俞孟軍 譚金晶 王敬慧

肺癌是世界上死亡率最高的惡性腫瘤。據(jù)最新的Cancer Statistics 2021數(shù)據(jù)顯示，預(yù)計2021年美國新發(fā)肺癌占癌癥新發(fā)病例的12.4%，并會導(dǎo)致21.7%的癌癥死亡，是致死率最高的惡性腫瘤[1]。根據(jù)國家癌癥中心2019年發(fā)布的數(shù)據(jù)，肺癌是2015年我國發(fā)病率和死亡率最高的癌癥[2]。目前肺癌的主要治療方式為手術(shù)、化療、放療、靶向和免疫治療等。靶向治療的出現(xiàn)對于有特定驅(qū)動基因突變的患者產(chǎn)生了良好的治療效果，但不可避免地發(fā)生耐藥和疾病進展等問題[3,4]。同時，缺乏預(yù)測療效的生物標(biāo)志物和緩解率較低限制了免疫治療的臨床發(fā)展。腫瘤異質(zhì)性是腫瘤治療面臨困難的重要原因。目前認為單細胞層面的研究能夠獲得更多的關(guān)于腫瘤異質(zhì)性的有價值信息。湯富酬實驗室在2009年應(yīng)用單細胞RNA測序（single‐cell RNA sequencing,scRNA‐seq）分析單個小鼠的轉(zhuǎn)錄組[5]，使單細胞層面的分析成為可能。肺癌常常表現(xiàn)出瘤內(nèi)基因組的顯著差異性，其克隆的多樣性影響了臨床的診斷和治療[6]。單細胞測序（single‐cell sequencing, SCS）技術(shù)的應(yīng)用為了解肺癌免疫微環(huán)境、發(fā)生和發(fā)展以及免疫治療機制提供了可能[7]。本文將介紹單細胞測序技術(shù)的相關(guān)進展，并對其在肺癌腫瘤異質(zhì)性、腫瘤微環(huán)境、侵襲和轉(zhuǎn)移及治療反應(yīng)和耐藥性等方面進行綜述。

1 單細胞測序技術(shù)

單細胞測序的目的是通過新一代測序技術(shù)（next generation sequencing, NGS）來識別單個細胞的基因組序列信息，并獲得細胞間遺傳物質(zhì)和蛋白質(zhì)差異的信息，從而更好地了解單個細胞在微環(huán)境中的作用[8]。單細胞測序還可以研究單核苷酸變異、拷貝數(shù)變異、單個細胞DNA水平的基因組結(jié)構(gòu)變化、RNA水平的基因表達變化、基因融合、選擇性剪接、DNA甲基化和組蛋白修飾等[9]。

1.1 單細胞測序技術(shù)的發(fā)展 單細胞測序的步驟主要包括：單細胞分離、核酸擴增、構(gòu)建文庫、高通量測序和數(shù)據(jù)分析。其關(guān)鍵是提取獲得完整的有活力的靶細胞。用于單細胞分離的技術(shù)方法很多，包括梯度稀釋法[10]、機械顯微操作技術(shù)[11]、激光捕獲顯微切割技術(shù)[12]、熒光激活細胞分選[13]、免疫磁分離[14]、微流控平臺[15]等。

目前常用的單細胞測序平臺有SMART‐seq2[16]、Fluidigm C1[17]、10X Genomics[18]、BD Rhapsody[18]等。10X是到目前為止商業(yè)化最成功的平臺，在主流高影響因子的期刊上有可信的數(shù)據(jù)發(fā)表，并且都與Smart‐Seq數(shù)據(jù)的結(jié)果存在比較。其優(yōu)點包括高通量、低成本、操作簡便、流程自動化程度高、支持文獻數(shù)量多等。但對細胞總量及活性要求高，缺乏質(zhì)控點及平臺環(huán)境較為封閉等不足也限制了其進一步的推廣?？偟膩碚f，研究者應(yīng)根據(jù)自己的需求選擇適合自己的單細胞測序平臺。

1.2 單細胞測序技術(shù)的應(yīng)用方向 單細胞測序主要應(yīng)用于單細胞基因組測序（DNA測序）、轉(zhuǎn)錄組測序（RNA測序）、表觀遺傳測序及空間轉(zhuǎn)錄組測序等，它們可以揭示細胞在不同階段的功能和不同方面的特征。

