王會(huì)生，張 佩，杜逢艷，趙四正，張 明，韓慶彥

（1.禮縣畜牧獸醫(yī)站，甘肅禮縣 742200；2.商洛市疾病預(yù)防控制中心，陜西商洛 726000；3.甘肅省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，蘭州 730046）

自農(nóng)業(yè)部發(fā)布《遏制細(xì)菌耐藥性國家行動(dòng)計(jì)劃（2016—2020 年）》以來，我國規(guī)模雞場濫用抗菌藥的情況得到了明顯改善。2019 年7 月10 日，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布第194 號(hào)令，全面禁止12 種抗菌藥在飼料中的添加。2019 年1 月以來，甘肅省隴南市大部分規(guī)模雞場開展了減抗乃至禁抗行動(dòng)，濫用抗菌藥情況得到有效控制。

大腸桿菌和金黃色葡萄球菌（以下簡稱“金葡菌”）是環(huán)境中最常見的細(xì)菌，也是最常見的條件性致病菌，其耐藥情況較為嚴(yán)重。對(duì)山東省養(yǎng)殖場畜禽糞污樣品檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，分離到的3 株金葡菌均對(duì)青霉素耐藥，34 株大腸桿菌對(duì)氟苯尼考、利福平的耐藥比高于50%[1]。趙麗青等[2]對(duì)青島市城陽區(qū)動(dòng)物源性食品中大腸桿菌和金葡菌進(jìn)行了分離鑒定，并對(duì)13 種藥物開展耐藥性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)多數(shù)菌株對(duì)多種藥物出現(xiàn)不同程度的抗藥，同一菌株對(duì)不同藥物的耐藥性也不同。

為了解甘肅省隴南市規(guī)模雞場環(huán)境細(xì)菌禁抗前后對(duì)抗菌藥的敏感性變化情況，指導(dǎo)規(guī)模雞場臨床用藥，本研究擬分離、培養(yǎng)規(guī)模場雞舍環(huán)境中的這兩種細(xì)菌，并針對(duì)15 種常見抗菌藥物開展藥敏試驗(yàn)，以期為規(guī)模雞場臨床用藥選擇、細(xì)菌病防控和食品安全維護(hù)提供數(shù)據(jù)支持。

1 試驗(yàn)材料

1.1 培養(yǎng)基

牛肉膏、麥康凱瓊脂，由北京奧博星生物制品公司生產(chǎn)；營養(yǎng)瓊脂，由北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠生產(chǎn)。相關(guān)培養(yǎng)基均按常規(guī)制備，符合GB生化標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 藥敏紙片

土霉素藥敏試紙，購自上海綠盟有限公司；青霉素、慶大霉素、紅霉素、氟苯尼考、頭孢唑啉、妥布霉素、頭孢拉定、恩諾沙星、頭孢曲松、卡拉霉素、氨芐西林、頭孢氨芐、磺胺異噁唑、林可霉素等14 種藥敏試紙，均購自杭州生物制劑有限公司。上述15 種藥敏試紙均執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)WS/T125—1999，每個(gè)藥敏試紙的藥物含量均為30 μg/片。

2 試驗(yàn)方法

2.1 樣品采集

隨機(jī)選擇甘肅省隴南市2 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)5 個(gè)存欄1萬只以上的規(guī)模雞場（A 鎮(zhèn)的場1～3，B 鎮(zhèn)的場4～5），具體情況見表1。在禁抗實(shí)施前以及禁抗實(shí)施6 個(gè)月后采樣，采樣時(shí)盡量選擇禁抗時(shí)間相同的養(yǎng)殖場，如不同則選擇禁抗前后間隔時(shí)間差距在6 個(gè)月以內(nèi)的養(yǎng)殖場。采樣前用滅菌生理鹽水將滅菌棉簽浸濕，在采樣點(diǎn)充分擦拭。每個(gè)養(yǎng)殖場在墻壁、飼槽、水槽處各采集3 份樣品（共9 份），每次共采集45 份，兩次共采集90 份樣品。樣品在采集后2 h 內(nèi)檢測(cè)。

表1 規(guī)模雞場有關(guān)情況

2.2 細(xì)菌培養(yǎng)

將采集樣品分別接種肉湯培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，然后用接種環(huán)分別劃線接種麥康凱瓊脂和普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h；若菌落在普通瓊脂上生長不好，可以延長培養(yǎng)6～12 h。

