郝王森，李任任，於麗華，王宇光，耿 貴*

(1.黑龍江大學現代農業(yè)與生態(tài)環(huán)境學院,哈爾濱150080；2.黑龍江大學生命科學學院,哈爾濱150080)

0 引言

甜菜(BetavulgarisL.)是藜科甜菜屬的二年生草本植物，具有喜冷涼濕潤，耐低溫、耐鹽堿等特點，是我國乃至世界上重要的糖料作物之一，供應世界上約1/3的糖[1]。內蒙古、新疆、黑龍江是我國甜菜的主要產區(qū)，近些年這些地區(qū)的極端低溫天氣對甜菜的產品質量造成較大的傷害[2]，研究發(fā)現，施加外源物質能夠提高低溫條件下植物的的抗寒性，如γ-氨基丁酸(GABA)[3]、24-表油菜素內酯(EBR)[4]、脫落酸(ABA)[5]、水楊酸[6]、氯化鈣[7]、K+[8]等。

磷酸二氫銨，又叫作磷酸一銨，簡稱一銨，其作為一種復合肥料，含有作物生長所必須的氮、磷等營養(yǎng)元素[9]，研究發(fā)現，磷酸一銨中所含的磷元素具有較好的移動性，揮發(fā)性，在土壤中能夠利于植物的吸收[10]。適量施用磷酸一銨不僅能夠促進作物的生長，還能提高作物對外界環(huán)境的適應能力，增強植物的抗逆性。如杜旭[11]等研究了4種不同的磷肥處理對尾巨桉DH3229的生長及抗性指標影響，發(fā)現磷酸一銨處理不僅能夠促進尾巨桉DH3229苗木生長、提高苗木質量，還能夠增加SOD、POD、多酚氧化酶(PPO)等多種抗氧化酶含量。陳兵兵等[12]發(fā)現氮肥含量一定時，施加磷肥，能夠提高低溫處理條件下苗期玉米的干物重，并且能夠減弱低溫對細胞膜造成的傷害。

目前針對磷酸二氫銨的研究主要用作植物肥料、動物飼料添加劑、木材、織物的防火劑等[13～14].而將其作為種肥，用于緩解植物低溫脅迫方面的報道還較少。因此，本文通過研究磷酸二氫銨種肥不同用量對甜菜子葉期幼苗的凍害緩解效果，嘗試將復合肥料作為一種抗寒外源調節(jié)劑，用于提高作物抗寒性、減輕作物低溫寒害。對進一步提高甜菜產量，增加經濟效益具有重要的實際意義，同時提供了一種新的作物防寒思路。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試甜菜品種為 KWS1176。

1.2 試驗設計

盆栽試驗于2020年7月在黑龍江大學甜菜研究所光照培養(yǎng)箱內進行。光照常溫處理使用HPG-280HX人工氣候箱，低溫處理使用LRH-250CL低溫培養(yǎng)箱。

試驗共設置4種處理，每組8次重復。分別為T0:不加一銨；T1:施加0.25 g一銨；T2:施加0.5 g一銨；T3:施加1 g一銨。播種：每盆統(tǒng)一先放200 g土壤，土壤上層分別加入相應重量的一銨，用200 g的土壤覆蓋一銨，再均勻放入20粒帶包衣的種子，最后用100 g土覆蓋。放入光照培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，光照14 h/d，黑暗10 h/d，溫度為8～20℃，從零點20℃開始，以2℃/h為標準先降低至8℃后升高回20℃，培養(yǎng)期間定時澆水，保持土壤相對含水量在70%左右，定時倒盆，保證每盆所受光照一致。

播種7 d后開始記錄各個處理的發(fā)芽率，待幼苗第一對真葉露尖時，保留每盆中長勢一致的甜菜幼苗進行低溫處理，低溫處理分成鍛煉期和冷凍期兩個時期。鍛煉期和冷凍期培養(yǎng)箱設置情況見表1。低溫處理后在溫度為8～20℃光照培養(yǎng)箱里 恢復3 d，統(tǒng)計甜菜幼苗低溫凍害死亡率。

表1 低溫培養(yǎng)箱溫度設置情況

1.3 干鮮重的測定

從各處理每盆中完整取5株幼苗，清理干凈表面土壤，測定其鮮重，計算獲得單株鮮重。將已知鮮重的甜菜幼苗放入105℃烘箱中殺青30 min，再以80℃烘至恒重，用萬分之一分析天平稱量5株幼苗干重，計算獲得單株干重。每個處理重復3次。

