黃科文，姚 歡，馬倩倩，吳彩芳，廖明安，林立金*

（1．四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，四川 成都 611130；2．四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610064；3．達(dá)州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，四川 達(dá)州 635000；4．四川農(nóng)業(yè)大學(xué)果蔬研究所，四川 成都 611130）

隨著現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，我國(guó)土壤受到重金屬污染的情況越來越嚴(yán)重，中國(guó)已有19.4%耕地土壤被污染，按照1.2×108hm2耕地計(jì)算，污染面積約達(dá)0.23×108hm2［1］，其中，鎘被認(rèn)為是土壤重金屬污染中最主要的元素［2］。目前，對(duì)于重金屬污染土壤的修復(fù)，采用最多的是植物修復(fù)技術(shù)。植物修復(fù)技術(shù)是指通過特殊的超富集植物對(duì)重金屬的提取，清除土壤中的重金屬，從而達(dá)到修復(fù)土壤的目的，是一項(xiàng)對(duì)環(huán)境友好且具有廣闊應(yīng)用前景的技術(shù)，但已知的超富集植物大多個(gè)體矮小、生物量低、生長(zhǎng)緩慢，修復(fù)效率受到很大影響［3-4］。適當(dāng)?shù)霓r(nóng)藝措施可以提高修復(fù)植物的生物量，提高植物對(duì)重金屬的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)能力，進(jìn)而來提高植物的修復(fù)效率，促進(jìn)該技術(shù)的推廣應(yīng)用［4-7］。

嫁接是一種改良超富集植物的新方法，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)嫁接能夠提高超富集植物后代的生物量與鎘含量，即嫁接能夠提高超富集植物的鎘修復(fù)能力，并且由嫁接引起的表觀遺傳變異（鎘修復(fù)能力）能夠比較穩(wěn)定地在植物后代中傳遞［8-9］。在理論上，嫁接是一種無性繁殖技術(shù)，嫁接的后代不會(huì)發(fā)生性狀的改變，但有學(xué)者認(rèn)為，嫁接后的植物會(huì)誘導(dǎo)其自身調(diào)控以應(yīng)對(duì)不利環(huán)境，從而產(chǎn)生變異［10］，進(jìn)而提高植物對(duì)脅迫環(huán)境的抗性［11］。這種在不利環(huán)境中所產(chǎn)生的變異，如嫁接可以導(dǎo)致一定頻率的DNA 甲基化模式的發(fā)生，可使基因表達(dá)發(fā)生改變并傳遞給后代［12］。嫁接使來自不同植株的砧木與接穗連接在一起，并進(jìn)一步形成一個(gè)完整植株［13］，嫁接植株的生長(zhǎng)發(fā)育和生理生化特性受到了砧木、接穗互作的復(fù)雜影響［14-15］。有研究表明，嫁接導(dǎo)致一定頻率的DNA 甲基化模式的變化在接穗發(fā)生的變化更為劇烈［16］，嫁接黃瓜對(duì)Cd 的吸收依賴于砧木基因型［17］，因此，不同的砧木、接穗互作產(chǎn)生的影響不同，對(duì)嫁接后代的生長(zhǎng)及鎘積累影響也不同［18］。

本試驗(yàn)以鎘超富集植物牛膝菊（Galinsoga parviflora）作為研究對(duì)象，將生長(zhǎng)發(fā)育和生理生化特性上存在差異的2 種生態(tài)型（礦山和農(nóng)田）的牛膝菊［19］進(jìn)行相互嫁接，研究砧穗互作對(duì)牛膝菊嫁接后代鎘積累的影響，以期為植物修復(fù)技術(shù)的推廣應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)雅安校區(qū)農(nóng)場(chǎng)（30°23′ N，103°48′ E）位于四川省雅安市雨城區(qū)，平均海拔620 m，屬亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候區(qū)，多年平均氣溫16.2℃，多年平均降水量為1 743.3 mm，多年平均日照1 035 h，多年平均蒸發(fā)量為1 011.2 mm［20］。唐家鉛鋅礦區(qū)（29°24′ E，102°38′ E）位于四川省雅安市漢源縣唐家鄉(xiāng)，平均海拔890 m。礦區(qū)地處北溫帶與季風(fēng)帶之間的山地亞熱帶氣候區(qū)，具有典型的干熱河谷氣候特點(diǎn)，多年平均氣溫17.9 ℃，多年平均降水量為741.8 mm，多年平均日照1 475.8 h，多年平均蒸發(fā)量為1 248.2 mm［20］。

