劉文豪 田琴 余渝 王旭文 馬麒 司愛(ài)君 孔憲輝

摘要：環(huán)狀核苷酸門控通道（CNGC）基因家族是非選擇性陽(yáng)離子通道基因家族之一，在與植物發(fā)育和環(huán)境脅迫等有關(guān)的生理生化過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，但是目前尚無(wú)陸地棉CNGC基因家族的全基因組鑒定和分析?；谝阎臄M南芥CNGC基因家族成員序列信息，以生物信息學(xué)方法分析陸地棉基因組中CNGC家族成員的理化性質(zhì)、系統(tǒng)發(fā)育、染色體定位和差異表達(dá)情況。結(jié)果表明，共鑒定出33個(gè)GhCNGC基因，它們不均勻地分布在A、D染色體亞組上，其中15個(gè)基因分布在A染色體亞組上，18個(gè)基因分布在D染色體亞組上。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，GhCNGC基因家族被分為4個(gè)主要組，由于在進(jìn)化過(guò)程中不均等地?cái)U(kuò)增，Ⅳ組又分為Ⅳa和Ⅳb組。同組陸地棉、擬南芥的CNGC基因顯示出相似的保守基序和基因結(jié)構(gòu)，尤其是同源性越近，相似度越高。GhCNGC基因的表達(dá)譜以組織特異性模式表達(dá)，多數(shù)基因在根、葉中的表達(dá)量較高。研究結(jié)果使人們?cè)黾恿藢?duì)陸地棉和其他植物中CNGC基因家族的了解。

關(guān)鍵詞：CNGC;基因家族;全基因組;陸地棉;染色體定位;差異表達(dá)

中圖分類號(hào)：S562.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）24-0049-07

收稿日期：2021-05-10

基金項(xiàng)目：新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)科技攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)：2016AC027）;新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)重點(diǎn)領(lǐng)域創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃（編號(hào)：2017CB011）。

作者簡(jiǎn)介：劉文豪（1992—），男，安徽界首人，碩士，助理研究員，主要從事棉花分子育種研究。E-mail：whylwh2016@163.com。

通信作者：孔憲輝，碩士，研究員，主要從事棉花育種研究。E-mail：xjkxh920@163.com。

植物中的Ca2+通過(guò)鈣離子傳導(dǎo)通道進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是一種重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有助于植物生長(zhǎng)發(fā)育、病原體防御及植物對(duì)激素、光和鹽脅迫的反應(yīng)[1]。環(huán)狀核苷酸門控通道（CNGC）是可滲透Ca2+的陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道，調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)并應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫。CNGC位于細(xì)胞質(zhì)膜或核膜，由Ca2+/鈣調(diào)蛋白（CaM）和環(huán)狀單磷酸核苷酸（cNMPs）等二級(jí)信使從細(xì)胞內(nèi)部控制[2]。在植物中，CNGC由6個(gè)跨膜（TM）域和介于第5、第6個(gè)TM域之間的1個(gè)孔區(qū)域組成。環(huán)狀核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CNBD）是一個(gè)高度保守的區(qū)域，并有1個(gè)磷酸鹽結(jié)合盒（PBC）和1個(gè)鉸鏈區(qū)。CNGC通過(guò)直接結(jié)合環(huán)狀核苷酸而被激活，當(dāng)鈣調(diào)蛋白（CaM）結(jié)合到CaM結(jié)合域時(shí)會(huì)被抑制[3]。目前，生物信息學(xué)工具已在水稻[4]、玉米[5]、擬南芥[6]、甘藍(lán)[7]、白菜[8]、番茄[9]中用于識(shí)別CNGC基因家族成員。

之前的研究發(fā)現(xiàn)，CNGC是植物發(fā)育的關(guān)鍵組成部分。目前，大多數(shù)CNGC已通過(guò)遺傳學(xué)方法得到表征，并且它們已顯示出與植物生理、分子功能有關(guān)的重要作用，例如信號(hào)通路、植物發(fā)育和對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)中涉及的多個(gè)生理過(guò)程。擬南芥環(huán)核苷酸門控通道2（AtCNGC2）參與擬南芥表皮細(xì)胞中茉莉酸（JA）誘導(dǎo)的質(zhì)外體Ca2+流入[10]，AtCNGC4可滲透K+、Na+，并被環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）、環(huán)磷酸腺苷（cAMP）激活[11]，AtCNGC7、AtCNGC8基因?qū)π坌陨沉Φ淖饔弥陵P(guān)重要[12]，AtCNGC16、AtCNGC18基因可參與花粉發(fā)育[13]，AtCNGC6、AtCNGC19、AtCNGC20基因參與了非生物脅迫反應(yīng)[14]。

