史祚秀，馮杰，劉洋，李碩，喬世峰

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 普外科，遼寧 錦州 121001；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院 病理科，遼寧 錦州 121000；3.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院 ICU，山東 濟(jì)南 250000）

結(jié)直腸癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，在全球范圍內(nèi)其發(fā)病率位居第4 位，死亡率居第3 位[1]。早期結(jié)直腸癌的5年生存率約達(dá)90%，晚期則不到10%。因此，結(jié)直腸癌的早期診斷顯得尤為重要[2]。結(jié)腸鏡作為結(jié)直腸癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，難以用于普通人群的篩選，且易受腸道準(zhǔn)備及醫(yī)生操作經(jīng)驗(yàn)的影響。

代謝組學(xué)是近年來用于定量分析氨基酸、脂肪酸、核酸及糖類等小分子物質(zhì)的新技術(shù)。隨著對惡性腫瘤的深入研究，發(fā)現(xiàn)氨基酸、脂肪酸及糖類等可能在惡性腫瘤早期就已出現(xiàn)變化[3]。研究還顯示，氨基酸代謝物的變化與惡性腫瘤的關(guān)系更為密切[4]。

本研究擬分析結(jié)直腸癌患者手術(shù)前后血漿氨基酸及肉堿代謝物水平的差異，探究結(jié)直腸癌患者血漿氨基酸代謝物及肉堿中有無可作為結(jié)直腸癌診斷的生物標(biāo)志物，并為腫瘤代謝治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年9月—2019年8月在錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普通外科住院的166例患者血液樣本，將其分為實(shí)驗(yàn)組120例和對照組46例。實(shí)驗(yàn)組男性62例，女性58例；年齡32 ～89 歲，平均（65.29±10.40）歲。對照組男性21例，女性25例；年齡36 ～88 歲，平均（63.13±12.45）歲。結(jié)直腸癌臨床分期依據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)第八版結(jié)直腸癌分期標(biāo)準(zhǔn)[5]。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理檢查明確診斷為結(jié)直腸癌；②年齡18 ～90 歲；③手術(shù)前未接受其他抗腫瘤治療；④常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查未見異常；⑤常規(guī)影像學(xué)檢查未見異常；⑥入院后經(jīng)病理診斷為結(jié)直腸息肉或者腺瘤或者伴有消化道出血。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他部位腫瘤；②采用放化療或靶向治療；③嚴(yán)重代謝系統(tǒng)疾??；④血液系統(tǒng)疾病。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及其家屬知情同意。兩組年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 儀器美國AB SCIEX 公司API 3200MD 質(zhì)譜分析儀，日本島津株式會(huì)社LC20A 液相色譜儀，系統(tǒng)控制和數(shù)據(jù)收集采用美國AB SCIEX 公司分析軟件v1.6.0，數(shù)據(jù)預(yù)處理采用儀器自帶的Chemo views 軟件，配備的離子源是正離子電噴霧離子源（ESI+）。

1.2.2 試劑美國Thermo Fisher 公司乙腈和高純度的水，美國Sigma-Aldrich 公司正丁醇和乙酰氯，甲醇（商業(yè)購買），12 種氨基酸同位素內(nèi)標(biāo)（NSK-A）和8 個(gè)肉堿內(nèi)標(biāo)（NSK-B）購自美國Cambridge Isotope實(shí)驗(yàn)室，質(zhì)量控制（quality control, QC）標(biāo)準(zhǔn)品購自德國Chromsystems 公司。