1.2 材料準(zhǔn)備

牛膝菊種子于2015 年9 月分別采自四川省雅安市漢源縣唐家山鉛鋅礦區(qū)（礦山生態(tài)型）和四川農(nóng)業(yè)大學(xué)雅安校區(qū)農(nóng)場(chǎng)農(nóng)田（農(nóng)田生態(tài)型）。2015年10 月，將上述牛膝菊種子分別播種育苗，待株高約6 cm（處于快速生長(zhǎng)階段）時(shí)進(jìn)行嫁接處理。（1）礦山生態(tài)型不嫁接處理（礦山）:直接將礦山生態(tài)型牛膝菊幼苗移栽種植，收集種子保存。（2）農(nóng)田生態(tài)型不嫁接處理（農(nóng)田）:直接將農(nóng)田生態(tài)型牛膝菊幼苗移栽種植，收集種子保存。（3）礦山生態(tài)型作為砧木嫁接（礦山砧木/農(nóng)田接穗）:將一株株高6 cm 的礦山生態(tài)型牛膝菊剪斷，留3 對(duì)真葉作為砧木，接穗為另一株株高為6 cm 的農(nóng)田生態(tài)型牛膝菊的上部苗（留1 對(duì)真葉）進(jìn)行嫁接，分別收集砧木和接穗的種子。（4）農(nóng)田生態(tài)型作為砧木嫁接（農(nóng)田砧木/礦山接穗）:將一株株高6 cm 的農(nóng)田生態(tài)型牛膝菊剪斷，留3 對(duì)真葉作為砧木，接穗為另一株株高6 cm 的礦山生態(tài)型牛膝菊的上部苗（留1 對(duì)真葉）進(jìn)行嫁接，分別收集砧木和接穗的種子。嫁接方法為劈接法，用寬約1 cm、長(zhǎng)20 cm 的塑料帶進(jìn)行綁縛，使砧木與接穗的結(jié)合部分牢牢地貼在一起。嫁接后根據(jù)土壤水分實(shí)際情況不定期澆水，保持土壤田間持水量為80%，用地膜覆蓋保濕，并用遮陽網(wǎng)遮光降溫。10 d 后逐步移除地膜和遮陽網(wǎng)煉苗，并取下綁縛的塑料薄膜。待牛膝菊果實(shí)成熟后，分別收集未嫁接、正反嫁接處理的砧木及接穗的后代種子保存，分別記為:礦山不嫁接（礦山）、農(nóng)田不嫁接（農(nóng)田）、礦山砧木（礦砧）、農(nóng)田砧木（農(nóng)砧）、礦山接穗（礦穗）、農(nóng)田接穗（農(nóng)穗）。

試驗(yàn)土壤為砂壤土，取自成都市溫江區(qū)農(nóng)田，其基本理化特性為:pH 值7.09，全氮1.50 g·kg-1，全磷0.76 g·kg-1，全鉀18.02 g·kg-1，全鎘1.96 mg·kg-1，堿解氮94.82 mg·kg-1，有效磷6.30 mg·kg-1，速效鉀149.59 mg·kg-1，其中供試土壤背景有效鎘含量未檢出。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2015 年3 ～6 月在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)成都校區(qū)進(jìn)行。2015 年3 月，將土風(fēng)干、壓碎、過6.72 mm 篩后，稱取2.5 kg 裝于21 cm×20 cm（高×直徑）的塑料盆內(nèi)，分別加入50 mg·kg-1的鎘，鎘的加入形式為分析純的CdCl2·2.5H2O，使其與土壤充分混勻，保持土壤田間持水量的80%，自然放置平衡4 周，不定期翻土混合，使土壤充分混合均勻。2015 年4 月，將收集的嫁接后代種子放于種子發(fā)芽箱中進(jìn)行發(fā)芽育苗，培育基質(zhì)為無污染試驗(yàn)土壤與營(yíng)養(yǎng)土以2∶1 混合而成，育苗箱內(nèi)溫度為25℃，濕度為80%，光照為4 000 Lux。待幼苗高約3 cm，2 片真葉展開時(shí)移栽于裝有含鎘土壤盆中，每盆種植4 株。試驗(yàn)處理分別為:礦山、農(nóng)田、礦砧、農(nóng)砧、礦穗、農(nóng)穗，每個(gè)處理重復(fù)3 次。在整個(gè)生長(zhǎng)過程中不定期的交換盆與盆的位置以減弱邊際效應(yīng)的影響，并及時(shí)去除雜草，防治病蟲害。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目與方法