2.3 細(xì)菌鑒定

2.3.1 大腸桿菌 在麥康凱培養(yǎng)基上挑選粉紅色、光滑、邊緣整齊的單個(gè)菌落，鏡檢為革蘭氏陰性桿菌后，挑選相同菌落接種葡萄糖發(fā)酵管進(jìn)行糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察是否產(chǎn)生輕微氣體、變黃；刺種三糖鐵培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀看底部是否變黃并有黑色沉淀；接種蛋白胨水，37 ℃培養(yǎng)48 h，再加入吲哚試劑，出現(xiàn)紅色。以上3 種生化試驗(yàn)均為陽性可鑒定為大腸桿菌[3-4]。

2.3.2 金葡菌 在普通瓊脂上挑選露滴狀、邊緣整齊的金黃色單個(gè)菌落，采用革蘭氏染色鏡檢，若觀察到革蘭氏陽性呈葡萄串樣者，可鑒定為金葡菌[5]。

2.4 藥敏試驗(yàn)及結(jié)果判定

按照陳學(xué)燦等[3]方法并結(jié)合全國細(xì)菌耐藥性檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，將培養(yǎng)的細(xì)菌密涂于平板培養(yǎng)基上，再用無菌眼科鑷將不含抗菌藥的濾紙片平貼于平皿中央，再將各種含不同抗菌藥的紙片平貼于周圍，蓋上皿蓋后標(biāo)明日期，置37 ℃培養(yǎng)24 h 后，取游標(biāo)卡尺讀取各種抗菌藥的抑菌數(shù)值。

抗菌藥敏試驗(yàn)的判定標(biāo)準(zhǔn)為，結(jié)合實(shí)際情況，以抑菌環(huán)的直徑來判斷藥物的敏感性，即以抑菌環(huán)直徑（指藥敏試紙邊緣的抑菌環(huán)直徑大?。?.5 mm為高度敏感（S），介于1～4.5 mm 為中等敏感（I），≤1 mm 為耐藥（R）[3，6]。

2.5 敏感性比較

計(jì)算禁抗前后大腸桿菌和金葡菌對(duì)15 種抗菌藥的敏感性差值，得出兩種細(xì)菌對(duì)15 種抗菌藥的敏感性變化情況，并予以比較。

3 結(jié)果

3.1 大腸桿菌和金葡菌檢出情況

在禁抗前，5 個(gè)規(guī)模場45 份環(huán)境樣品中均檢出大腸桿菌，占比達(dá)到100%；37 份樣品檢出金葡菌，占比82.2%。禁抗6 個(gè)月后，45 份樣品中依舊均檢出大腸桿菌，占比100%；39 份樣品檢出金葡菌，占比86.7%，占比略有上升。

3.2 藥敏試驗(yàn)

對(duì)禁抗前后檢出的大腸桿菌和金葡菌開展15種抗菌藥的藥敏試驗(yàn)。結(jié)果（表2）顯示，禁抗前后各規(guī)模雞場的大腸桿菌和金葡菌的抗菌藥耐受性各有不同，但總的來說禁抗后這兩種細(xì)菌對(duì)15 種抗菌藥的敏感性都有不同程度的提高。

具體來看，大腸桿菌禁抗前對(duì)妥布霉素、林可霉素、頭孢拉定、卡拉霉素等抗菌藥敏感，禁抗后對(duì)這幾種抗菌藥更加敏感；禁抗前對(duì)磺胺異噁唑、土霉素和頭孢唑林、青霉素等抗菌藥不敏感，禁抗后雖然敏感性有所提高，但提高幅度有限。金葡菌禁抗前對(duì)頭孢曲松、卡拉霉素、頭孢唑啉、氟苯尼考等敏感性強(qiáng)，在禁抗后對(duì)這幾種抗菌藥更加敏感；禁抗前對(duì)土霉素、磺胺異噁唑、慶大霉素、妥布霉素等敏感性差，禁抗后敏感性有所提高，但提高幅度同樣有限。

