張彩霞

摘 要 以隴南無刺花椒嫩葉為外植體材料，研究不同消毒劑種類、不同消毒時間的消毒效果和不同配方的培養(yǎng)基對愈傷組織誘導(dǎo)率及芽分化率的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明：無刺花椒嫩葉用0.1% HgCl2消毒6 min，或用2% NaClO消毒15 min均能達(dá)到較好的消毒效果且成活率高;誘導(dǎo)愈傷最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg·L-1+2，4-

D 0.3 mg·L-1;誘導(dǎo)不定芽最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1。

關(guān)鍵詞 無刺花椒;離體培養(yǎng);外植體;再生體系

中圖分類號：S792.99 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2021.30.090

花椒屬蕓香科花椒屬落葉小喬木，是我國主要的香料和油料作物，近年來種植效益較高，人們種植的積極性也很高[1]。但由于花椒的枝干上均密生皮刺，其采摘困難，費(fèi)時費(fèi)工，制約了花椒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。雖然經(jīng)過多年的試驗(yàn)，但目前仍然未能找到很好代替人工采摘的機(jī)械或化學(xué)方法，因此，選用和種植無刺花椒是解決花椒采摘難、采摘成本高這一問題的主要途徑[2]。

目前，我國無刺花椒品種資源較為豐富，有從日本引進(jìn)的葡萄山椒、朝倉花椒，我國自己培育出的隴南無刺椒、農(nóng)城1號、漢源無刺花椒等[3]。這些無刺花椒品種利用實(shí)生繁殖常會發(fā)生無刺性狀變異的現(xiàn)象[4]，因此目前普遍采用無性繁殖。植物組織培養(yǎng)與傳統(tǒng)無性繁殖技術(shù)相比，能保持品種的優(yōu)良性狀，并且繁殖速度快、效率高，因此通過離體培養(yǎng)在短期內(nèi)獲得性狀穩(wěn)定的大量優(yōu)良無刺花椒種苗，是促進(jìn)無刺花椒發(fā)展的有效途徑[5-6]。以隴南無刺花椒嫩葉為材料，研究了不同消毒劑種類和不同消毒時間對外植體消毒效果的影響和不同配方的培養(yǎng)基對愈傷組織誘導(dǎo)率及芽分化率的影響，建立了初代離體再生體系，以期為無刺花椒種苗的工廠化生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

隴南無刺花椒，采集于甘肅省武都區(qū)，選擇具有典型性狀、無病蟲害的健壯無刺花椒植株，剪取當(dāng)年生新梢，選取幼嫩葉片為外植體材料。試驗(yàn)于甘肅林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院林木組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒處理

將選取的嫩枝剪下葉片，沿中脈將葉片剪成1～2 cm2的小塊，置于燒杯中流水沖洗60 min，然后將材料于70%的酒精中浸泡30 s，無菌水沖洗3～4次，再分別用0.1% HgCl2和2% NaClO進(jìn)行消毒處理（0.1% HgCl2處理時間分別為3 min、6 min、8 min，2% NaClO處理時間分別為8 min、12 min、15 min）。最后用無菌水沖洗3～5次，然后將消毒好的嫩葉切成0.5 cm2的小塊，接種在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種10～15 d后觀察污染、死亡及啟動情況：有菌斑出現(xiàn)，即統(tǒng)計為污染，按瓶數(shù)計算;外植體保持新鮮，沒有出現(xiàn)變黑死亡，且10 d后葉片周圍切口出現(xiàn)膨大腫脹，說明成活，成活率按照成活外植體數(shù)占接種葉片總塊數(shù)的百分比來計算。

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo)

