邱越樺 王海燕

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 廣州市口腔再生醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510182

富組蛋白（histatin）是一族富含組氨酸的抗菌肽，由人類(lèi)腮腺和下頜下腺的腺泡細(xì)胞分泌，是口腔局部天然防御系統(tǒng)的重要組成部分[1-3]，現(xiàn)已分離出至少12種histatins，分別命名為histatin-1～12，其中histatin-1、-3、-5是最常見(jiàn)的天然組胺素，為組胺素總量的20%～30%[4]。在histatins家族中histatin-1和histatin-3為分別由基因HIS1和HIS2編碼的全長(zhǎng)產(chǎn)物，其余成員是histatin-1和histatin-3的蛋白水解產(chǎn)物[5]。此外，富組蛋白還可存在于淚腺中[6]。

富組蛋白1（histatin-1，Hst1）是這些抗菌肽中最重要的蛋白之一，具有38個(gè)氨基酸殘基，使用β受體阻滯劑可減少其分泌[3]，具有促進(jìn)細(xì)胞黏附、伸展、遷移、血管化生、抗炎等多方面作用[5-7]，參與構(gòu)成宿主免疫防御系統(tǒng)的第一道防線，同時(shí)也與多種腫瘤性疾病密切相關(guān)。此外，富組蛋白1可負(fù)載于多種生物材料上, 具有良好的生物相容性和生物安全性[8]。近年來(lái)研究表明，Hst1具有難以估計(jì)的醫(yī)用價(jià)值和產(chǎn)業(yè)化前景，因此，了解Hst1的生物學(xué)功能和作用機(jī)制與其在臨床中應(yīng)用的相關(guān)進(jìn)展是很有必要的。

1 Hst1的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制

1.1 抗菌及抗真菌

以往研究表明[9]，Hst1在人的唾液中有高水平表達(dá)，可參與構(gòu)成天然免疫防御系統(tǒng)，對(duì)革蘭陽(yáng)性、陰性細(xì)菌、真菌均能產(chǎn)生較強(qiáng)殺傷或抑制作用。其能在細(xì)胞膜上形成孔洞，使膜內(nèi)物質(zhì)流出導(dǎo)致細(xì)胞死亡；也能作用于細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和核酸來(lái)殺死細(xì)胞，但對(duì)宿主細(xì)胞的毒性極低[10]。此外，Mireille等[8]發(fā)現(xiàn)，Hst1可以刺激宿主細(xì)胞分泌CCL20，CCL20對(duì)許多病原體，如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、化膿鏈球菌等具有直接抗菌活性，對(duì)控制創(chuàng)傷后細(xì)菌感染起重要作用[11-13]。由于Hst1具有參與獲得性膜形成及抑制羥基磷灰石沉積的作用[14]，再綜合其抗菌的特性大致可以推測(cè)，在口腔內(nèi)，Hst1對(duì)以細(xì)菌為主要致病因素的疾病，如齲病、口腔黏膜病和牙周病等的發(fā)生發(fā)展均有重要的預(yù)防作用。

1.2 促進(jìn)創(chuàng)傷愈合

Menno等[5]研究發(fā)現(xiàn)唾液中Hsts低表達(dá)的人群口腔黏膜創(chuàng)傷后的愈合延遲，且唾液中的Hst1能顯著促進(jìn)口腔黏膜上皮細(xì)胞在體外劃痕試驗(yàn)中的創(chuàng)傷愈合，由此推測(cè)Hst1在口腔黏膜創(chuàng)傷愈合過(guò)程中起重要作用,該過(guò)程的主要作用機(jī)制可能是Hst1與G蛋白偶聯(lián)受體作用后內(nèi)吞產(chǎn)生效應(yīng)。

蔣艷[9]使用體外細(xì)胞劃痕法對(duì)人表皮細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)株（HaCaT）造成機(jī)械性損傷后向其中加入Hst1發(fā)現(xiàn)，3～100 μg/ml Hst1均能夠活化HaCaT細(xì)胞并促進(jìn)其增殖與遷移。使用相似方法對(duì)人成纖維細(xì)胞株（HF）進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，Hst1具有促人成纖維細(xì)胞增殖作用，但促遷移作用較弱，具體作用機(jī)制尚不清楚，推測(cè)是Hst1的受體可能在其他部位的組織細(xì)胞上也有表達(dá)。表皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞都是參與創(chuàng)傷修復(fù)的重要細(xì)胞，Hst1對(duì)其作用為其用于皮膚創(chuàng)傷治療提供了可能性依據(jù)。

