王秀麗，于 永，于 雷，辛凌翔，張 媛，李俊平，李旭妮*

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081； 2.南京農(nóng)業(yè)大學，南京 210095; 3.中牧實業(yè)股份有限公司，北京 100095)

傳染性鼻炎(Infectious Coryza, IC)是由副雞禽桿菌(Avibacteriumparagallinarum,Apg)引起的一種雞的急性上呼吸道疾病，以流鼻涕、打噴嚏、眶下竇腫脹以及臉部水腫為特征，在世界范圍內(nèi)廣泛流行[1]。20世紀80年代起，我國開始發(fā)現(xiàn)本病的流行，馮文達[2]于1987年首次在北京分離出一株致病菌，經(jīng)血清型鑒定為 A型副雞禽桿菌。林毅等[3]于1995年在發(fā)病蛋雞場分離到A和C血清型。張惠玲、苗得園等[4-5]于2003年和2005年分離出B血清型副雞禽桿菌。近幾年雞傳染性鼻炎在全國范圍內(nèi)廣泛流行，給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重損失[6]。2018～2019年，安徽省多家白羽肉雞養(yǎng)殖場持續(xù)出現(xiàn)疑似傳染性鼻炎的爆發(fā)和流行，為了解雞群疫病流行狀況，制定更科學的防控策略，本研究從不同批次發(fā)病雞的眶下竇中分離致病菌，并對其進行了全面鑒定。

1 材料及方法

1.1 病料來源 22份病料，于2018年8月～2019年9月從安徽省多家大型白羽肉雞養(yǎng)殖公司疑似雞傳染性鼻炎發(fā)病雞群中采集，發(fā)病雞主要表現(xiàn)為面部單側(cè)或兩側(cè)腫脹、打噴嚏，流鼻涕等。

1.2 培養(yǎng)基及試劑 TSA、TSB培養(yǎng)基購自青島海博生物技術有限公司；革蘭氏染色液購自索萊寶生物科技有限公司，雞血清、NAD、生化鑒定管購自Fermentas公司；DNA maker、2×Taq PCR Mster Mix購自北京博邁德基因技術有限公司?？乖?083(A)、0022(B)、Modesto(C),A、B、C陽性對照血清由天津瑞普生物技術有限公司提供。

1.3 實驗動物 35～40 d SPF雞，購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司。

1.4 副雞禽桿菌的分離 將病雞頭置于超凈臺內(nèi)，用燒紅的刀片消毒眶下竇外表面，無菌切開眶下竇，用接種環(huán)取眶下竇分泌物，劃線接種含 10% 雞血清和0.01% NAD的TSA瓊脂平板，將平板倒置于5% CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)18～20 h，觀察細菌的生長特性。挑取圓形、露滴狀、透明凸起帶藍色熒光的可疑菌落，接種含10%雞血清和0.01% NAD 的TSA瓊脂平板。于5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)18～20 h，若平板上的細菌純粹生長，挑取菌落分別接種含10%雞血清和0.01% NAD 的TSA瓊脂平板和含10%雞血清不含NAD的TSA瓊脂平板，在5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)18～20 h后，觀察細菌的生長情況。

1.5 回雞試驗 挑取在10%雞血清和0.01% NAD的TSA培養(yǎng)基上生長，在不含NAD的TSA平板上不生長的單菌落，接種含10%雞血清和0.01%NAD的TSB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)16～18 h，取新鮮培養(yǎng)物0.2 mL，分別眶下竇接種8只35～40 d SPF雞，另4只注射等量含10%雞血清和0.01% NAD的TSB作對照。接種后24～48 h觀察其臨床表現(xiàn)，發(fā)病雞按1.4項進行病原分離。取僅在10%雞血清和0.01% NAD的TSA培養(yǎng)基上生長的分離株進一步鑒定。

1.6 形態(tài)及生化特性 從含10%雞血清和0.01% NAD的TSA瓊脂平板上，取單菌落接種含10%雞血清和0.01% NAD的TSB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)16～18 h，取適量新鮮菌液進行革蘭氏染色，觀察細菌形態(tài)；取適量細菌懸液接種微量細菌生化鑒定管(NAD終濃度0.01%)，置5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)18～20 h，觀察細菌的生化特性。

1.7 16 s rRNA序列分析 用細菌16S rRNA的通用引物27F和1492R擴增分離菌的16S rRNA序列。上游引物序列：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，下游引物序列：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。反應程序： 94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min (30個循環(huán))；72 ℃ 10 min，用1 %的瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR擴增的結(jié)果。對擴增產(chǎn)物測序，與GenBank中公布的序列比對。

1.8 血清型鑒定 參照雞傳染性鼻炎診斷技術農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T538-20157[7]，用分離菌株制備血凝抗原，測定抗原的凝集效價，配制4單位抗原，與A、B、C型的分型血清進行血凝抑制試驗，測定血凝抑制效價，判定分離株的血清型。根據(jù)Ryuichi Sakamoto等[8]創(chuàng)建的多重PCR方法對分離菌株進行血清型鑒定。結(jié)合血清學鑒定和分子生物學鑒定的結(jié)果，判定分離菌株的血清型。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌的分離 從可疑病雞中共分離出8株細菌，此8株菌均在含10%雞血清和0.01% NAD的TSA瓊脂平板上形成直徑0.3 mm左右，圓形、光滑、灰白色、半透明露滴樣、邊緣整齊的小菌落(圖1)，在低倍顯微鏡下45°折光觀察有較強的熒光。在不含NAD的TSA瓊脂平板上不生長。