近年來(lái)，人們對(duì)植物中的CNGC基因家族進(jìn)行了研究，然而，關(guān)于陸地棉（Gossypium hirsutum Linn.）CNGC（GhCNGC）基因家族的系統(tǒng)鑒定、起源和功能的研究卻很少。本研究利用陸地棉全基因組序列信息、擬南芥CNGC家族的研究信息及綜合生物信息學(xué)分析技術(shù)對(duì)陸地棉中CNGC進(jìn)行全基因組鑒定來(lái)完成每個(gè)CNGC基因家族成員的深入分析，包括對(duì)編碼蛋白的生理、生化特性分析。此外，本研究還分析了CNGC家族成員的表達(dá)方式，以闡明其對(duì)生物、非生物脅迫響應(yīng)的機(jī)制，并鑒定出可能對(duì)育種有用的新基因。

1 材料與方法

1.1 陸地棉CNGC基因家族成員的篩選鑒定

陸地棉TM-1的基因組數(shù)據(jù)來(lái)自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)Cotton Research Institute網(wǎng)站 （http：//mascotton.njau.edu.cn/），試驗(yàn)時(shí)間為2020年8月，試驗(yàn)地點(diǎn)為新疆維吾爾自治區(qū)石河子市新疆農(nóng)墾科學(xué)院棉花研究所。以擬南芥CNGC基因家族成員的身份標(biāo)志（ID）為探針在陸地棉TM-1基因組注釋文件中查找陸地棉CNGC家族ID，用虛擬機(jī)Bio-Linux 80運(yùn)行HMM-Search搜索結(jié)構(gòu)域，并提取目標(biāo)基因序列。

1.2 陸地棉CNGC基因家族的理化性質(zhì)分析

通過(guò)ExPASY-ProtParam在線網(wǎng)站（https：//web.expasy.org/protparam）對(duì)陸地棉CNGC蛋白家族氨基酸序列的分子式、總原子數(shù)、親水性平均值、分子質(zhì)量、蛋白不穩(wěn)定系數(shù)等進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。通過(guò)SOPMA在線網(wǎng)站（https：//npsa-prabi.ibcp.fr）分析陸地棉CNGC蛋白家族的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.3 陸地棉CNGC基因家族進(jìn)化樹的構(gòu)建

將陸地棉、擬南芥的CNGC蛋白序列以fasta格式保存在1個(gè)文件中，用默認(rèn)參數(shù)運(yùn)行MEGA 7.0軟件的ClustalW命令，進(jìn)行序列對(duì)齊，采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育重建，以自舉法（bootstrap method）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育計(jì)算，引導(dǎo)復(fù)制次數(shù)為1 000次，輸出格式為Newick，通過(guò)Evolview在線網(wǎng)站（https：//www.evolgenius.info/evolview/）進(jìn)行進(jìn)化樹的編輯。

1.4 陸地棉CNGC基因家族染色體的定位及結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)陸地棉基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中CNGC基因家族成員在染色體上的區(qū)域分布和染色體長(zhǎng)度，通過(guò)Map Gene 2 Chrom在線網(wǎng)站（http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/）繪制染色體分布圖。通過(guò)MEME在線網(wǎng)站（http：//meme-suite.org/）進(jìn)行motif分析，搜索得到motif的總數(shù)為10個(gè)。用本地軟件TBtools將CNGC基因家族進(jìn)化樹、MEME分析圖和基因結(jié)構(gòu)圖進(jìn)行合并分析。

1.5 陸地棉CNGC基因家族的差異表達(dá)分析

從美國(guó)國(guó)家生物信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載TM-1標(biāo)準(zhǔn)系陸地棉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)包PRJNA248163，以FPKM值作為參數(shù)，將FPKM值低于8的分為一組，高于8的分為另一組。用TB-tools軟件進(jìn)行基因表達(dá)圖譜的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 陸地棉CNGC基因家族的鑒定分析