待牛膝菊處于盛花期時(shí)（2015 年6 月），測(cè)定牛膝菊葉片光合色素（葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量及類胡蘿卜素）含量、可溶性蛋白和超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性［21］。之后，整株收獲，并采集土壤備用。用自來水將牛膝菊植株上的泥土洗凈，再用去離子水反復(fù)沖洗，于105℃下殺青15 min，70℃烘至恒重。分別測(cè)定植株根系、莖稈、葉片的生物量及鎘含量。稱取0.500 g 植物樣品，加入硝酸-高氯酸（體積比為4∶1）放置12 h 后消化至溶液透明，過濾，定容至50 mL，用iCAP 6300 型ICP 光譜儀（Thermo Scientific，USA）測(cè)定鎘含量。土壤樣品風(fēng)干后，過1 mm 篩，采用pH 計(jì)測(cè)定土壤pH 值（土水比為1∶2.5），土壤有效態(tài)鎘含量用0.005 mol·L-1DTPA-TEA 浸提（土液比1∶2.5）［22］，用iCAP 6300 型ICP 光譜儀測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 及SPSS 17.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。根冠比=根系干重/地上部干重［22］，地上部分富集系數(shù)（BCF）=地上部分鎘含量/土壤鎘含量［23］，轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)（TF）=地上部分鎘含量/根系鎘含量［23］。

2 結(jié)果與分析

2.1 嫁接對(duì)牛膝菊后代生物量的影響

在鎘脅迫條件下，農(nóng)穗根系生物量較農(nóng)田提高了26.67%（P＜0.05），礦砧較礦山降低了18.18%（P＜0.05，表1）。就地上部分生物量而言，農(nóng)穗及農(nóng)砧地上部生物量較農(nóng)田無顯著變化；礦穗和礦砧較礦山分別顯著降低（P＜0.05）了12.64%和18.39%。對(duì)于整株生物量而言，除礦砧較礦山顯著降低了17.59%（P＜0.05）外，其余處理整株生物量均無顯著變化。牛膝菊根冠比由大到小順序?yàn)?農(nóng)穗＞農(nóng)砧＞農(nóng)田，礦穗＞礦砧＞礦山。

表1 嫁接對(duì)牛膝菊后代生物量的影響

2.2 嫁接對(duì)牛膝菊后代光合色素含量的影響

由表2 可以看出，在鎘脅迫條件下，農(nóng)穗的葉綠素a 含量、葉綠素b 含量及葉綠素總量較農(nóng)田顯著降低（P＜0.05），分別降低了17.14%、10.34%和17.75%，而農(nóng)砧較農(nóng)田無明顯變化。礦穗、礦砧的葉綠素a 含量、葉綠素b 含量及葉綠素總量較礦山均顯著降低。牛膝菊嫁接后代的類胡蘿卜素含量均有顯著下降，農(nóng)穗、礦砧、礦穗、農(nóng)砧分別較各自對(duì)照降低了21.90%（P＜0.05）、26.92%（P＜0.05）、16.40%（P＜0.05）和28.72%（P＜0.05）。

表2 嫁接對(duì)牛膝菊后代光合色素含量的影響 （mg·g-1）

2.3 嫁接對(duì)牛膝菊后代可溶性蛋白含量及抗氧化酶活性的影響

嫁接改變了在鎘脅迫條件下牛膝菊后代可溶性蛋白含量及抗氧化酶活性（表3）。農(nóng)穗的可溶性蛋白質(zhì)含量顯著低于農(nóng)田，其余處理較各自對(duì)照無顯著變化。就SOD 活性而言，農(nóng)砧顯著降低了2.69%（P＜0.05），礦穗顯著升高了17.85%（P＜0.05），礦砧顯著升高了13.99%（P＜0.05）。但農(nóng)穗、礦砧、農(nóng)砧和礦穗的POD 活性均較各自對(duì)照顯著升高，分別升高了36.30%（P＜0.05）、64.47%（P＜0.05）、9.99%（P＜0.05）和7.53%（P＜0.05）。從CAT 活性來看，礦砧顯著降低了12.73%（P＜0.05），礦穗顯著升高了352.73%（P＜0.05），農(nóng)穗及農(nóng)砧較農(nóng)田無明顯變化。因此嫁接可以提高牛膝菊后代的抗氧化酶活性，以此來提高對(duì)鎘的抗性。

