計數(shù)板統(tǒng)計各個處理下YF1 菌株的產(chǎn)孢數(shù)，計算初始pH對YF1 菌株產(chǎn)孢量的影響，確定發(fā)酵最佳pH 值。

②固體發(fā)酵時間對活菌數(shù)的影響。根據(jù)上述結(jié)果，選擇初始pH 值為7.5 的培養(yǎng)基，按照上述方法進行接種，分別置于35 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)72、96、120、144 和168 h，試驗重復(fù)3 次，用血球計數(shù)板統(tǒng)計各個處理的產(chǎn)孢數(shù)，計算不同培養(yǎng)時間對YF1 菌株產(chǎn)孢量的影響，確定最佳固體發(fā)酵時間。

1.2.2 YF1 菌劑的加工及生物特性檢測 根據(jù)1.2.1試驗結(jié)果，采用最優(yōu)發(fā)酵條件進行YF1 固體菌劑制備。在YF1 固體發(fā)酵料中添加1%保護劑羧甲基纖維素鈉擠壓造粒，并參考農(nóng)用微生物菌劑標準對菌劑中有效活菌數(shù)、雜菌數(shù)、水分、pH 進行測定。

1.2.3 YF1 菌劑室內(nèi)降解效果測定 ①小麥對煙嘧磺隆的敏感性測定。經(jīng)拌土處理，土壤中煙嘧磺隆的含量分別為0、0.012 5、0.025、0.05、0.1 和0.2 mg/kg。 小麥種子催芽后挑選長勢相近的進行播種，每盆10粒，每個濃度重復(fù)3 次，置于人工氣候室培養(yǎng)，溫度（25±2）℃，濕度（69±2）%，14 d 后測量每個處理中小麥植株的根長、株高、鮮重和干重。采用SPSS 21.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理，計算抑制率。

②不同菌劑添加量對不同濃度煙嘧磺隆降解效果的影響。設(shè)置土壤中煙嘧磺隆濃度為0.025 mg/kg， YF1 菌 劑 添 加 量 分 別 為0、3.125、6.25、12.5 和25 g/kg；設(shè) 置 煙 嘧 磺 隆 濃 度 為0.05 mg/kg，菌 劑添加量為6.25 和12.5 g/kg；設(shè)置煙嘧磺隆濃度為 0.1 mg/kg，菌劑添加量為12.5 和25 g/kg。添加菌劑后所有處理置于人工氣候室中，分別在14、21、28、35 和42 d 時取土樣播種小麥，方法同上，試驗重復(fù)3 次。14 d 后測量株高和鮮重，計算抑制率。

1.2.4 YF1 菌劑的田間降解效果測定 在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)三園實踐地進行小區(qū)試驗，實踐地未施用過煙嘧磺隆除草劑。以小麥和白菜為供試植物，小區(qū)面積設(shè)置為0.36 m2，8 個處理：空白土壤小區(qū)，作為CK；噴施10%煙嘧磺隆油懸浮劑小區(qū)，終濃度分別為30、40 和50 mL/667 m2，記為CK+N1、CK+N2和CK+N3；空白土壤小區(qū)和噴施煙嘧磺隆小區(qū)同時撒施YF1 菌劑，菌劑施用量20 kg/667 m2， 記為CK+YF1、CK+N1+YF1、CK+N2+YF1和CK+N3+YF1， 每個小區(qū)重復(fù)3 次。30 d 后播種小麥和白菜，出苗后14 d 測量根長、株高和鮮重，并計算抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 YF1 菌株固體發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 固體發(fā)酵初始pH 對活菌數(shù)的影響 由圖1可知，YF1 的孢子數(shù)量隨著初始pH 的增加先增加后減少，當(dāng)pH 值為7.5 時，孢子數(shù)量達到最大值為5.9×109cfu/g，顯著高于其他處理（P＜0.05），因此YF1 菌株固體發(fā)酵的最適初始pH 值為7.5。

圖1 培養(yǎng)基初始pH 對YF1 菌株產(chǎn)孢量的影響Fig.1 The effect of initial pH on the spore production of YF1 strain