1.2.3 樣本收集所有受試者于晨起空腹條件下采用干血滴濾紙片法（DBS）針刺指尖采集血樣，所有DBS 血樣保存于4℃及時(shí)送檢。

1.2.4 樣本處理用打孔器將送檢的DBS 濾紙片切割為直徑3 mm 的紙盤（相當(dāng)于3.2μl 全血），然后將其置于96 孔過濾板中，每孔加入含內(nèi)標(biāo)的無水甲醇，置于孔板震蕩器室溫下震蕩20 min。用孔板離心機(jī)以1 500 r/min 離心2 min，將上層樣板中的提取液通過濾過膜過濾并收集于下層樣板中。每個(gè)樣板隨機(jī)選取4 個(gè)空白孔，分別添加2 個(gè)低水平和2 個(gè)高水平的QC 溶液，將上述濾出液和QC 溶液在氮?dú)釴2保護(hù)下吹干，干燥后的樣本在65℃條件下用60μl 乙酰氯和正丁醇（1∶9）混合液衍生化20 min，衍生化的溶液在N2保護(hù)下再次吹干，最后將每個(gè)干燥的樣本溶解在100μl 新鮮流動(dòng)相溶液中以備進(jìn)行代謝組學(xué)分析。

1.3 代謝組學(xué)分析

通過美國AB SCIEX 公司API 3200MD 質(zhì)譜分析儀進(jìn)行直接注射法質(zhì)譜分析，該儀器在正離子電噴霧離子源下運(yùn)行，每次運(yùn)行時(shí)注入20μl 樣本，以50%+50%乙腈，進(jìn)行梯度洗脫。洗脫程序以0.2 ml/min開始，隨后在0.08 min 內(nèi)降到0.01 ml/min 并維持1.50 min，之后在0.01 min 內(nèi)再次升高到0.2 ml/min并維持0.5 min。離子源噴霧電壓設(shè)為4.5 kV，離子源氣體壓力設(shè)定為35 磅/ 平方英寸（psi）（1 psi=6.895 kPa），屏障氣體壓力設(shè)為20 psi，輔助氣體溫度保持在350℃，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）分析儀掃描方式采用母離子掃描（precursor ion,Prec）、中性丟失（neutral loss, NL）及多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitor, MRM）3 種掃描模式。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用Excel 和SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)或配對t檢驗(yàn)或方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血漿代謝物水平比較

兩組丙氨酸（Ala）、精氨酸（Arg）、瓜氨酸（Cit）、谷氨酰胺（Gln）、甲硫氨酸（Met）、鳥氨酸（Orn）、脯氨酸（Pro）、蘇氨酸（Thr）、酪氨酸（Tvr）、丁二?；鈮A（C4DC）、葵酰基肉堿（C10）及二十四?；鈮A（C24）比較，經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組較對照組升高。而天冬酰胺（Asn）、天門冬氨酸（Asp）、半胱氨酸（Cvs）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Glv）、同型半胱氨酸（Hcv）、組氨酸（His）、亮氨酸（Leu）、賴氨酸（Lvs）、苯丙氨酸（Phe）、胡椒酰胺（Pip）、色氨酸（Trp）、丙?；鈮A（C3）、丁?；鈮A（C4）、羥丁?；鈮A（C4-OH）、纈氨酸（Val）、游離肉堿（C0）、乙酰基肉堿（C2）、異戊酰基肉堿（C5）、羥異戊酰基肉堿（C5-OH）、戊二酰基肉堿（C5DC）、戊烯?；鈮A（C5：1）、己?；鈮A（C6）、辛?；鈮A（C8）、月桂酰基肉堿（C12）、肉豆蔻?；鈮A（C14）、羥肉豆蔻?；鈮A（C14-OH）、肉豆蔻二?；鈮A（C14DC）、棕櫚?；鈮A（C16）、羥棕櫚?；鈮A（C16-OH）、羥棕櫚烯?；鈮A（C16：1-OH）、十八碳?；鈮A（C18）、二十碳?；鈮A（C20）、二十二碳酰基肉堿（C22）、二十六碳酰基肉堿（C26）及肉豆蔻烯?；鈮A（C14：1）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組血漿代謝物水平比較 （μmol/L，±s）