1.3 促進(jìn)細(xì)胞黏附

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，在傷口愈合過(guò)程中起主要作用的是人類(lèi)唾液中的富組蛋白，這是因?yàn)樗鼈兡艽龠M(jìn)細(xì)胞的黏附遷移[5]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Hst1在非活性的玻璃表面或鈦表面均可以顯著的促進(jìn)上皮細(xì)胞的黏附和遷移[14-15]。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Hst1多肽可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞黏附[16]、伸展、血管化生、遷移，且能誘導(dǎo)Zo-1基因表達(dá)[17]，使Zo-1和E-cad水平升高，Zo-1具有對(duì)胞間接觸與緊密連接再定位的功能，E-cad積聚可促進(jìn)胞間黏附[18]。Torres等[19]指出，Hst1是通過(guò)促進(jìn)口腔角質(zhì)形成細(xì)胞、牙齦和真皮成纖維細(xì)胞、非口腔上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞黏附和遷移來(lái)促進(jìn)再上皮化和血管生成反應(yīng)的。

1.4 對(duì)抗癌細(xì)胞

miR-21是人類(lèi)惡性腫瘤中廣泛存在的異常miRNA之一，其在不同類(lèi)型的惡性腫瘤中明顯上調(diào)，其過(guò)表達(dá)程度與癌癥患者的預(yù)后有相關(guān)關(guān)系，表達(dá)水平越高，患者的預(yù)后相對(duì)越差。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Hst1可以和miR-21結(jié)合對(duì)下游STAT3信號(hào)通路因子產(chǎn)生激活作用，進(jìn)而干擾腫瘤細(xì)胞的遷移[20]。

2 Hst1相關(guān)的臨床試驗(yàn)

2.1 對(duì)紫外線致人角膜上皮細(xì)胞光損傷的保護(hù)作用

紫外線可以誘導(dǎo)角膜發(fā)生光損傷，使細(xì)胞膜中的脂質(zhì)過(guò)氧化，還可以直接損傷DNA，降低線粒體功能，導(dǎo)致人角膜上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)證明[21]，人角膜上皮細(xì)胞（HCECS）凋亡水平與紫外線照射時(shí)間和強(qiáng)度呈現(xiàn)顯著正相關(guān)性。Huang等[22]在紫外線照射后檢測(cè)HCECS的增殖活性，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)Hst1預(yù)處理的HCECS增殖活性比未處理的HCECS更高；相比之下，照射后Hst1處理細(xì)胞中Bax表達(dá)顯著下調(diào)，說(shuō)明HST1可抑制輻射誘導(dǎo)的HCEC凋亡。這些結(jié)果提示，Hst1可能具有預(yù)防紫外線損傷的臨床意義。

2.2 制備促進(jìn)大面積皮膚缺損修復(fù)的復(fù)合材料

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Hst1多肽皮下注射后可加速大鼠皮膚缺損的愈合速度，且Hst1多肽及復(fù)合組Hst1的水凝膠、膜、膏、及海綿等材料可促進(jìn)大鼠皮膚缺損的愈合[7]，由此可知道Hst1多肽具有促進(jìn)非口腔黏膜愈合的作用。由于Hst1多肽具有良好的生物相容性和生物安全性，無(wú)免疫排斥和成瘤性等副作用，制備技術(shù)簡(jiǎn)單，價(jià)格便宜，因此應(yīng)用Hst1多肽制備促進(jìn)大面積皮膚缺損的修復(fù)材料具有良好產(chǎn)業(yè)化前景。

2.3 促進(jìn)牙種植體整合

細(xì)胞黏附是牙種植體成功整合的關(guān)鍵，快速的軟組織整合對(duì)種植體周?chē)纬擅芊猸h(huán)境和防止感染非常重要。有研究得出[16]，Hst1增強(qiáng)了口腔上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對(duì)羥基磷灰石的附著和擴(kuò)散，有利于防止種植體周?chē)腥径鴮?dǎo)致的種植體失敗和骨丟失；還可通過(guò)增加上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的遷移促進(jìn)再上皮化和血管生成，進(jìn)而促進(jìn)牙周組織的重建[15]。

2.4 作為眼表疾病治療的靶點(diǎn)

研究表明[6]，Hst1存在于正常人的淚液中，且在正常人和缺水性淚腺發(fā)育不全（ADDE）患者之間存在含量差異。鑒于Hst1的上皮營(yíng)養(yǎng)、傷口愈合、抗微生物和免疫調(diào)節(jié)作用，可假設(shè)其在ADDE的病理生理過(guò)程中發(fā)揮作用。由于此類(lèi)研究不多，因此不作過(guò)多闡述。

2.5 預(yù)防和治療頜骨骨壞死

唑來(lái)膦酸是與雙膦酸相關(guān)的頜骨骨壞死最常見(jiàn)的致病因素，據(jù)報(bào)道，唑來(lái)膦酸對(duì)骨和血管細(xì)胞有細(xì)胞毒性，并且對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性、遷移能力、黏附能力有影響[23]。因此，尋找新的方法來(lái)抵消細(xì)胞毒性作用將是開(kāi)發(fā)頜骨骨壞死預(yù)防性治療的首要條件。相關(guān)研究[24]通過(guò)體外小管形成實(shí)驗(yàn)的方法評(píng)估得到，Hst1可以抵消唑來(lái)膦酸對(duì)成骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性和抗氧化作用，并且恢復(fù)了兩個(gè)細(xì)胞系的細(xì)胞活力和遷移能力。這些觀察結(jié)果強(qiáng)調(diào)了在預(yù)防和治療頜骨骨壞死的新療法設(shè)計(jì)中Hst1的重要性。