以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加蔗糖30 g·L-1、瓊脂6 g·L-1，將pH值調(diào)至5.8～6.0。誘導(dǎo)外植體材料產(chǎn)生愈傷組織的培養(yǎng)基為MS+6-BA（0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1）+2，4-D（0.1 mg·L-1、0.3 mg·L-1、0.5 mg·L-1），共9個處理，每個處理20瓶，3次重復(fù)。15 d后統(tǒng)計不同植物激素濃度配比下無刺花椒愈傷組織誘導(dǎo)率，用產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)量占培養(yǎng)外植體總數(shù)量的百分比表示。設(shè)置培養(yǎng)溫度（25±1）℃，光照時間12 h·d-1，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx。

1.2.3 芽誘導(dǎo)

誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生愈傷組織后，選擇生長良好的愈傷組織，將其分離，轉(zhuǎn)接于不同激素配比的培養(yǎng)基中，配方為MS+6-BA（0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1）+NAA（0.1 mg·L-1、0.2 mg·L-1、0.3 mg·L-1），誘導(dǎo)愈傷組織再分化產(chǎn)生不定芽，統(tǒng)計芽分化率及芽生長狀況，用誘導(dǎo)產(chǎn)生芽的愈傷組織數(shù)占培養(yǎng)的總愈傷組織的百分比來表示。共9個處理，每處理接種20瓶，3次重復(fù)。培養(yǎng)條件同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒處理對外植體消毒效果的影響

外植體消毒接種10 d后開始觀察統(tǒng)計污染情況及外植體存活率，發(fā)現(xiàn)各處理均有不同程度的污染，污染類型多為白色、灰色霉菌污染及黏液狀白色細(xì)菌污染，菌落主要在外植體邊緣的培養(yǎng)基上，隨著時間的推移菌斑會向外擴(kuò)散，污染嚴(yán)重的會長滿整個培養(yǎng)基表面，說明污染是由于外植體消毒不徹底造成的。2種不同消毒劑消毒效果見表1。從表1可以看出，0.1% HgCl2在3種不同消毒時間處理下污染率平均較2% NaClO處理的低，成活率總體也較2% NaClO處理的低，而且隨著2% NaClO消毒時間延長，外植體成活率沒有降低。在使用0.1% HgCl2消毒的3個處理中，消毒6 min污染率較低，為18.3%，而外植體成活率較其他2個處理要高，為55.3%;在使用2% NaClO消毒的3個處理中，消毒15 min污染率較低，為13.3%，外植體成活率最高，為62.8%。說明隴南無刺花椒嫩葉采用70%酒精處理30 s后，再用0.1% HgCl2消毒6 min，或者用2% NaClO消毒15 min均能達(dá)到較好的消毒效果且能保證較高的外植體成活率。

2.2 不同激素濃度配比對外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響

在誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生愈傷組織的試驗(yàn)中，共9個處理，激素配比組合如表2所示。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)基中添加6-BA和2，4-D濃度較低時，愈傷組織的誘導(dǎo)率較低，觀察發(fā)現(xiàn)愈傷組織生長也較為緩慢，但愈傷組織的質(zhì)地較好，松散且顏色呈淡黃綠色。隨著培養(yǎng)基中6-BA和2，4-D的濃度升高，愈傷組織誘導(dǎo)率有較大的提高，當(dāng)6-BA濃度為1.0 mg·L-1、2，4-D濃度為0.3 mg·L-1和0.5 mg·L-1時，愈傷組織誘導(dǎo)率最高，分別為65.9%和60.6%。但當(dāng)6-BA濃度繼續(xù)增加，愈傷組織誘導(dǎo)率開始降低，且愈傷組織質(zhì)地致密;當(dāng)在培養(yǎng)基中添加相同濃度的6-BA時，隨著2，4-D濃度增大，愈傷組織誘導(dǎo)率會提高，但增加到0.5 mg·L-1時又呈下降趨勢，而且部分愈傷組織出現(xiàn)褐化。從表2中可以看出，培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 1.0 mg·L-1+2，4-D 0.3 mg·L-1愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為65.9%，誘導(dǎo)的愈傷組織結(jié)構(gòu)松散、色澤鮮艷，增殖能力強(qiáng)。