表1 兩組血漿代謝物水平比較 （μmol/L，±s）

組別 n Ala Arg Asn Asp Cit Cvs Gln對照組 46 146.685±51.362 5.643±3.394 68.463±23.749 24.494±8.760 24.674±9.084 1.345±0.730 8.003±4.134實(shí)驗(yàn)組 120 164.927±52.247 7.537±4.096 67.577±22.757 27.722±12.542 29.089±10.738 1.492±0.734 9.485±3.987 t 值 2.023 2.912 -0.236 1.654 2.582 1.229 2.257 P 值 0.045 0.004 0.814 0.099 0.010 0.220 0.025組別 Glu Glv Hcv His Leu Lvs Met對照組 176.900±55.727 191.458±61.584 8.622±0.826 66.775±55.929 99.656±30.560 127.119±76.229 15.833±4.429實(shí)驗(yàn)組 177.338±58.360 206.929±73.143 8.791±0.952 67.813±40.126 102.481±33.215 151.880±78.904 17.671±5.598 t 值 0.046 1.329 1.110 0.146 0.527 1.930 1.998 P 值 0.963 0.185 0.268 0.884 0.598 0.055 0.047組別 Orn Phe Pip Pro Ser Thr Trp對照組 12.790±4.915 46.817±21.731 242.953±94.378 405.181±199.432 47.969±13.417 22..603±7.927 40.823±10.193實(shí)驗(yàn)組 15.494±6.857 42.474±13.106 275.573±129.372 464.549±174.898 51.815±16.636 26.172±9.063 44.640±11.889 t 值 2.527 -1.760 1.613 2.020 1.402 2.462 1.922 P 值 0.012 0.080 0.108 0.045 0.163 0.015 0.056組別 C3 C4 C4-OH Tvr Val C0 C2對照組 1.446±0.504 0.161±0.069 0.042±0.024 54.830±16.219 143.245±36.039 26.072±8.309 14.200±5.335實(shí)驗(yàn)組 1.486±0.675 0.181±0.081 0.046±0.030 61.322±16.636 136.524±33.414 28.125±10.619 13.275±5.672 t 值 0.378 1.56 0.746 2.266 -1.212 1.227 -1.008 P 值 0.706 0.120 0.456 0.025 0.227 0.221 0.314組別 C4DC C5 C5-OH C5DC C5：1 C6 C8對照組 0.221±0.099 0.113±0.055 0.127±0.043 0.069±0.051 0.026±0.015 0.082±0.033 0.095±0.059實(shí)驗(yàn)組 0.291±0.171 0.116±0.062 0.142±0.071 0.075±0.045 0.030±0.025 0.087±0.050 0.117±0.097 t 值 3.684 0.296 1.895 0.713 0.958 0.616 1.477 P 值 0.000 0.768 0.061 0.476 0.339 0.539 0.141

續(xù)表1

2.2 不同臨床分期結(jié)直腸癌患者血漿代謝物水平比較

結(jié)直腸癌患者0 期1例（由于數(shù)據(jù)過少，為防止對結(jié)果造成偏倚現(xiàn)象，故去掉），結(jié)直腸癌患者Ⅰ期14例，年齡53 ～81 歲，平均（66.79±8.74）歲。結(jié)直腸癌患者Ⅱ期50例，年齡43 ～86 歲，平均（64.96±9.74）歲。結(jié)直腸癌患者Ⅲ期40例，年齡46 ～89 歲，平均（64.63±10.16）歲。結(jié)直腸癌患者Ⅳ期15例，年齡51 ～82 歲，平均（70.2±8.97）歲。不同臨床分期結(jié)直腸癌患者年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同臨床分期結(jié)直腸癌患者C4DC 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而Ala、Arg、Cit、Gln、Met、Orn、Pro、Thr、Tvr、C10 及C24 水 平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同臨床分期結(jié)直腸癌患者血漿代謝物水平比較 （μmol/L，±s）

