徐偉，盛偉松，董娜，薛娟，朱丹榮，錢娟

南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，江蘇南京 210011

腸道是人體質(zhì)量要的免疫器官，腸道菌群對免疫系統(tǒng)具有重要影響，種類繁多的菌群對機體來說也是豐富的非自身性抗原，一方面機體對腸道菌群有互利共生作用，另一方面機體存在免疫防御機制，防止腸道菌群感染機體。同時腸道菌群可刺激增加樹突狀細胞的耐受性，通過相互作用，介導(dǎo)并促進T細胞向Th1分化[1-2]。有研究顯示，梭狀芽孢桿菌和脆弱擬桿菌能夠刺激調(diào)節(jié)性T細胞分泌IL-10，還可抑制IL-17的分泌，同時還可直接降低免疫球蛋白IgE的分泌[3]。目前，幼兒哮喘發(fā)病機制尚未完全明確，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為與細胞因子、免疫功能密切相關(guān)。有臨床研究提示，兒童腸道菌群的變化與哮喘有關(guān)，不同種類腸道菌群可能通過影響免疫功能促進或抑制哮喘發(fā)生[4-6]。國內(nèi)少有學(xué)者對患兒腸道菌群情況與哮喘進行相關(guān)性研究。本研究觀察了3歲以下哮喘患兒糞便腸道菌群變化，并分析其對外周血輔助T細胞及血清炎癥因子的影響，旨在為哮喘患兒的臨床診治提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018年1—12月南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院收治的3歲以下哮喘患兒50例[觀察組，其中發(fā)作期患兒(出現(xiàn)氣促、胸悶等臨床表現(xiàn)，肺功能檢查提示第一秒呼氣量及呼氣峰流速明顯降低，少數(shù)患兒伴有嚴(yán)重低氧血癥)21例，緩解期患兒(無氣促、胸悶等臨床表現(xiàn)，肺功能檢查提示第一秒呼氣量及呼氣峰流速≥80%正常值，持續(xù)時間>4周)29例]，男29例，女21例；年齡(23.73±3.48)個月；喂養(yǎng)方式為純母乳23例，純奶粉13例，混合喂養(yǎng)14例；體質(zhì)量(13.18±3.20)kg；生產(chǎn)方式為剖宮產(chǎn)23例，順產(chǎn)27例。另選同期健康體檢兒童50例(對照組)，男30例，女20例；年齡(23.19±4.82)個月；喂養(yǎng)方式為純母乳24例，純奶粉11例，混合喂養(yǎng)15例；體質(zhì)量(13.28±2.86)kg；生產(chǎn)方式為剖宮產(chǎn)21例，順產(chǎn)29例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①觀察組患兒診斷符合兒童哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；②年齡<3歲；③生長發(fā)育健康；④對照組為兒童保健評估為健康的3歲以下患兒。排除標(biāo)準(zhǔn)：①近1個月內(nèi)服用抗生素或腸道菌群制劑者；②應(yīng)用激素類、免疫抑制劑等藥物者；③合并有其他系統(tǒng)過敏性疾病者；④近1個月內(nèi)非哮喘疾病引起胸悶、咳嗽等疾病者；⑤無法配合研究的患兒；⑥對照組幼兒在研究期間診斷過敏性疾病者；⑦合并嚴(yán)重肝腎疾病者。本研究已經(jīng)通過我院倫理委員會批準(zhǔn)，所有入組幼兒均由監(jiān)護人簽署知情同意書。兩組一般資料無統(tǒng)計學(xué)差異，具有可比性。

1.2 糞便腸道菌群檢測 收集糞便標(biāo)本于無菌干燥瓶內(nèi)，取1 g大便標(biāo)本，加入9 mL磷酸緩沖鹽溶液，搖蕩至少5 min充分混勻，在離心機中以1 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，提取上清液，重復(fù)操作3次，在離心機中以9 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心3 min，待沉淀后以磷酸緩沖鹽溶液清洗4次，加入0.1 mL蒸餾水至懸浮，加入1%TritonX-100使細菌壁破碎，釋放出DNA，持續(xù)煮沸5 min，放入冰水中冷卻。選取熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試劑盒進行檢測，引物由重慶澤恒生物技術(shù)有限公司合成，大腸桿菌：上游序列5′-GATACTGGCTAAGTACGAGCTC-3′，下游序列5′-CAGTTTGCAGGAGTCGCACT-3′,共擴增200 bp。雙歧桿菌：上游序列5′-CGTGATGCCTGACTGGAGTA-3′，下游序列5′-CTGATGCCGACTTAGCGTCGCA-3′，共擴增95 bp。PCR反應(yīng)條件：100 ℃、45 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40個循環(huán)；72 ℃、10 min。采用2-ΔΔCt的計算方法算出目的基因相對表達量，并計算雙歧桿菌與大腸桿菌的比值(B/E)。