3.3 敏感性比較

通過計(jì)算禁抗前后大腸桿菌和金葡菌對(duì)15 種抗菌藥的敏感性差值，比較敏感性變化情況。結(jié)果（表3）顯示，總體上兩種細(xì)菌對(duì)大部分抗菌藥的敏感性有不同程度的增加（差值為正），但也存在對(duì)個(gè)別抗菌藥敏感性下降的情況（差值為負(fù)）。具體而言，大腸桿菌在禁抗6 個(gè)月后對(duì)抗菌藥的敏感性增幅較大，平均為8.59%。其中對(duì)卡拉霉素、頭孢拉定、慶大霉素的敏感性均增加了20%左右，而對(duì)土霉素、磺胺異噁唑等的敏感性增幅較少；對(duì)氟苯尼考的敏感性不增反降。金葡菌對(duì)15 種抗菌藥的敏感性增幅較大腸桿菌小，平均為5.95%。只有對(duì)紅霉素的敏感性增加了19.0%，其余均在10%以下，而對(duì)青霉素的敏感性不升反降。

使用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件，采用非正態(tài)分布定量資料的配對(duì)的秩和檢驗(yàn)，在檢驗(yàn)水準(zhǔn)為ɑ=0.05的水平下，Z=5.918，P＜0.05，認(rèn)為兩種細(xì)菌對(duì)抗菌藥的敏感性有顯著差別，其中大腸桿菌對(duì)抗菌藥的敏感性要強(qiáng)于金葡菌（圖1）。

表3 禁抗前后大腸桿菌和金葡菌對(duì)15 種抗菌藥的敏感性變化情況 %

表2 兩種細(xì)菌禁抗前后的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

圖1 曼-惠特尼檢驗(yàn)結(jié)果

4 討論

禁抗前，隴南市本地規(guī)模雞場多采取7 日齡前后在飲水中添加10%阿莫西林可溶性粉，15～19日齡在飼料中添加10%多西環(huán)素，雞成年后在飼料中添加替米考星、土霉素或泰樂菌素等，養(yǎng)殖過程中，還會(huì)在飼料添加四環(huán)素、新霉素等用于預(yù)防疫病；此外，雞場常使用氟苯尼考類、地米考星、泰樂菌素、紅霉素等治療呼吸道疾病，使用大觀霉素、硫酸鏈霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、磺胺類藥物等治療消化道疾病，使用青霉素、頭孢拉定、林可霉素、妥布霉素等治療感冒；在其他疾病治療中比較常見的還有強(qiáng)力霉素、氨芐西林、泰萬菌素、卡拉霉素、阿奇霉素、莫能菌素，頭孢氨芐、替米考星、兩性霉素B 等?；谏鲜銮闆r，本研究選擇常見的15 種抗菌藥開展藥敏試驗(yàn)，以探究禁抗前后雞場環(huán)境中兩種細(xì)菌對(duì)抗菌藥的敏感性變化情況。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同抗菌藥禁抗前后對(duì)于大腸桿菌和金葡菌的抑菌效果不同。全面禁抗6 個(gè)月后，大腸桿菌和金葡菌對(duì)大部分抗菌藥的敏感性有不同程度的提高。平均來看，大腸桿菌對(duì)15 種抗菌藥的敏感性提高了8.59%，金葡菌提高了5.95%，說明隨著抗菌藥的禁用，雞場環(huán)境中大腸桿菌與金葡菌的耐藥性有所減弱，其對(duì)抗菌藥的敏感性逐步恢復(fù)。但是，大腸桿菌對(duì)氟苯尼考以及金葡菌對(duì)青霉素的敏感性不升反降，推測(cè)可能因禁抗前相應(yīng)藥物使用過多，導(dǎo)致雞場環(huán)境中的耐藥菌株在短期內(nèi)無法徹底消除[7-10]，還需延長禁抗時(shí)間，進(jìn)一步觀察禁抗效果。此外，對(duì)于不同養(yǎng)殖方式（肉雞或蛋雞）、不同養(yǎng)殖年限的養(yǎng)殖場，禁抗前其抗菌藥添加的方式、劑量、種類等也不盡相同，因此還有待于深入研究，以便為規(guī)模雞場科學(xué)使用抗菌藥提供理論依據(jù)。養(yǎng)殖場也應(yīng)加強(qiáng)中草藥等方劑的利用，探索使用微生態(tài)制劑、酸制劑、植物精油等，結(jié)合生物安全等方面做好禁抗后禽病防治問題，這也是未來綠色健康養(yǎng)禽業(yè)的必由之路。