表2 不同臨床分期結(jié)直腸癌患者血漿代謝物水平比較 （μmol/L，±s）

分期 n Ala Arg Cit Gln Met OrnⅠ期 14 164.484±40.252 6.176±2.330 30.468±9.145 10.464±2.905 18.711±6.019 14.922±4.332Ⅱ期 50 167.348±55.789 6.992±4.405 28.688±8.524 9.655±3.833 16.892±4.862 15.133±5.236Ⅲ期 40 166.621±54.157 8.167±4.322 31.966±14.226 9.068±3.795 17.321±5.431 14.881±6.093Ⅳ期 15 149.742±47.040 7.091±3.513 25.471±8.881 10.436±6.139 20.231±7.563 15.934±6.912 F 值 0.323 1.486 0.02 0.876 0.206 0.425 P 值 0.570 0.223 0.887 0.349 0.650 0.514分期 Pro Thr Tvr C4DC C10 C24Ⅰ期 473.424±147.125 27.483±6.962 65.204±15.734 0.309±0.219 0.115±0.070 0.029±0.017Ⅱ期 467.875±133.380 23.569±7.503 60.739±15.848 0.242±0.146 0.094±0.081 0.026±0.013Ⅲ期 502.134±244.446 26.777±8.684 63.879±14.283 0.295±0.143 0.106±0.069 0.026±0.013Ⅳ期 463.825±187.388 27.442±10.244 52.943±23.767 0.344±0.180 0.147±0.131 0.033±0.017 F 值 1.093 1.667 1.708 4.728 0.213 2.368 P 值 0.296 0.197 0.191 0.030 0.645 0.124

2.3 結(jié)直腸癌患者手術(shù)前后血漿代謝物水平比較

結(jié)直腸癌患者術(shù)前與術(shù)后Ala、Cit、Gln、Orn、Pro、Thr、C10 及C24 血漿代謝物比較，經(jīng)配對樣本t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而Arg、Met、Tvr 及C4DC 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。術(shù)后Ala、Cit、Gln、Pro、C10、C24 水平較術(shù)前降低（P＜0.05）；而Orn、Thr 水平較術(shù)前升高（P＜0.05）。見表3。

表3 結(jié)直腸癌患者手術(shù)前后血漿代謝物水平比較 （n =119，μmol/L，±s）

表3 結(jié)直腸癌患者手術(shù)前后血漿代謝物水平比較 （n =119，μmol/L，±s）

時(shí)間 Ala Arg Cit Gln Met Orn術(shù)前 162.667±48.421 7.213±4.031 29.846±11.121 9.687±4.185 17.237±5.233 14.944±5.323術(shù)后 134.346±42.861 7.545±8.766 19.948±11.222 8.212±4.257 18.242±6.125 23.321±27.223 t 值 5.294 -0.414 6.991 2.619 -1.480 -3.212 P 值 0.000 0.680 0.000 0.010 0.142 0.002時(shí)間 Pro Thr Tvr C4DC C10 C24術(shù)前 479.133±190.451 25.501±8.103 61.548±14.586 0.263±0.143 0.104±0.077 0.027±0.013術(shù)后 353.314±134.323 28.170±11.436 64.390±20.070 0.238±0.138 0.063±0.050 0.023±0.012 t 值 6.160 -2.341 -1.26 1.955 5.133 2.579 P 值 0.000 0.021 0.210 0.053 0.000 0.011

3 討論

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一[6]，其體內(nèi)的代謝方式發(fā)生改變，特別是氨基酸代謝。氨基酸作為組成蛋白質(zhì)的基本單位，參與體內(nèi)多種生理及病理變化，本研究中使用LC-MS/MS 檢測血漿代謝物水平的改變，并分析其是否可用于結(jié)直腸癌的早期診斷。

本研究結(jié)果顯示結(jié)直腸癌組血漿中的Ala、Arg、Cit、Gln、Met、Orn、Pro、Thr、Tvr、C4DC、C10、C24 較對照組升高，與MIYAGI 等[7]研究結(jié)果基本一致。其中Gln 水平的變化與NISHIUMI 等[8]的研究結(jié)果相一致。Gln 是機(jī)體最豐富的非必須氨基酸，也是惡性腫瘤消耗最多的氨基酸。TODOROVA 等[9]認(rèn)為，補(bǔ)充Gln 能夠抑制IGF-1 激活的PI-3K/Akt 信號通路，而此通路是腫瘤生成和延長腫瘤細(xì)胞存活時(shí)間所必須的。Gln 也是腫瘤細(xì)胞中，除葡萄糖外的主要供能物質(zhì)[10]，德國學(xué)者WARBURG[11]教授曾提出，腫瘤細(xì)胞即使在氧充足的情況下也主要依靠糖酵解來提供能量即Warburg 效應(yīng)。由于Warburg 效應(yīng)，惡性腫瘤產(chǎn)生的丙酮酸不能進(jìn)入三羧酸循環(huán)，在ALT 作用下接受谷氨酸的氨基生成Ala。IKEDA 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者血清中的Ala 水平也較對照組高。