以已知的20個(gè)擬南芥CNGC基因家族成員的蛋白序列作為參考序列，在陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系TM-1全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)篩選，最終獲得33個(gè)環(huán)狀核苷酸門控通道（CNGC）基因家族成員。由表1可以看出，陸地棉環(huán)狀核苷酸門控通道基因家族成員基因編碼區(qū)（CDS）序列全長(zhǎng)為942～3 174 bp，編碼氨基酸313～1 057個(gè)，脂肪指數(shù)為77.03～102.46，平均親水性為-0.673～0.097，都屬于親水性蛋白;氨基酸殘基分子量為36.54～121.04 ku，理論等電點(diǎn)為689～9.59。

2.2 陸地棉CNGC基因家族的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及蛋白的穩(wěn)定性分析

由表2可以看出，陸地棉CNGC基因家族成員的二級(jí)結(jié)構(gòu)均由α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)卷曲4種結(jié)構(gòu)組成，并且α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲是主要組成部分，所占比例最大。延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角包含的氨基酸殘基數(shù)少，在二級(jí)結(jié)構(gòu)中所占比例較小。根據(jù)蛋白不穩(wěn)定指數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該家族成員的蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為39.11～57.22，僅GhCNGC29為穩(wěn)定蛋白（穩(wěn)定指數(shù)<40），其余的32個(gè)家族成員均為不穩(wěn)定蛋白。

2.3 擬南芥與陸地棉CNGC基因家族的系統(tǒng)發(fā)育分析

本研究從陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系TM-1基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選得到33個(gè)GhCNGC基因，根據(jù)這些基因在染色體上的分布情況，將這些基因命名為GhCNGC1～GhCNGC33。依據(jù)擬南芥AtCNGC基因家族的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，將GhCNGC基因家族的33個(gè)成員與AtCNGC基因家族的20個(gè)成員的蛋白序列構(gòu)建成系統(tǒng)進(jìn)化樹。由圖1可以看出，GhCNGC基因家族成員的聚類情況與擬南芥相似，分為4個(gè)組群，分別為Group I、Group Ⅱ、Group Ⅲ、Group Ⅳ，其中Group Ⅳ又分為Group Ⅳ a和Group Ⅳ b。Group I含有13個(gè)成員，包括7個(gè)GhCNGC（GhCNGC1、GhCNGC2、GhCNGC3、GhCNGC4、GhCNGC19、GhCNGC20、GhCNGC21）和6個(gè)AtCNGC（AtCNGC1、AtCNGC3、AtCNGC10、AtCNGC11、AtCNGC12、AtCNGC13）;Group Ⅱ含有6個(gè)GhCNGC（GhCNGC13、GhCNGC14、GhCNGC15、GhCNGC16、GhCNGC17、GhCNGC18）和5個(gè)AtCNGC（AtCNGC5、AtCNGC6、AtCNGC7、AtCNGC8、AtCNGC9）;Group Ⅲ含有10個(gè)GhCNGC （GhCNGC22、GhCNGC23、GhCNGC24、GhCNGC25、GhCNGC26、GhCNGC27、GhCNGC28、 GhCNGC29、 GhCNGC30、GhCNGC31）和5個(gè)AtCNGC（AtCNGC14、AtCNGC15、AtCNGC16、AtCNGC17、AtCNGC18）;Group Ⅳa含有2個(gè)GhCNGC（GhCNGC32、GhCNGC33）和2個(gè)AtCNGC（AtCNGC19、AtCNGC20）;Group Ⅳb含有8個(gè)GhCNGC（GhCNGC5、GhCNGC6、GhCNGC7、GhCNGC8、GhCNGC9、GhCNGC10、GhCNGC11、GhCNGC12）和2個(gè)AtCNGC（AtCNGC2、AtCNGC4）。

2.4 陸地棉CNGC家族成員的染色體定位

根據(jù)陸地棉標(biāo)準(zhǔn)系TM-1的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)資源，通過(guò)網(wǎng)站MapGene2Chrom進(jìn)行在線GhCNGC家族成員的染色體定位分析[15]。將GhCNGC家族的33個(gè)成員定位在19條染色體上，并繪制該家族的基因圖譜。結(jié)果（圖2）顯示，分布在D基因組亞組的基因最多，有18個(gè)，而這18個(gè)基因主要分布在染色體的兩端，分布在上端的基因比分布在下端的基因多，分布在中間部位的基因僅有3個(gè)。分布在A基因組亞組的基因相對(duì)較少，有15個(gè)，這15個(gè)基因依然主要分布在染色體的兩端。分布在D04、D05、D09和A05染色體上的基因最多，分別為3、3、3、6個(gè)，而其他染色體上僅分布1～2個(gè)該家族基因成員。