2.2 回雞試驗 8株分離菌株接種35～40 d SPF雞24 h后，試驗雞均出現(xiàn)食欲減少，面部和眼瞼部水腫、流淚，流涕等臨床癥狀，且均從發(fā)病雞眶下竇中分離到副雞禽桿菌。對照組無任何臨床癥狀。

2.3 形態(tài)、培養(yǎng)特性及生化特性 從回雞試驗發(fā)病雞眶下竇分離的細菌均在含10%雞血清和0.01%NAD的TSA瓊脂平板上形成直徑0.3 mm左右，圓形、光滑、灰白色、半透明露滴樣、邊緣整齊的小菌落(圖1)，且在低倍顯微鏡下45°折光觀察有較強的熒光；取菌落進行革蘭氏染色，為革蘭氏陰性短桿菌或球桿菌，單個或短鏈排列(圖2)；分離的8株菌生化鑒定結(jié)果一致(表1)，符合副雞禽桿菌的生化特性。

圖1 分離株在含10%雞血清和0.01%NAD的TSA瓊脂平板上的菌落形態(tài)Fig 1 Characteristics of isolated bacteria on TSA plates with 0.01% NAD and 10% chicken serum

圖2 副雞禽桿菌革蘭氏染色圖Fig 2 Gram stain of Avibacterium paragallinarum

表1 分離株的生化特性Tab 1 Characteristic of isolated strains

2.4 16S rRNA 序列分析 8株分離株均擴增出約1.5 kb的條帶(圖3)，序列與GenBank中的序列比對結(jié)果顯示，8株分離菌均為副雞禽桿菌。

M：DNA maker DL 2000 bp;1～8：AH-1到AH-8分離株;N：陰性對照;P：陽性對照M：DNA maker DL 2000 bp;1～8： AH-1～AH-8 strains isolated;N: negative;P: positive圖3 8株分離菌16S rRNA基因PCR結(jié)果Fig 3 16S rRNA PCR results for 8 strains isolated

2.5 血清型鑒定 血凝抑制試驗結(jié)果顯示，8株分離菌AH-1為A型副雞禽桿菌，AH-2～AH-8為B型副雞禽桿菌(表2)；PCR鑒定結(jié)果顯示，AH-1株擴增出約0.8 kb的條帶，為A型副雞禽桿菌AH-2到AH-8株均擴增出約1.1 kb的條帶，為B型副雞禽桿菌(圖4)。血清學鑒定和PCR鑒定結(jié)果一致。

表2 血凝抑制試驗結(jié)果Tab 2 Test results for HI

M：DNA maker DL 2000 bp;1～8：AH-1到AH-8分離株M：DNA maker DL 2000 bp;1～8：AH-1 to AH-8 strains isolated圖4 分離株多重PCR結(jié)果Fig 4 Multi-PCR results for isolated strains

3 討論與結(jié)論

副雞禽桿菌的血清型非常復雜，目前常用的有Page分型法，將副雞禽桿菌分為A、B、C 3個血清型[9]，日本科研人員開發(fā)的一系列單克隆抗體將副雞禽桿菌劃分為Page血清型，但該方法單克隆抗體供應有限，只有很少實驗室可以操作，有的沒有血清型特異性，未被廣泛應用[10]。Kume等提出了一種血清學分類方法，目前認識的Kume血清型有9個，分別為A1、A2、A3、A4、B1、C1、C2、C3，C4[11]。由于分類技術要求很高，Kume方案也未得到廣泛認可，本研究按照雞傳染性鼻炎診斷技術農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T538-20157的方法和PCR方法進行血清分型，結(jié)果一致。

2017年，龔玉梅等對我國雞傳染性鼻炎流行態(tài)勢分析顯示，我國近幾年雞傳染性鼻炎以B型株為主[6]。本實驗室從2018～2019年對安徽省若干大型白羽肉雞養(yǎng)殖場疑似感染雞傳染性鼻炎的病雞體內(nèi)分離到副雞禽桿菌，以B型為主，據(jù)文獻報道雞傳染性鼻炎造成的最大經(jīng)濟損失是育成雞生長不良和產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋下降[12]。本實驗室近兩年分離的副雞禽桿菌均是從24～30 d 的肉雞中分離，感染雞趨于低齡化；所有分離株均能復制出典型的雞傳染性鼻炎病例，說明流行毒株毒力較強；8次分離鑒定中7次為B型菌株流行，說明安徽地區(qū)B型菌株是重要的流行毒株；進行細菌分離的所有廠區(qū)均免疫了雞傳染性鼻炎的三價滅活疫苗，免疫失敗說明該地區(qū)的流行毒株與疫苗株間交叉保護效果不理想。本次細菌分離及流行病學調(diào)查對于當?shù)氐囊卟》揽鼐哂兄匾笇б饬x。

目前，我國應用的含有B型毒株的疫苗只有三種。免疫了傳染性鼻炎A型、B型、C型三價滅活疫苗的雞群，仍會持續(xù)爆發(fā)雞傳染性鼻炎。免疫失敗表明副雞禽桿菌同種血清型不同株之間的交叉保護效果不理想。有文獻報道，NAD非依賴型的副雞禽桿菌也在我國部分區(qū)域分離到，且NAD依賴型傳染性鼻炎的疫苗對NAD非依賴型副雞禽桿菌的保護性很低[13]。分離、篩選出抗原性好、免疫譜廣的菌株對研制疫苗和防控疾病具有重要意義。上述分離毒株的毒力、免疫原性均有待進一步研究。