1.3 外周血輔助T細胞檢測 ①Th1、Th2：選擇100 μL的全血標(biāo)本，以1∶1比例用RPMI1640進行稀釋，添加10 μL刺激劑，在5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)后混勻，添加CD3-PC5及CD8-PC7各10 μL，在室溫條件下，避光孵育15 min；添加固定液100 μL；在室溫條件下，避光孵育15 min；添加3 mL的磷酸緩沖鹽溶液，以1 200 r/min離心5 min，棄上清液。管中添加100 μL破膜和溶血液，同時管中加入10 μL的IL-4-PE以及IFN-γ-FITC，在室溫條件下，避光孵育15 min。各個管中添加3 mL磷酸緩沖鹽溶液，在以1 200 r/min的速度離心5 min，棄上清液，0.5 mL磷酸緩沖鹽溶液重懸細胞，在機上進行檢測，每次對每個樣本檢測10 000個細胞。②Treg：取100 μL的全血標(biāo)本，添加CD4-FITC及CD25-PE刺激劑10 μL，在4 ℃下避光孵育30 min，添加1 mL氯化銨紅細胞裂解液裂解10 min，以磷酸緩沖鹽溶液洗滌3次，洗滌時轉(zhuǎn)速為1 200 r/min，時間為5 min；以1 mL Perm/Fixation緩沖液穿膜45 min，洗滌后加入鼠抗人Foxp3單克隆抗體，在4 ℃條件下避光孵育30 min。洗滌2次后以300 μL流式細胞染色緩沖液重懸，同時上FACSCanto進行檢測。應(yīng)用BDFACSDiva軟件對數(shù)據(jù)進行分析，算出細胞數(shù)中Foxp3+細胞的百分比。每次對每個樣本檢測10 000個細胞，隨后計算Th1、Th2、Treg的百分比及Th1/Th2比值。

1.4 血清炎癥檢測 取ELISA試劑盒，放至室溫，在孔內(nèi)加入樣本、標(biāo)準(zhǔn)品，對照孔不加，在37 ℃條件下孵育30 min，洗滌3次。每孔內(nèi)添加100 μL的酶標(biāo)記抗體，在37 ℃條件下孵育40 min，洗滌3次。每孔內(nèi)添加50 μL的酶底物，置于室溫條件下暗盒內(nèi)進行顯色10 min。每孔內(nèi)添加50 μL的終止液以終止反應(yīng)。選擇酶標(biāo)儀在450 nm下讀取OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后，計算IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-17、IFN-γ水平。

2 結(jié)果

2.1 兩組糞便雙歧桿菌、大腸桿菌數(shù)量及B/E比較 糞便雙歧桿菌、大腸桿菌數(shù)量及B/E比較見表1。

表1 兩組糞便雙歧桿菌、大腸桿菌數(shù)量及B/E比較

2.2 兩組外周血Th1、Th2、Th1/Th2、Treg水平比較 外周血Th1、Th2、Th1/Th2、Treg水平比較見表2。

表2 兩組外周血Th1、Th2、Th1/Th2、Treg水平比較

2.3 兩組血清IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ水平比較 血清IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ水平見表3。

表3 兩組血清IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ水平比較

2.4 觀察組患兒腸道菌群變化與免疫功能的相關(guān)性 觀察組B/E與Th1/Th2、Treg呈正相關(guān)(r=0.743、0.787，P均<0.05)，發(fā)作期B/E與Th1/Th2、Treg呈正相關(guān)(r=0.889、0.779，P均<0.05)，緩解期B/E與Th1/Th2、Treg無相關(guān)性(r=-0.248、0.156，P>0.05)。

3 討論

近年來，幼兒哮喘的發(fā)病率明顯升高，影響幼兒的生長發(fā)育。哮喘的病理特征是氣道黏膜內(nèi)大量炎性細胞的浸潤，進而合成并釋放大量的炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致患兒氣道黏膜內(nèi)炎癥發(fā)生引起哮喘[8]。目前，在臨床上多數(shù)3歲以下幼兒哮喘癥狀表現(xiàn)不明顯，往往缺乏典型癥狀表現(xiàn)，造成了一部分3歲以下幼兒在發(fā)病早期或者癥狀不典型時診斷較為困難，同時還有一些并發(fā)癥可能會影響哮喘的診治。哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，尤其是對于處在生長發(fā)育期的幼兒來說，可能會對3歲以下幼兒的生長發(fā)育產(chǎn)生不利影響。3歲以下幼兒臨床癥狀無法真實準(zhǔn)確反應(yīng)呼吸道的炎癥水平，而尋找有效的檢驗指標(biāo)反映臨床癥狀有重要意義。