2.1.2 發(fā)酵時間對活菌數(shù)的影響 由圖2 可知，YF1 的孢子數(shù)量隨著發(fā)酵時間的增加先增加后減少，當(dāng)培養(yǎng)時間為144 h 時，孢子數(shù)量達到最大值為6.3×109cfu/g，顯著高于其他處理（P＜0.05），因此YF1 菌株固體菌劑發(fā)酵的最佳時間為144 h。

圖2 不同培養(yǎng)時間對YF1 菌株產(chǎn)孢量的影響Fig.2 The effect of different cultivation time on the spore production of YF1 strain

2.2 YF1 菌株菌劑加工及生物特性檢測

依據(jù)GB-20287-2006 農(nóng)用微生物菌劑的測定方法，測定YF1 菌劑中的有效活菌數(shù)及雜菌數(shù)，結(jié)果如表1 所示，符合農(nóng)用微生物菌劑的標準。

表1 YF1 菌株菌劑生物特性檢測Table 1 The biological characteristics of YF1 strain granules

2.3 YF1 菌劑室內(nèi)降解效果

2.3.1 小麥對煙嘧磺隆敏感性的測定 由試驗結(jié)果可知，煙嘧磺隆對小麥株高的IC25、IC50和IC75分別為0.025、0.05 和0.1 mg/kg 干土。 小麥株高和土壤中煙嘧磺隆濃度之間成線性關(guān)系，方程為Y= 2.784X+ 3.590，相關(guān)系數(shù)R2 = 0.979。小麥鮮重與土壤中煙嘧磺隆濃度之間成線性關(guān)系，方程為Y= 2.422X+ 2.024，相關(guān)系數(shù)R2 = 0.944。故選擇以小麥的株高和鮮重為后續(xù)室內(nèi)試驗的主要測量指標。

2.3.2 不同菌劑添加量對不同濃度煙嘧磺隆降解效果的影響 不同量YF1 菌劑對不同濃度煙嘧磺隆在小麥上產(chǎn)生的藥害均有一定緩解作用，不同濃度下主要有代表性的結(jié)果如圖3 所示，施用YF1 菌劑14、21、28、35 和42 d 后，隨著菌劑添加量的增加，各處理對小麥株高和鮮重的抑制率均顯著低于不添加菌劑組（P＜0.05）。當(dāng)土壤中煙嘧磺隆濃度為0.025 mg/kg，添加菌劑 12.5 g/kg 處理35 d 后能將煙嘧磺隆對小麥株高和鮮重的抑制率分別由33.95%和17.51%降低至0.79%和-4.7%；當(dāng)煙嘧磺隆濃度 為0.05 mg/kg 時，添 加 菌 劑12.5 g/kg 處 理35 d后能將煙嘧磺隆對小麥株高和鮮重的抑制率分別由45.23%和34.17%降低至1.55%和-13.87%；當(dāng)煙嘧磺隆濃度為0.1 mg/kg 時，添加菌劑25 g/kg 處理42 d 后能將煙嘧磺隆對小麥株高和鮮重的的抑制率由50.77%和41.16%降低至-8.47%和-10.55%。

圖3 室內(nèi)盆栽試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果（抑制率 %）Fig. 3 The statistical results of indoor experiment data（inhibition rate/ %）

2.4 YF1 菌劑田間降解效果

由表2 可知，CK+YF1 處理對2 種作物的各項生理指標的抑制率均為負值，即添加菌劑后對作物安全。CK+N1+YF1、CK+N2+YF1 和CK+N3+YF1處理對小麥的株高和鮮重及白菜株高的抑制率均顯著低于CK+N1、CK+N2和CK+N3處理（P＜0.05）；CK+N1+YF1 處理對小麥和白菜的根長的抑制率均顯著低于CK+N1處理。其中CK+N2+YF1 處理對白菜株高的緩解效果最明顯，可將煙嘧磺隆對白菜株高的抑制率由64.34%降低至27.66%。CK+N3+YF1處理對小麥株高的緩解效果最明顯，可將煙嘧磺隆對小麥株高的抑制率由38.39%降低至-5.45%。說明YF1 菌劑可以較好的緩解煙嘧磺隆對小麥和白菜各項生理指標造成的抑制作用。