單細胞基因組測序技術(shù)將分離的單個細胞的DNA進行擴增后進行高通量測序，用于揭示細胞群體間差異和細胞進化關(guān)系。到目前為止，這種測序技術(shù)主要用于發(fā)現(xiàn)DNA分子中的異常[19]。單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)主要應(yīng)用于胚胎發(fā)育、免疫系統(tǒng)和腫瘤多個領(lǐng)域，鑒定多種組織中不同類型細胞轉(zhuǎn)錄組特征。除了基因組本身，表觀遺傳修飾（特別是DNA甲基化）和不同的染色質(zhì)成分在基因表達調(diào)控中也起著重要作用[20]。單細胞測序技術(shù)的快速發(fā)展使在單細胞水平上測量DNA甲基化成為可能。通過這些單細胞表觀基因組研究，可以在單細胞分辨率下分析有關(guān)染色質(zhì)修飾及其潛在調(diào)控效應(yīng)的信息，能夠補充單細胞DNA測序和RNA測序獲得的DNA變異和RNA表達之外的數(shù)據(jù)[21]。

單細胞空間轉(zhuǎn)錄組[22]分析將基因的表達與組織切片的免疫組化圖像進行整合，從而將組織內(nèi)不同細胞的基因表達信息定位到組織的原始空間位置上去，區(qū)分哪些基因在組織內(nèi)是活躍的，可以直觀檢測組織中不同部位基因表達的差異。目前單細胞空間轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)主要用于神經(jīng)科學(xué)、生物發(fā)育和腫瘤等多個領(lǐng)域，為細胞功能、表型和組織微環(huán)境中位置的關(guān)系提供了重要信息。

2 單細胞測序在肺癌中的應(yīng)用

單細胞測序技術(shù)在解析人類癌癥細胞和生物復(fù)雜性方面起到了重要作用，其中許多癌癥是高度異質(zhì)性的，這是因為除了不同的惡性細胞亞群外，還有各種基質(zhì)和免疫細胞類型。目前單細胞測序技術(shù)在黑色素瘤[23]、乳腺癌[24]、結(jié)直腸癌[25]等腫瘤中有了廣泛的應(yīng)用，對肺癌的研究也在不斷深入。

2.1 腫瘤異質(zhì)性 近年來，人們對于單個腫瘤中存在的細胞多樣性有了一定的了解，但對于這種異質(zhì)性如何影響腫瘤行為和臨床結(jié)局仍處于萌芽階段[26]。

如果能對早期肺結(jié)節(jié)的細胞類型和基因圖譜有所了解，那么人們就能更好地理解早期肺癌的發(fā)生和發(fā)展的機制，做到早篩早診早治。Lu等[27]使用scRNA‐seq技術(shù)在單細胞水平上解析磨玻璃結(jié)節(jié)腺癌（ground glass nodules adenocarcinoma, GGN‐ADC）的全面圖譜，成功鑒定出腫瘤細胞、內(nèi)皮細胞、T細胞等8種細胞類型。通過對GGN‐ADC中細胞表型的全面分析，他們對肺癌的致癌作用有了更深刻的理解，這將有助于今后的預(yù)防和治療。

肺癌的死亡率高和治療預(yù)后差主要在于其異質(zhì)性，為了剖析肺癌的這種異質(zhì)性，Maynard等[28]從30例肺癌患者中，獲取了49份臨床活檢標(biāo)本，這些標(biāo)本分別來自治療前和治療中。通過對比治療前后腫瘤微環(huán)境所發(fā)生的變化，他們發(fā)現(xiàn)這些細胞展現(xiàn)出了極為復(fù)雜和動態(tài)的腫瘤生態(tài)系統(tǒng)。癌細胞的scRNA‐seq能比臨床常規(guī)基因檢測方法發(fā)現(xiàn)更多的靶向癌基因。治療后存活的癌細胞表現(xiàn)出肺泡細胞通路活化特征，提示治療可誘導(dǎo)癌細胞向原始細胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變。這表明癌細胞和腫瘤微環(huán)境會在抗癌藥的作用下，變得更有可塑性。

2.2 腫瘤微環(huán)境 單細胞技術(shù)已被用于描述肺癌[29]、乳腺癌[30]、結(jié)直腸癌[31]、頭頸鱗狀細胞癌[32]等的腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment, TME），包括免疫細胞和基質(zhì)細胞，這是其余方法無法實現(xiàn)的。