2.3 不同激素濃度配比對芽分化率的影響

初代培養(yǎng)誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生愈傷組織，之后將生長良好的愈傷組織轉(zhuǎn)入添加了不同濃度的6-BA和NAA的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行分化誘導(dǎo)，統(tǒng)計不定芽分化率，結(jié)果見表3。從表3可以看出，不同濃度6-BA與NAA組合，對無刺花椒愈傷組織誘導(dǎo)分化不定芽有顯著的影響，隨著6-BA濃度的提高，芽分化率有所提高，但濃度過高會反而會抑制芽的分化，且隨著6-BA濃度的提高芽分化的數(shù)量增加，但由于芽的密度過大導(dǎo)致芽生長細(xì)弱、顏色發(fā)黃。因此適宜的濃度配比才能同時保證較高的芽分化率和芽質(zhì)量。在9個濃度配比中，當(dāng)6-BA濃度為

1.0 mg·L-1、NAA濃度為0.3 mg·L-1時，芽分化率最高，為82.6%，并且不定芽粗壯顏色深，生長良好，其次是6-BA濃度為1.0 mg·L-1、NAA濃度為0.2 mg·L-1時，芽分化率較高，為80.7%。因此篩選出誘導(dǎo)無刺花椒不定芽分化的最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1。

3 結(jié)論與討論

在離體培養(yǎng)過程中，外植體的消毒是影響培養(yǎng)成功的關(guān)鍵因子之一，而消毒劑的選擇和消毒時間的把控是外植體消毒的關(guān)鍵。通過2種不同的消毒劑對無刺花椒嫩葉進(jìn)行消毒處理，發(fā)現(xiàn)用70%酒精處理30 s后，再用0.1% HgCl2消毒6 min，和用2% NaClO消毒15 min均能達(dá)到較好的消毒效果且能保證較高的外植體成活率。HgCl2是消毒作用強(qiáng)且常用的一種消毒劑，但其對人體有一定危害，且容易殘留在外植體材料中不容易清除[7]，對外植體材料的生活力損害較大，試驗(yàn)結(jié)果也表明隨著HgCl2消毒時間增加，外植體的成活率會下降。而2% NaClO隨著消毒時間延長外植體成活率無明顯下降，且對人體安全無毒，因此在生產(chǎn)和科研中可以利用NaClO替代HgCl2作為常用的消毒劑。

誘導(dǎo)外植體材料產(chǎn)生優(yōu)質(zhì)的愈傷組織是無刺花椒離體培養(yǎng)建立再生體系、進(jìn)而產(chǎn)生完整試管苗的基礎(chǔ)，是離體培養(yǎng)的重要階段。選用MS基本培養(yǎng)基加入1.0 mg·L-1?6-BA和0.3 mg·L-1 2，4-D，對隴南無刺花椒愈傷組織誘導(dǎo)率最高，誘導(dǎo)的愈傷組織結(jié)構(gòu)松散、色澤鮮艷，增殖能力強(qiáng)。初代培養(yǎng)誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生的愈傷組織，選擇生長良好的將其轉(zhuǎn)入添加不同濃度的6-BA和NAA的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)芽的分化，結(jié)果表明，誘導(dǎo)無刺花椒不定芽分化的最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1，試驗(yàn)結(jié)果為無刺花椒試管苗的生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

目前有關(guān)無刺花椒組織培養(yǎng)的研究較少。以隴南無刺花椒嫩葉作為外植體，獲得了較高的愈傷組織誘導(dǎo)和芽分化率，篩選出無刺花椒初代培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基，建立了無菌再生體系。未來在初代培養(yǎng)研究的基礎(chǔ)上，還要進(jìn)一步研究繼代增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)技術(shù)，建立穩(wěn)定的離體快繁技術(shù)體系，擴(kuò)大規(guī)模，形成生產(chǎn)化模式，為無刺花椒良種繁育提供技術(shù)支撐。

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（責(zé)任編輯：趙中正）