表2 田間小區(qū)試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果（抑制率 %）Table 2 The statistical results of field experiment data（inhibition rate %）

3 討論與結(jié)論

不同菌株由于其生理特征不同，因此其最適培養(yǎng)條件也會出現(xiàn)差異。本實驗中得出的YF1 固體菌劑的最佳發(fā)酵條件：初始pH 為7.5，培養(yǎng)時間為144 h。馬永強等［19］對具有除草活性的生防菌株GD-9 進行固體發(fā)酵條件的優(yōu)化，篩選出最適初始pH 為7.6，最適培養(yǎng)時間為147.8 h。鄭露華等［20］對尖孢鐮刀菌LD105 進行固體發(fā)酵條件優(yōu)化，篩選出最適初始pH 為6，最適培養(yǎng)時間為120 h。馬曉亮［21］對煙嘧磺隆降解菌粘質(zhì)沙雷氏菌N80 進行固體發(fā)酵條件優(yōu)化，篩選出最適培養(yǎng)時間為24 h。目前尚未見到文獻報道煙嘧磺隆降解菌固體發(fā)酵條件中對初始pH 的優(yōu)化，因此，本試驗研究結(jié)果可為其他降解菌固體發(fā)酵條件的優(yōu)化提供一定的參考。

本試驗室內(nèi)盆栽試驗結(jié)果表明，YF1 菌劑可緩解小麥所受煙嘧磺隆的藥害，隨著土壤中煙嘧磺隆濃度的增加，YF1 菌株菌劑的用量及降解時間也隨之增加，當(dāng)煙嘧磺隆的濃度為0.1 mg/kg 時，添加菌劑25 g/kg，降解時間需42 d 才能將煙嘧磺隆對小麥株高的藥害完全緩解。田間小區(qū)試驗結(jié)果表明，YF1 菌劑均可減輕小麥和白菜所受不同濃度煙嘧磺隆的藥害，其中對小麥藥害緩解的效果更明顯，當(dāng)施藥量為40 和50 mL/667 m2時，添加菌劑后均可使煙嘧磺隆對小麥株高的藥害完全緩解。譚佳麗［22］研究表明，將腸桿菌TYM-1 接種到煙嘧磺隆濃度為1 mg/kg 的土壤中進行室內(nèi)盆栽試驗，28 d 后煙嘧磺隆的降解率為84%。馬曉亮等［23］研究表明，添加粘質(zhì)沙雷氏菌N80 可以促進土壤中濃度為10 mg/kg 煙嘧磺隆的降解，30 d 后降解率為79.7%，用甜菜、小白菜和菠菜作為指示植物進行室內(nèi)盆栽試驗，添加降解菌N80 的處理提高了指示植物的出苗率。上述試驗結(jié)果都是在室內(nèi)進行的，田間實際應(yīng)用的效果還有待進一步驗證，所以具有一定的局限性。本研究將YF1 菌劑添加到煙嘧磺隆濃度為0.05 mg/kg的土壤中，28 d 后播種小麥進行室內(nèi)盆栽試驗，可將煙嘧磺隆對小麥株高的藥害降低至無明顯藥害水平，在此基礎(chǔ)上進行了田間小區(qū)試驗，并且具有較好的降解效果，田間試驗設(shè)計的10%煙嘧磺隆油懸浮劑的濃度范圍為30 ～50 mL/667 m2，符合生產(chǎn)中的實際用量。

本研究將可降解煙嘧磺隆的黑曲霉YF1 加工為固體菌劑，通過敏感植物生長指示的方法來反應(yīng)施用菌劑后對煙嘧磺隆的降解效果，結(jié)果顯示YF1 菌劑在室內(nèi)和田間小區(qū)均可以緩解煙嘧磺隆對敏感植物的藥害，表明YFI 菌劑對土壤中煙嘧磺隆有較好的降解作用。前期研究報道的均為細菌菌劑應(yīng)用于土壤中煙嘧磺隆的降解［9-12,21-23］，而YF1 是真菌菌劑，本研究豐富了煙嘧磺隆降解菌劑的資源，在緩解煙嘧磺隆藥害方面具有重要研究意義。