2.5 陸地棉CNGC的系統(tǒng)進(jìn)化和基因結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)MEME在線網(wǎng)站[16]及TB-tools軟件[17]分析GhCNGC家族成員的保守基序、內(nèi)含子和外顯子的數(shù)量及分布。由圖3可以看出，同一亞家族成員分布在同一進(jìn)化分支上，與圖1中的進(jìn)化分析結(jié)果相同。分析motif的數(shù)量及位置發(fā)現(xiàn)，同一組成員的motif數(shù)量基本相同，且分布的位置較接近，在不同組之間存在差異。該家族33個(gè)成員中的24個(gè)成員均含有10個(gè)motif，8個(gè)成員的motif數(shù)量為9個(gè)，1個(gè)成員的motif數(shù)量為5個(gè)。而motif數(shù)量為9個(gè)的成員大多分布在Ⅳ組，可能由于Ⅳ組與其他3組的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。有趣的是，Ⅱ組中的GhCNGC16僅有5個(gè)motif基序。從在內(nèi)含子與外顯子的分布情況看出，多數(shù)同一組成員的內(nèi)含子及外顯子數(shù)量較為接近，I組7個(gè)成員外顯子數(shù)為6～8個(gè);Ⅱ組6個(gè)成員的外顯子數(shù)量為3～7個(gè)，除GhCNGC之外，均為7個(gè)外顯子;Ⅲ組的外顯子數(shù)量為5～11個(gè);Ⅳ組的外顯子數(shù)量為7～13個(gè)， 但是Ⅳ a的2個(gè)成員的外顯子數(shù)量分別為12、13個(gè)，Ⅳ b的成員中，5個(gè)外顯子數(shù)量為7個(gè)，3個(gè)外顯子數(shù)量為8個(gè)。而且同一組成員的外顯子、內(nèi)含子分布情況類似，差異顯著性小，表明了進(jìn)化的保守性。不同組之間的差異較為顯著，尤其是Ⅳ組的成員之間及其與其他組相比較差異較大。

2.6 陸地棉CNGC家族成員表達(dá)分析

從NCBI網(wǎng)站下載陸地棉TM-1的PRJNA248163數(shù)據(jù)資源，分析GhCNGC家族基因的表達(dá)模式，選取根、莖、葉、雄蕊、雌蕊、花托、花萼和花瓣等8個(gè)組織進(jìn)行預(yù)測(cè)。圖4-a中16個(gè)基因的表達(dá)量較低，圖4-b中17個(gè)基因的表達(dá)量較高。不同GhCNGC家族基因在不同組織中的表達(dá)量存在差異，GhCNGC10在莖、花托中的表達(dá)量高，GhCNGC11在根、葉、花托中的表達(dá)量高，GhCNGC17在莖中的表達(dá)量高，GhCNGC26在雄蕊中的表達(dá)量高，GhCNGC29在花萼中的表達(dá)量高，GhCNGC27在雌蕊中的表達(dá)量高。GhCNGC2、GhCNGC11、GhCNGC15、GhCNGC17、GhCNGC26和GhCNGC30在根中的表達(dá)量相對(duì)較高。由此可見，GhCNGC10、GhCNGC11、GhCNGC27、GhCNGC29可能參與陸地棉的生殖過(guò)程，GhCNGC17、GhCNGC2、GhCNGC15可能參與到陸地棉的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)程，而GhCNGC10、GhCNGC11、GhCNGC17、GhCNGC29等基因在多個(gè)組織中的表達(dá)量均較高，可能這些基因具有一因多效的特點(diǎn)。