1.4 生理指標的測定

葉片的相對電導率(REC)參考Xia等[15]的方法進行測定。將處理后的甜菜幼苗用去離子水沖洗干凈，剪成小份，混合均勻，稱取2 g放入20 mL刻度試管中，加入20 mL去離子水，真空抽氣30 min，搖勻后用 DDS-307電導率儀測定初始電導率R1。再將試管封口沸水浴1 h，冷卻后搖勻，測定最終電導率R2。相對電導率=R1/R2×100%。參考李合生等[16]的方法進行以下生理指標的測定。MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定; 抗氧化酶活性測定：SOD活性采用抑制NBT光還原比色法測定; POD 活性采用愈創(chuàng)木酚法測定; APX活性采用紫外線吸收法測定。滲透調節(jié)物質測定：可溶性蛋白含量測定考馬斯亮藍G-250 染色法; 脯氨酸含量測定采用酸性茚三酮法。

1.5 數據統(tǒng)計分析

采用Office2019和SPSS 20. 0軟件對數據進行處理和統(tǒng)計分析。用單因素試驗統(tǒng)計分析方法，對不同處理的試驗數據進行差異顯著性檢測(顯著性水平為P≤0.05)。

2 實驗結果

2.1 不同水平磷酸二氫銨對甜菜幼苗生長以及出苗率、低溫死亡率的影響

圖1表明，低溫處理前(圖A)，各處理間的子葉期甜菜幼苗長勢基本沒有差異；但低溫處理后(圖B)與低溫處理恢復24 h后(圖C)，與施加磷酸二氫銨的T1～T3組相比未施加的T0組死亡率最高，隨著磷酸二氫銨用量的逐漸增加，幼苗死亡率逐漸降低，說明隨著磷酸二氫銨用量提高，促進子葉期甜菜幼苗的抗寒能力。

圖1 不同水平磷酸二氫銨對甜菜幼苗生長影響表型圖(A)低溫處理前 (B)低溫處理后(C)低溫處理恢復24 h后Fig.1 Phenotypic diagram of different proportions of ammonium dihydrogen phosphate on growth of beet seedlings (A) before low temperature treatment (B) after low temperature treatment (C) 24 h after low temperature treatment

表2 不同水平磷酸二氫銨對甜菜種子發(fā)芽率和死亡率的影響Tab.2 Effects of different proportions of ammonium dihydrogen phosphate on germination rate and frostbite rate of sugar beet seeds

由表2可知，不同水平磷酸二氫銨種肥用量對子葉期甜菜幼苗的出苗率影響不大，各個處理之間差異不顯著(P>0.05，下同)，但是經受凍害之后，各處理之間的幼苗死亡率卻有顯著差異(P≤0.05，下同)，T0處理的幼苗死亡率達到81.67%，比T1～T3組分別高出18.37%、46.94%、71.43%，T3組幼苗死亡率最低，凍害緩解效果最好。

2.2 不同水平磷酸二氫銨對凍害處理后甜菜幼苗干鮮重的影響

低溫處理后，施加磷酸二氫銨處理后每株甜菜幼苗干鮮重與不施相比有所增加，其中，T3組增加最為明顯，鮮重比T0～T2組分別增加了52.38%、48.21%、40.48%；干重分別比T0～T2組分別增加了50.44%、50.86%、34.18%，但T0與T1之間差異不顯著。

圖2 (A-B)低溫條件下，不同水平磷酸二氫銨對甜菜幼苗干鮮重的影響Fig.2 (A-B) Effects of different proportions of ammonium dihydrogen phosphate on dry and fresh weight of beet seedlings at low temperature

2.3 不同水平磷酸二氫銨對凍害處理后甜菜幼苗葉片質膜透性的影響

磷酸二氫銨對凍害處理后甜菜幼苗質膜透性有較大影響(如圖3(A-B))。結果表明，MDA含量在T0中表現為最高，比T1～T3組分別高出19.61%、35.00%、55.14%；隨著磷酸二氫銨施用水平的增加，各組的相對電導率逐漸降低，與MDA含量呈現出相同的趨勢。

圖3 (A-B)低溫條件下，不同水平磷酸二氫銨對甜菜幼苗MDA含量和相對電導率的影響Fig.3 (A-B) Effects of different proportions of ammonium dihydrogen phosphate on MDA content and relative conductivity of beet seedlings at low temperature

2.4 不同比例磷酸二氫銨對凍害處理后甜菜幼苗葉片抗氧化酶的影響

磷酸二氫銨對凍害處理后甜菜幼苗葉片抗氧化酶有較大影響(如圖4(A-C))?？梢钥闯?，T3處理條件下，SOD、POD和APX酶的活性最低，而T0處理的幾種酶的活性均為最高，T0組SOD、POD和APX活性分別比T3組高出25.83%、37.04%和33.33%。各處理的幾種抗氧化酶含量均具有顯著性差異。