表3 嫁接對(duì)牛膝菊后代蛋白質(zhì)含量及抗氧化酶活性的影響

2.4 嫁接對(duì)牛膝菊后代鎘含量的影響

在鎘脅迫條件下，牛膝菊嫁接后代根系鎘含量的大小順序?yàn)?礦穗＞礦山＞農(nóng)田＞農(nóng)穗＞礦砧＞農(nóng)砧（表4）。農(nóng)穗及農(nóng)砧根系鎘含量較農(nóng)田顯著降低，分別降低了1.89%（P＜0.05）和13.88%（P＜0.05）；礦砧根系鎘含量較礦山降低了26.13%（P＜0.05），但礦穗較礦山顯著升高了15.15%（P＜0.05）。從地上部分鎘含量來看，農(nóng)穗及農(nóng)砧較農(nóng)田顯著降低，分別降低了5.96%（P＜0.05）和9.23%（P＜0.05），礦砧較礦山無明顯變化，但礦穗較礦山顯著升高了9.81%（P＜0.05）。整株鎘含量的大小順序與根系鎘含量變化一致，農(nóng)穗、農(nóng)砧及礦砧整株鎘含量分別較各自對(duì)照降低了4.79%（P＜0.05）、10.05%（P＜0.05）和7.96%（P＜0.05），礦穗整株鎘含量較礦山升高了10.87%（P＜0.05）。牛膝菊嫁接后代地上部分富集系數(shù)大小順序?yàn)?農(nóng)田＞農(nóng)穗＞農(nóng)砧，礦穗＞礦砧＞礦山；轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)由大到小為:農(nóng)砧＞農(nóng)田＞農(nóng)穗，礦砧＞礦山＞礦穗，說明嫁接提高了礦穗、礦砧對(duì)鎘的富集能力，促進(jìn)了農(nóng)砧、礦砧鎘從根系向地上部分的轉(zhuǎn)運(yùn)。

表4 嫁接對(duì)牛膝菊后代鎘含量的影響

2.5 牛膝菊嫁接后代對(duì)土壤有效鎘含量及土壤pH的影響

種植牛膝菊嫁接后代的土壤中，礦穗的土壤pH 值較礦山顯著升高，其余處理均無顯著變化（表5）。牛膝菊嫁接后代除了農(nóng)砧外，其余嫁接后代均顯著降低了土壤有效態(tài)鎘含量（表5）。農(nóng)穗的土壤有效態(tài)鎘含量最低，礦山的土壤有效態(tài)鎘含量最高，農(nóng)穗、礦穗及礦砧均較各自對(duì)照顯著降低，分別降低了5.16%（P＜0.05）、3.94%（P＜0.05）和6.75%（P＜0.05）。

表5 牛膝菊嫁接后代對(duì)土壤有效鎘含量及土壤pH 值的影響

3 討論與結(jié)論

嫁接過程中，不同的砧木、接穗互作產(chǎn)生的影響不同，對(duì)植株的生長(zhǎng)影響也不同［18］。從試驗(yàn)結(jié)果來看，在鎘脅迫條件下，與未嫁接相比，以農(nóng)田型為砧木、礦山型為接穗的嫁接處理，其后代農(nóng)砧、礦穗根系及整株生物量差異不顯著；以礦山型為砧木、農(nóng)田型為接穗的嫁接處理，其后代農(nóng)穗根系生物量顯著提高，整株生物量差異不顯著，但礦砧根系及整株生物量顯著降低。就光合色素而言，牛膝菊嫁接后代光合色素含量的差異不顯著或略有降低。表明，不同生態(tài)型牛膝菊的相互嫁接對(duì)于后代的生長(zhǎng)影響不同，這主要是由于不同生態(tài)環(huán)境的差異，不同生態(tài)型植物在形態(tài)和生理上也存在差異［19］。這種生態(tài)型間的差異在牛膝菊嫁接后代的生長(zhǎng)表現(xiàn)為:農(nóng)田型砧木對(duì)于嫁接后代的生長(zhǎng)影響高于礦山型砧木。