此外，對結(jié)直腸癌患者行常規(guī)根治性手術(shù)治療后，為減少手術(shù)對患者的影響，術(shù)后約1 周于晨起空腹采血行串聯(lián)質(zhì)譜檢查。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，術(shù)后Ala、Gln、Cit、Pro、C10、C24 水平較術(shù)前降低，而Orn、Thr 水平較術(shù)前升高。推測Ala、Gln、Cit 及Pro 代謝物水平的前后變化最可能是因?yàn)槭中g(shù)去除腫瘤的結(jié)果，因此Ala、Gln、Cit、Pro、C10 及C24 與結(jié)直腸癌的關(guān)系更為密切，作為早期診斷結(jié)直腸癌標(biāo)志物的可靠性更高。MA 等[13]分析大腸癌患者術(shù)前、術(shù)后的血清氨基酸，發(fā)現(xiàn)Val、5-氧代-L-脯氨酸等代謝物含量下降，而Tvr 上升，但哪些氨基酸更具有價(jià)值，還需要進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)還對不同臨床分期結(jié)直腸癌患者的血漿代謝物進(jìn)行比較，以進(jìn)一步研究其與該疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系，結(jié)果顯示Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期及Ⅳ期比較，僅發(fā)現(xiàn)C4DC 水平變化有差異，其他代謝物水平無差異。HIRAYAMA 等[14]研究顯示，未發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者代謝物水平與癌癥分期有相關(guān)性。QIU 等[15]報(bào)道結(jié)直腸癌患者代謝物譜與癌癥進(jìn)展無相關(guān)性。也有研究表明，不同臨床分期腫瘤患者的代謝物水平變化有差異[16-17]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可能也與血漿代謝物的測量方法、血漿代謝物的種類不全、覆蓋的人群不夠廣泛、地域差異等諸多因素有關(guān)。因此，結(jié)直腸癌患者的嚴(yán)重程度是否與血漿代謝物水平相關(guān)，仍需進(jìn)一步研究。

?；鈮A是肉堿與氨基酸代謝物或脂肪酸結(jié)合的一種酯類物質(zhì)，肉堿是氨基酸代謝和脂肪酸β-氧化代謝的中間體。當(dāng)氨基酸代謝或脂肪酸氧化代謝發(fā)生異常，會(huì)造成相應(yīng)的酰基輔酶A 蓄積，導(dǎo)致血漿中的?；鈮A發(fā)生改變。肉堿的主要生理功能包括：①肉堿作為長鏈脂肪酸唯一載體，將長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)入線粒體內(nèi)進(jìn)行氧化，提供能量；②肉堿是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外游離CoA 與酰基CoA 平衡的調(diào)節(jié)器。?；鈮A的變化部分歸因于肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶2（CPT2）的下調(diào)，其下調(diào)促進(jìn)了肝癌的發(fā)生。LU 等[18]研究揭示，15 種?；鈮A在肝癌中存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中不同臨床分期的肝癌患者，其?；鈮A也有差異。WILLIAMS等[19]研究證明，酰基肉堿、氨基酸及核苷等代謝譜在區(qū)分結(jié)直腸癌樣本與非腫瘤上皮，以及疾病不同階段（T1～T4）中發(fā)揮作用。目前檢測血酰基肉堿是診斷脂肪酸氧化代謝最有特異性和最直接的方法[20]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Ala、Arg、Cit、Gln、Met、Orn、Pro、Thr、Tvr、C4DC、C10 及C24 在結(jié)直腸癌早期預(yù)測中具有重要參考價(jià)值，Ala、Cit、Orn、Pro、C4DC 及C10 在結(jié)直腸癌早期診斷中具有重要意義。但由于樣本量相對較少，對結(jié)直腸癌的早期診斷仍需要大規(guī)模的臨床研究來進(jìn)一步驗(yàn)證。