2.5 不同水平磷酸二氫銨對凍害處理后甜菜幼苗葉片滲透調節(jié)物質的影響

磷酸二氫銨對凍害處理后甜菜幼苗葉片滲透調節(jié)物質有較大影響(如圖5(A-C))。結果表明，各個處理之間的的脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量均有顯著性差異，隨著磷酸二氫銨水平的增加，各處理的脯氨酸和可溶性糖含量逐漸降低，在T0組中脯氨酸和可溶性糖含量最高，脯氨酸含量比T1～T3組分別高出23.97%、33.31%、50.54%，可溶性糖含量分別比T1～T3組高出13.25%、20.02%、29.71%。但T0組可溶性蛋白含量最低，隨著磷酸二氫銨水平的增加，各處理的可溶性蛋白含量也呈逐漸增加，與脯氨酸和可溶性糖呈現的趨勢相反。

圖4 (A-C)低溫條件下，不同水平磷酸二氫銨對甜菜幼苗抗氧化酶的影響Fig.4 (A-C) Effects of different proportions of ammonium dihydrogen phosphateon antioxidant enzymes in beet seedlings at low temperature

圖5 (A-C)低溫條件下，不同水平磷酸二氫銨對甜菜幼苗滲透調節(jié)物質的影響Fig.5 (A-C) Effects of different proportions of ammonium dihydrogen phosphate on osmotic regulation substances in beet seedlings at low temperature

3 討論

溫度是影響植物生長發(fā)育的重要生態(tài)因子之一，低溫時間過長或者溫度過低都會引起植物的生理功能障礙，進而影響植物的生長發(fā)育[17]。低溫冷害同時會造成苗弱，植株生長黃化、萎蔫、遲緩、產量降低、品質降低的現象[18]。低溫脅迫是限制植物生長的重要環(huán)境因素[19]。在本試驗中，施加不同量磷酸二氫銨種肥，甜菜子葉期幼苗的凍死率以及干鮮重均有所不同。可以看出，未施磷酸二氫銨種肥幼苗受凍害最為嚴重，死亡率達到82.00%，而隨著磷酸二氫銨種肥用量的增加，子葉期甜菜幼苗的凍死率顯著下降；幼苗干鮮重有不同程度的增加，說明施加磷酸二氫銨能夠減緩低溫對子葉期幼苗的生長抑制，不同程度的促進幼苗的生長，這與杜旭[11]等的研究結果一致。

細胞膜是能夠支持多種生理生化反應的動態(tài)結構，研究表明質膜是植物凍害的主要部位，對細胞膜的損傷可以通過低溫度環(huán)境下的相對電導率和MDA含量來進行評估[20]。在本試驗中，隨著磷酸二氫銨比例的增加，T1～T3各處理組的相對電導率水平和MDA含量都呈現逐漸降低的趨勢，說明施加磷酸二氫銨能夠保護細胞膜結構，減少細胞膜的脂質過氧化和胞內溶質的外滲，而且隨著磷酸二氫銨用量的增加，其對細胞膜的保護作用也在逐漸增加。

抗氧化酶是抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分，用于清除植物體內的活性氧，提高植物的抗逆性，維持植物正常的生長發(fā)育[21]。陳兵兵等指出,在低溫條件下隨著施用磷肥的增加，使得超氧化物歧化酶(SOD)的活性逐漸增強，可以減少細胞膜透性，增加干物重[12]。杜旭等指出，磷肥對桉樹進行處理后，苗木葉片的可溶性糖、蛋白含量顯著提高，丙二醛(MDA) 含量及多種抗氧化酶活性顯著降低。磷肥處理均有利于促進桉樹苗木的生長[11]。本研究發(fā)現，在冷凍條件下隨著磷酸二氫銨的不斷增多，SOD、POD和APX活性呈顯著下降趨勢，這與前人的研究結果一致。說明磷酸二氫銨的施用一定程度上能夠提高了甜菜的抗寒能力。

滲透調節(jié)是指植物在適應環(huán)境變化過程中重要的調節(jié)機制，當植物受到低溫脅迫時，會有大量的有機滲透調節(jié)劑積累，如可溶性糖、甜菜堿、脯氨酸、蔗糖、游離氨基酸、可溶性蛋白，主要作用是降低滲透勢，增強細胞的吸水能力，從而適應低溫脅迫的過程[22]。植物在低溫脅迫條件下會通過增加滲透調節(jié)物質的含量來降低自身水勢，提高葉片保水能力。本研究發(fā)現，在冷凍條件下隨著磷酸二氫銨量的增加，脯氨酸，可溶性糖呈下降趨勢。低溫條件下，T0中可溶性蛋白含量較低，施加磷酸二氫銨可增加甜菜子葉期幼苗中的可溶性蛋白含量。

4 結論

低溫條件下，施加磷酸二氫銨種肥能夠提高子葉期甜菜幼苗的抗寒性，隨著磷酸二氫銨用量的增加，幼苗抗凍害能力不斷增強。磷酸二氫銨作為一種復合肥料，一定條件下，也可以作為抗寒劑作用于作物，減少低溫對作物造成的損失。