腸道菌群能夠增強幼兒免疫應(yīng)答水平，能夠促進T細胞分化，同時還可以刺激免疫細胞產(chǎn)生炎癥因子，機體主要通過幾種方式對腸道內(nèi)的細菌產(chǎn)生作用；一是腸杯狀細胞的上皮表面存在粘液層，能夠組織細菌滲透；二是上皮細胞內(nèi)分泌的凝集素能夠有效限制細菌滲透；三是少數(shù)細菌能夠到達腸固有層，在到達固有層后，會被樹突狀細胞呈遞至B細胞，B細胞再分化為漿細胞進而分泌特異性IgA發(fā)揮作用。同時有研究顯示，腸道細菌能夠影響巨噬細胞等的代謝途徑，進而增強巨噬細胞的功能，促進腫瘤壞死因子-α以及IL-10的分泌[9-10]。本文結(jié)果顯示，觀察組雙歧桿菌及B/E低于對照組，觀察組發(fā)作期患兒雙歧桿菌以及B/E低于緩解期患兒，推測哮喘發(fā)生與雙歧桿菌的數(shù)量減少有關(guān)。腸道菌群在患病幼兒與健康幼兒也存在差異，在土耳其的一項以0～3歲兒童作為對象的研究中，發(fā)現(xiàn)哮喘患兒的雙歧桿菌數(shù)量明顯低于正常兒童[11]。而ZHU等[12]對小鼠腸道菌群的功能進行基因表達譜分析，結(jié)果提示小鼠腸道菌群的分布與炎癥反應(yīng)相關(guān)。

在對T細胞亞群的分析中，觀察組外周血Th1、Th1/Th2以及Treg明顯低于對照組，Th2高于對照組；觀察組發(fā)作期患兒外周血Th1、Th1/Th2以及Treg低于緩解期患兒，發(fā)作期患兒外周血Th2高于緩解期患兒。提示在哮喘兒童中存在T細胞免疫水平的異常，主要為降低Th1、Treg的水平，提高Th2水平，破壞了Th1/Th2的平衡。QIAN等[13]對早期小鼠哮喘模型進行研究顯示，發(fā)現(xiàn)早期小鼠哮喘模型存在Th1/Th2的失衡，支持本研究結(jié)果。本相關(guān)性分析顯示，觀察組及觀察組發(fā)作期患兒外周血B/E與Th1/Th2、Treg均具有相關(guān)性。說明在三歲以下哮喘患兒中，腸道菌群情況能夠影響哮喘病情和免疫功能，其機制可能為哮喘患兒中，雙歧桿菌數(shù)量降低，促進Th2細胞分泌IL-4、IL-5，抑制Th1細胞分泌IL-2、IFN-γ。劉鋼等[14]對兒童哮喘與幽門螺桿菌感染情況進行了研究，提示幽門螺桿菌感染后會致使免疫系統(tǒng)功能紊亂，促使哮喘癥狀加重，結(jié)合本研究，胃腸道是相連接的，哮喘患兒腸道內(nèi)的菌群有差異，也會導(dǎo)致患兒哮喘的發(fā)生，支持本次結(jié)果。

本研究還對相關(guān)的炎癥因子進行了研究，結(jié)果顯示觀察組血清IL-1、IL-4、IL-5水平明顯高于對照組，血清IL-2、IFN-γ水平明顯低于對照組；觀察組發(fā)作期患兒血清IL-1、IL-4、IL-5水平明顯高于緩解期患兒，血清IL-2、IFN-γ水平明顯低于緩解期患兒。分析其原因可能為IL-1是巨噬細胞產(chǎn)生，參與多個免疫反應(yīng)，能夠促進氣道內(nèi)中性粒細胞的浸潤，激發(fā)緩激肽引起的氣道高反應(yīng)，同時還會增加其他趨化因子的分泌；IL-4、IL-5是Th2分泌的，IL-4可促進IgE的分泌、肥大細胞增長，IL-5可誘導(dǎo)趨化及激活嗜酸粒細胞，結(jié)合上述結(jié)果Th2細胞數(shù)量增加，進而致使哮喘患兒IL-4、IL-5分泌增加；Th1則分泌IL-2、IFN-γ，參與介導(dǎo)細胞免疫過程，是介導(dǎo)Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)的重要炎癥因子，上述結(jié)果也提示哮喘患兒中Th1細胞水平降低，因此IL-2、IFN-γ分泌水平也相應(yīng)減少。與多個研究結(jié)果相似[15-17]。

總之，在3歲以下哮喘患兒中，腸道菌群存在雙歧桿菌水平降低，免疫功能下降，炎癥因子水平異常，調(diào)節(jié)腸道菌群可能會有助于預(yù)防治療3歲以下幼兒哮喘。