在脅迫環(huán)境條件下，植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的超氧陰離子會(huì)被抗氧化酶清除，清除效率與抗氧化酶活性有關(guān)，嫁接可以提高植物的抗氧化酶活性［24］并通過被改變的DNA 模式傳遞給后代［25］。在本試驗(yàn)中，除了農(nóng)穗的可溶性蛋白含量較對(duì)照顯著降低，其余嫁接后代則變化不明顯；與未嫁接相比，POD 活性均顯著提高，礦穗CAT 活性顯著升高，礦穗、礦砧SOD 活性均顯著升高；農(nóng)穗、農(nóng)砧CAT 活性差異不顯著，但農(nóng)穗（P＞0.05）、農(nóng)砧（P＜0.05）SOD 活性降低。表明，嫁接對(duì)牛膝菊后代的可溶性蛋白含量的影響總體上不明顯，但對(duì)牛膝菊后代抗氧化酶的影響存在差異，嫁接在總體上提高了牛膝菊后代抗氧化酶活性，提高了對(duì)鎘的耐性，尤其是對(duì)礦山型牛膝菊嫁接后代（礦穗、礦砧），可能是因?yàn)榈V山生態(tài)型的牛膝菊對(duì)鎘脅迫的耐性大于農(nóng)田生態(tài)型［19］。

植物對(duì)重金屬的吸收主要集中在根際環(huán)境中，根系分泌物在重金屬污染的土壤中可以改變重金屬的化學(xué)行為與生態(tài)行為，從而改變重金屬的有效性和對(duì)植物的毒性［26-27］。植物根系分泌物的主要成分為低分子量有機(jī)酸，總量高于普通植物的低分子量有機(jī)酸，降低了超富集植物根際周圍土壤pH 值，與土壤中的鎘形成復(fù)合物，增加了土壤鎘的有效性，促進(jìn)了超富集植物對(duì)鎘的吸收［27-28］。從試驗(yàn)結(jié)果來看，與未嫁接相比，礦穗根系及整株鎘含量顯著提高，其余嫁接后代鎘含量均顯著降低；除了礦穗土壤pH 值顯著提高，其余嫁接后代在土壤pH 值上變化并不顯著；嫁接處理降低了土壤有效態(tài)鎘含量。表明，嫁接促進(jìn)了礦穗對(duì)鎘的吸收，且富集能力高于其他嫁接后代（礦穗地上富集系數(shù)最大），使其根系及整株鎘含量顯著提高；嫁接提高了礦穗對(duì)鎘的富集能力的同時(shí)也顯著提高了土壤pH 值，進(jìn)而降低了土壤有效態(tài)鎘含量，降低了普通植物可吸收的鎘的來源，有利于土壤重金屬鎘污染的修復(fù)。

綜上所述，在重金屬鎘污染下，砧穗互作能夠影響牛膝菊嫁接后代的鎘積累，且不同生態(tài)型相互嫁接能在一定程度上降低或提高牛膝菊后代的鎘含量。與未嫁接的農(nóng)田礦山相比，牛膝菊嫁接后代礦穗的根系及整株生物量、可溶性蛋白差異不顯著，抗氧化酶活性、植株的鎘含量、土壤pH 值均顯著提高，土壤有效態(tài)鎘含量顯著下降。嫁接使得牛膝菊發(fā)生了可遺傳變異［19］，嫁接顯著地提高了牛膝菊后代礦穗對(duì)鎘的耐性，提高了對(duì)鎘的富集能力，且促進(jìn)對(duì)鎘吸收的同時(shí)提高了土壤pH 值，進(jìn)而降低了土壤有效態(tài)鎘含量，降低了普通植物可吸收的鎘的來源。因此，相互嫁接是一種改良超富集植物的新方法，適當(dāng)?shù)募藿犹幚砜商岣咧参锏男迯?fù)效率，有利于土壤重金屬鎘污染的修復(fù)，在本試驗(yàn)中，2 種生態(tài)型（礦山生態(tài)型和農(nóng)田生態(tài)型）牛膝菊相互嫁接，以農(nóng)田型為砧木、礦山型為接穗的嫁接后代——礦穗對(duì)重金屬鎘污染的修復(fù)效果好。