3 討論

環(huán)核苷酸門控通道是配體門控、鈣離子滲透的二價(jià)陽(yáng)離子選擇性通道，在非生物脅迫信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中具有重要的生物學(xué)功能。本研究基于電生理和異源表達(dá)分析，用正向遺傳方法明確了擬南芥中的AtCNGC2、AtCNGC4、AtCNGC11和AtCNGC12參與了植物免疫過(guò)程[18]。據(jù)報(bào)道，其生物學(xué)作用在防御反應(yīng)、發(fā)育和離子體內(nèi)平衡方面具有重要作用。目前，棗樹[19]、水稻[20]、梨[2]、煙草[21]、小麥[22]等植物的CNGC蛋白均有相應(yīng)研究。雖然CNGC在植物生存及對(duì)環(huán)境的脅迫響應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，但人們對(duì)陸地棉中CNGC家族所扮演的角色和功能知之甚少。陸地棉是全球重要的經(jīng)濟(jì)作物，本研究在陸地棉TM-1全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)[23]中篩選鑒定獲得33個(gè)GhCNGC蛋白。通過(guò)分析確定33個(gè)GhCNGC蛋白的生理生化特征，陸地棉環(huán)狀核苷酸門控通道基因家族成員CDS序列全長(zhǎng)為942～3 174 bp，編碼的氨基酸數(shù)量為313～1 057個(gè)。脂肪指數(shù)為77.03～102.46，平均親水性為-0.673～0.097，都屬于親水性蛋白。理論等電點(diǎn)為6.89～9.59，且等電點(diǎn)、蛋白質(zhì)電荷對(duì)于溶解度，亞細(xì)胞定位和相互作用非常重要，這取決于直系同源物之間的插入和缺失及有機(jī)體的生態(tài)[24]。根據(jù)蛋白不穩(wěn)定指數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，該家族成員的蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為39.11～57.22，僅GhCNGC29為穩(wěn)定蛋白（穩(wěn)定指數(shù)<40），其余32個(gè)家族成員均為不穩(wěn)定蛋白。陸地棉是四倍體，具有A、D 2個(gè)亞基因組，染色體定位分析發(fā)現(xiàn)，這33個(gè)GhCNGC蛋白有15個(gè)存在于A亞基因組上，18個(gè)存在于D亞基因組上。由系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果可知，GhCNGC家族成員分為I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ等4個(gè)組，第Ⅳ組又分為Ⅳ a、Ⅳ b 2個(gè)亞組，與擬南芥CNGC家族分類相似[25]。這些數(shù)據(jù)表明，基因在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了分離。不同分組中包含的家族成員數(shù)量不同，可能由于在基因家族進(jìn)化過(guò)程中，基因復(fù)制、基因丟失扮演著重要角色，從而創(chuàng)造新的基因和不同的功能[26]，以優(yōu)化植物的適應(yīng)性。分析基因差異表達(dá)圖譜發(fā)現(xiàn)，GhCNGC10、GhCNGC11、GhCNGC27、GhCNGC29在花托、花萼、雌蕊中表現(xiàn)出差異表達(dá)，表明它們可能參與到陸地棉的生殖過(guò)程中。而GhCNGC10、GhCNGC11、GhCNGC17、GhCNGC29等基因在多個(gè)組織中均有較高表達(dá)量，可能由于這些基因參與了多個(gè)代謝通路。

本研究以生物信息學(xué)和比較基因組學(xué)方法，分析了關(guān)于結(jié)構(gòu)域，外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)以及系統(tǒng)進(jìn)化樹和表達(dá)分析的全面信息。已知植物CNGC對(duì)多種非生物刺激起著關(guān)鍵作用，包括冷脅迫、鹽脅迫、激素應(yīng)答、發(fā)育和光信號(hào)傳導(dǎo)等[27]，這些信息可以用于分析蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，可為改善陸地棉的抗逆性、分子育種、纖維品質(zhì)等提供重要參考。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究通過(guò)生物信息學(xué)手段從陸地棉基因組中全面鑒定出33個(gè)CNGC基因，分別位于A、D亞基因組中的CNGC家族中，分別有15、18個(gè)成員。本研究還分析了系統(tǒng)發(fā)育、保守基序和外顯子等，以轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)分析了該家族成員在不同組織中的差異性表達(dá)?？傮w來(lái)看，對(duì)陸地棉基因組中GhCNGC基因家族的分析對(duì)植物CNGC功能研究提供了綜合概述，并為進(jìn)一步闡明GhCNGC基因家族基因間相互作用的機(jī)制提供了前景。

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