腫瘤浸潤性髓樣細胞（tumor‐infiltrating myeloid cells,TIMs）包含單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和嗜中性粒細胞，已成為癌癥生長的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。這些細胞可以多樣化地進入多種狀態(tài)，進一步促進或限制腫瘤的生長，但是人們對此知之甚少。單細胞測序可以特異性識別腫瘤微環(huán)境中某一類細胞及其對應(yīng)的基因表達特征。Lavin等[33]利用scRNA‐seq分析18個肺腺癌患者的腫瘤免疫微環(huán)境，得到了TREM2、CD81、MARCO、APOE等腫瘤浸潤巨噬細胞的特征性基因。

Zilionis等[34]使用scRNA‐seq對非小細胞肺癌（non‐small cell lung cancer, NSCLC）患者的TIMs進行定位，發(fā)現(xiàn)了25個TIMs狀態(tài)，其中大多數(shù)在患者中可被重復(fù)發(fā)現(xiàn)。此外，他們還對小鼠TIMs進行了分析。通過比較物種間的TIM，他們發(fā)現(xiàn)樹突狀細胞和單核細胞之間的種群結(jié)構(gòu)幾乎完全一致。這表明不同物種的骨髓細胞高度相似。這項研究為將來解釋髓系細胞在癌癥中的確切作用提供理論基礎(chǔ)，TIMs或許可成為免疫治療新靶標(biāo)。

Guo等[29]采用降維聚類分析NSCLC患者的單細胞測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)一些細胞類群的T細胞耗竭特征基因表達相對較低，定義它們?yōu)轭A(yù)耗竭細胞，并證實“預(yù)耗竭”與耗竭T細胞比率高與肺腺癌更好的預(yù)后相關(guān)。同時，他們還觀察到腫瘤調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cells, Tregs）內(nèi)的異質(zhì)性，其特征是TNFRSF9（抗原特異性Tregs的激活標(biāo)記）的雙峰分布，這些激活的腫瘤Tregs的基因特征與肺腺癌的不良預(yù)后相關(guān)。研究治療前后的T細胞表達狀態(tài)，有助于識別和預(yù)測接受免疫調(diào)節(jié)劑治療的NSCLC及其他類型腫瘤的預(yù)后。

同樣，Lambrechts等[35]通過單細胞轉(zhuǎn)錄組探索了肺鱗癌基質(zhì)細胞的亞群分類、基因功能、關(guān)鍵標(biāo)志基因，共鑒定出52個基質(zhì)細胞亞群，包括迄今被認為是同質(zhì)的不同類型的腫瘤相關(guān)成纖維細胞、內(nèi)皮細胞和腫瘤浸潤免疫細胞，并發(fā)現(xiàn)腫瘤基質(zhì)細胞基因表達的動態(tài)變化，反映了腫瘤微環(huán)境的復(fù)雜性。例如，腫瘤內(nèi)皮細胞下調(diào)免疫細胞歸巢途徑，腫瘤CD8+T細胞上調(diào)脂肪酸氧化途徑。因此，腫瘤基質(zhì)的獨特特征可能成為新穎療法的切入點。

2.3 侵襲和轉(zhuǎn)移 侵襲和轉(zhuǎn)移代表了一個高度復(fù)雜的過程，是大多數(shù)癌癥患者死亡的原因之一[36]。

Kim等[37]研究了轉(zhuǎn)移性肺腺癌的單細胞轉(zhuǎn)錄組分析。從44例患者的正常組織或早期或轉(zhuǎn)移癌的208,506個細胞中，確定了偏離正常分化軌跡并主導(dǎo)轉(zhuǎn)移的癌細胞亞型。在所有階段，基質(zhì)和免疫細胞的動態(tài)變化創(chuàng)造了促腫瘤和免疫抑制的微環(huán)境。

循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells, CTCs）是指從腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落進入外周血液循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細胞[38]。CTCs是液體活檢的主要靶點，是腫瘤預(yù)后監(jiān)測的重要生物標(biāo)志物。研究[39]表明，肺癌患者CTCs數(shù)量與臨床不良預(yù)后相關(guān)?；趩渭毎麥y序技術(shù)研究肺癌患者的CTC，不僅可以發(fā)現(xiàn)新的CTC生物標(biāo)志物，還可以在分子水平上揭示腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移機制。Ni等[40]通過全基因組測序觀察到特征性的癌癥相關(guān)的單核苷酸變異和CTC外顯子組中的插入/缺失。來自單個患者的每個CTC，無論癌癥亞型如何，表現(xiàn)出的拷貝數(shù)變異（copy number variation,CNV）具有高度一致性，表明CNV與腫瘤的轉(zhuǎn)移可能相關(guān)，為今后基于CNV的肺癌診斷和治療提供思路。

