陳 江，王俊蘇，關(guān)天橫，聶福平，李 貴，張國波，王國民△

（1.重慶海關(guān)技術(shù)中心，重慶400020；2.重慶玉成產(chǎn)品質(zhì)量檢測有限公司，重慶401120；3.重慶奧凱科技有限公司，重慶401121）

注射劑的無菌性直接關(guān)系患者的生命安全。注射劑在其整個生命周期內(nèi)必須符合無菌的要求并能通過無菌檢查［1-2］。但無菌檢查存在局限性，美國食品和藥物管理局（FDA）建議在穩(wěn)定性研究中，使用密封完整性檢測來替代無菌檢查。密封完整性檢測不但能確保注射劑的無菌，還能保障注射劑在有效期內(nèi)符合質(zhì)量標準的要求。美國、歐盟、日本、澳大利亞、巴西、加拿大等國家和地區(qū)均頒布法律法規(guī)，要求注射劑包裝具有密封完整性［3］。2020年5月14日，國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心（CDE）發(fā)布了《化學藥品注射劑仿制藥質(zhì)量和療效一致性評價技術(shù)要求》，規(guī)定在注射劑穩(wěn)定性考察初期和末期以外的其他時間節(jié)點，可以經(jīng)過方法學驗證的密封完整性檢測代替無菌檢查。密封完整性檢測已成為注射劑穩(wěn)定性研究的重要組成部分，且成為注射劑一致性評價關(guān)注的熱點。本研究中以“注射劑”“包裝”“密封性”“密封完整性”“sterile product”“parenteral”“package”“container closure integrity”“l(fā)eakage”“l(fā)eak”等為關(guān)鍵詞，對PubMed、Elsevier、Springer、中國知網(wǎng)、維普、萬方等國內(nèi)外數(shù)據(jù)庫中收錄的1960年1月至2020年2月期間發(fā)表的文獻進行單一或組合搜索，共檢索到相關(guān)文獻752篇，其中有效文獻48篇?，F(xiàn)結(jié)合文獻對注射劑包裝密封完整性檢測技術(shù)的相關(guān)研究進行總結(jié)歸納，以期為注射劑一致性評價中密封完整性的檢測提供參考。

1 密封完整性檢測方法分類

1.1 確定性檢測方法和概率性檢測方法

根據(jù)檢測時泄漏現(xiàn)象是否可預測和可控，可將密封完整性檢測分為確定性檢測和概率性檢測。確定性檢測方法是基于系列可預見的泄漏現(xiàn)象，采用可控制和可監(jiān)測的理化測試技術(shù)對泄漏進行檢測，并可得到客觀的定量檢測結(jié)果的檢測方法，常用方法有質(zhì)量提取法、真空衰減法、激光頂空氣體分析法、高壓放電法、氦質(zhì)譜法（真空模式）等。概率性檢測方法是基于系列具有不確定性、會產(chǎn)生隨機結(jié)果的測試環(huán)節(jié)的檢測方法，其檢測結(jié)果具有隨機性，常需較大樣本量和嚴格的測試條件，以降低結(jié)果的隨機性，保障結(jié)果的有效性，常用方法有氦質(zhì)譜法（嗅探模式）、微生物挑戰(zhàn)法和液體示蹤法。兩種方法各有優(yōu)劣，應根據(jù)注射劑和包裝的特性來選擇合適的檢測方法。確定性檢測方法具有靈敏、準確、穩(wěn)定、成本低等優(yōu)點，應優(yōu)先考慮。