2.6 構(gòu)建新型組織工程化骨

大體積骨組織缺損的修復(fù)是醫(yī)學(xué)中尚未攻克的重大難題之一[25]，這是由于臨床應(yīng)用的人工材料無(wú)法與人體組織融為一體;可吸收材料僅作為支架誘導(dǎo)骨生成,修復(fù)范圍和修復(fù)效率有限[26]，且自體骨移植的臨床應(yīng)用存在較大的局限性。而組織工程化骨不僅為缺損部位的骨再生提供支架,本身也具有生成新骨的能力。

然而多數(shù)材料本身缺乏骨誘導(dǎo)性，無(wú)法實(shí)現(xiàn)完全的骨組織修復(fù)，因而不能單獨(dú)用于大體積骨組織缺損的修復(fù)[27]，因此通過(guò)各種活性因子賦予醫(yī)用材料高效骨誘導(dǎo)性是修復(fù)大體積骨缺損的關(guān)鍵。目前，表面改性是增強(qiáng)生物材料用于細(xì)胞黏附和增值性能的有效方式[28]?；贖st1的眾多特性可推斷，Hst1能促進(jìn)3D打印支架上干細(xì)胞的黏附、伸展、增殖、分化，并可嘗試通過(guò)調(diào)配多肽與干細(xì)胞的比例使得細(xì)胞的增值率、存活率最大化。

3 Hst1結(jié)構(gòu)對(duì)其功能的影響

3.1 磷酸化結(jié)構(gòu)

Hst1在結(jié)構(gòu)上還可以描述為一種富含組氨酸的磷酸化蛋白。Driscoll等[29]通過(guò)建立重組人Hst1的生產(chǎn)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，缺乏磷酸絲氨酸的重組Hst1與羥基磷灰石的結(jié)合較唾液中的天然Hst1明顯降低，而Hst1是通過(guò)吸附羥基磷灰石行使降低念珠菌活性和礦化的功能，由此表明，Hst1在殘基2處的磷酸化結(jié)構(gòu)與其殺念珠菌的作用有較強(qiáng)的相關(guān)性。

3.2 環(huán)化結(jié)構(gòu)

Hst1的作用之一是誘導(dǎo)細(xì)胞擴(kuò)散和遷移，是通過(guò)激活細(xì)胞上的G蛋白偶聯(lián)受體進(jìn)而激活ERK1/2通路而產(chǎn)生的。由于線性多肽的不穩(wěn)定性，可以將環(huán)化作為穩(wěn)定線性多肽的應(yīng)對(duì)策略之一，這是因?yàn)榄h(huán)化結(jié)構(gòu)能夠降低蛋白折疊域與非折疊域的構(gòu)象熵，使得天然環(huán)肽類(lèi)物質(zhì)具有較高的熱穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，同時(shí)具有抗水解、在化學(xué)變性劑條件下也能保持完整生物活性的特性。另外，Oudhoff等和Henks 等[30-31]先后采用逐步截?cái)喾?，確定了活性所需的母肽最小結(jié)構(gòu)域，并且發(fā)現(xiàn)，對(duì)Hst1的N-到C-末端進(jìn)行環(huán)化可以增強(qiáng)大約1000倍摩爾活性，這表明作用的受體識(shí)別Hst1需要特定的構(gòu)象，且環(huán)化結(jié)構(gòu)可以使作用強(qiáng)度大幅度提升。

從以上兩點(diǎn)可以知道，保留Hst1的磷酸化結(jié)構(gòu)以及最小結(jié)構(gòu)域，并且使用環(huán)化結(jié)構(gòu)均能較好地發(fā)揮其殺菌和促進(jìn)傷口愈合的作用，為以Hst1作為主要材料的新型皮膚傷口愈合劑的開(kāi)發(fā)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。這些特性在構(gòu)建新型組織工程化骨方面也能發(fā)揮較大作用，如使用環(huán)狀Hst1作為媒介材料可以在用量較少的情況下通過(guò)調(diào)配蛋白與干細(xì)胞的比例使細(xì)胞的增殖率和存活率最大化，這是由于環(huán)狀結(jié)構(gòu)的Hst1具有更高的活性。

4 總結(jié)

通過(guò)了解Hst1及其異構(gòu)體的生物學(xué)功能和作用機(jī)制以及相關(guān)的臨床應(yīng)用，能夠?qū)ζ湮磥?lái)的發(fā)展方向有大致的了解。但各種臨床應(yīng)用相關(guān)的研究目前尚處于未成熟的階段，如人眼角膜上皮損傷的臨床應(yīng)用，具體機(jī)制尚不清楚；構(gòu)建新型組織工程化骨，目前尚處于實(shí)驗(yàn)階段。這些都還需要在研究中不斷剖析利弊，最后再將成熟的技術(shù)運(yùn)用到醫(yī)療和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)上。