小細胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）因較難獲得組織標(biāo)本無法直接對其進行單細胞測序，通過對CTC單細胞測序或可推斷SCLC進化和進展。Su等[41]通過對化療期間的SCLC患者的CTC進行單細胞測序來監(jiān)測體細胞突變和拷貝數(shù)變化（copy number alteration, CNA）?；趩蝹€CTC建立的CNA評分是SCLC患者化療后臨床結(jié)局的可能預(yù)測指標(biāo)。該研究結(jié)果顯示，與高CNA評分（≥0）相比，低CNA評分（<0）的患者在一線化療后的無進展生存期和總生存期均顯著延長（PFS: 212 d vs 110.5 d, P=0.004,2; OS:223.5 d vs 424 d, P=0.000,6）。

2.4 治療反應(yīng)和耐藥性 盡管采取積極的治療措施，肺癌患者5年生存率仍只有19.8%[42]，一部分患者會復(fù)發(fā)，甚至發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。盡管一部分復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者可以從免疫檢查點抑制劑獲益，但大多數(shù)患者預(yù)后很差[43]。人們對治療失敗的腫瘤分子和遺傳基礎(chǔ)以及患者對治療反應(yīng)的預(yù)測能力的了解仍是初級的，通過單細胞測序技術(shù)可能能夠?qū)ζ溆懈钊氲牧私狻?/p>

Min等[44]分析了從人肺腺癌患者異種移植的34個單細胞中獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，使用基因模塊G64進行聚類分析，G64模塊主要由細胞周期基因組成。他們發(fā)現(xiàn)根據(jù)基因模塊G64的上調(diào)/下調(diào)可將34個單細胞明確分為兩組，同樣根據(jù)G64模塊的表達可以將TCGA數(shù)據(jù)庫中的488例肺腺癌患者分組。G64模塊的高表達可能與肺腺癌患者的不良預(yù)后相關(guān)。

Kim等[45]從1例肺腺癌患者的異種移植瘤中分離出34例患者來源的異種移植（patient‐derived xenograft, PDX）細胞。對單個腫瘤細胞進行scRNA‐seq基因表達譜分析和表達突變譜分析。存活的PDX細胞上的scRNA‐seq鑒定出與抗癌藥物耐藥性相關(guān)的候選腫瘤細胞亞群。根據(jù)激活的KRAS突變和風(fēng)險評分（risk scores, RS）的預(yù)后價值，表達KRASG12D和高RS的PDX細胞可能是耐藥的。

揭示肺癌內(nèi)部腫瘤細胞的亞群分布將有助于尋找到具有抗藥能力的亞群，為肺癌患者的個性化治療提供基礎(chǔ)，單細胞測序技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)新的細胞亞群，從而研發(fā)新的靶向治療藥物。Guo等[29]通過對14例NSCLC患者外周血、癌及癌旁組織中的T淋巴細胞進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，分析鑒定出肺癌T細胞群體的組成，為特異性靶向T細胞亞群的免疫治療方法提供了新的靶標(biāo)。

3 總結(jié)與展望

目前進行的一系列工作已經(jīng)可以在細胞水平上定義異質(zhì)性，單細胞轉(zhuǎn)錄組測序是研究人類腫瘤最先進和最廣泛的一種SCS技術(shù)，迄今對惡性、免疫和基質(zhì)細胞亞群以及促進侵襲和轉(zhuǎn)移的細胞間相互作用具有新穎發(fā)現(xiàn)。通過了解腫瘤的各個亞群分布，識別腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，認識腫瘤微環(huán)境的構(gòu)成，為今后的臨床研究和個性化治療提供了指導(dǎo)方向。但是單細胞測序仍存在較多的問題有待改善，如基因組和轉(zhuǎn)錄組在擴增時應(yīng)盡量提高覆蓋率；降低測序過程中的技術(shù)噪音；提高單細胞的分離水平等?？偟膩碚f，單細胞測序技術(shù)的應(yīng)用必將大大推動肺癌研究的進一步發(fā)展。