1.2 無損檢測方法和破壞性檢測方法

根據(jù)檢測方法是否對注射劑和包裝有影響，可將密封完整性檢測分為無損檢測和破壞性檢測。無損檢測方法包括質(zhì)量提取法、真空衰減法和激光頂空氣體法。高壓放電法因?qū)ψ⑸鋭┖桶b無影響［4］，一般情況下被視為無損檢測方法。但高電壓會將包裝內(nèi)的氧氣轉(zhuǎn)化成臭氧，可能影響產(chǎn)品質(zhì)量［3］。因此，《美國藥典》（USP39-1207）建議，采用高壓放電法檢測密封完整性時需評估其在整個生命周期里對藥品質(zhì)量的影響［5］。氣體示蹤法既可能是無損的，也可能是破壞性的，當需要破壞包裝壁而引入示蹤氣體或示蹤氣體對注射劑或包裝有影響時即為破壞性檢測方法。微生物挑戰(zhàn)法和液體示蹤法對藥品或包裝有影響，屬破壞性檢測方法。

無損檢測方法相對于破壞性檢測方法更具優(yōu)勢。無損檢測時，在方法建立和驗證過程中可重復使用樣品。同時，《美國藥典》（USP39-1207）指出，采用無損檢測方法時通過密封完整性檢測某個時間節(jié)點的穩(wěn)定性樣品，還可用于該時間節(jié)點下其他穩(wěn)定性項目的檢測，如可用于包材相容性的檢測。因此，采用無損檢測方法可以節(jié)省樣品和降低檢測成本，這對樣本量較少或價格昂貴的藥品來說尤為重要。

1.3 流體流轉(zhuǎn)型檢測方法和非流體流轉(zhuǎn)型檢測方法

根據(jù)檢測過程中的泄漏是否由于流體流轉(zhuǎn)產(chǎn)生，可將密封完整性檢測分為流體流轉(zhuǎn)型檢測和非流體流轉(zhuǎn)型檢測。質(zhì)量提取法、真空衰減法、激光頂空氣體分析法、氣體示蹤法、微生物挑戰(zhàn)法和液體示蹤法均屬流體流轉(zhuǎn)型檢測方法，前4種是基于氣體的流轉(zhuǎn)，后2種是基于液體的流轉(zhuǎn)?；诹黧w流轉(zhuǎn)的檢測方法，漏孔被堵塞后，流體無法順利流轉(zhuǎn)通過漏孔，可造成假陰性結(jié)果。采用基于流體流轉(zhuǎn)的檢測方法時，固體物質(zhì)均會堵塞漏孔而影響檢測結(jié)果。采用基于氣體流轉(zhuǎn)的檢測方法時，液態(tài)的蛋白質(zhì)類藥品由于溶劑揮發(fā)易在漏孔附近集聚并堵塞漏孔。因此，前4種均不適用于液態(tài)蛋白質(zhì)類藥物包裝的檢測。采用氣體示蹤法檢測時，液體也可能堵塞漏孔。采用基于液體流轉(zhuǎn)的方法，漏孔中的氣泡可能會“堵塞”漏孔。高壓放電法屬非流體流轉(zhuǎn)型檢測方法，當漏孔被蛋白質(zhì)類藥物集聚體堵塞時，由于蛋白質(zhì)集聚體導電，故漏孔的堵塞不會影響泄漏的檢測。因此，高壓放電法能用于液態(tài)蛋白質(zhì)類藥物包裝的檢測［3］，且能與其他檢測方法形成互補，完善液態(tài)蛋白質(zhì)類大分子藥物包裝密封完整性的解決方案。

1.4 驅(qū)動型檢測方法和非驅(qū)動型檢測方法

根據(jù)檢測時是否施加外力來驅(qū)動形成泄漏，可分為驅(qū)動型檢測和非驅(qū)動型檢測。驅(qū)動型檢測方法包括質(zhì)量提取法、真空衰減法、氦質(zhì)譜法（真空模式）、微生物挑戰(zhàn)法（浸沒模式）、液體示蹤法等，均需通過加壓或抽真空的方式，使包裝內(nèi)外形成壓力差來驅(qū)動泄漏發(fā)生，以便檢測泄漏。同時，對于一些具有活動部件的包裝（如注射器），以及易發(fā)生形變的柔性包裝，測試時需采用特殊工具，以限制活動部件的位移和柔性包裝的形變，從而降低檢測時的背景噪音，提高檢測靈敏度，避免檢測結(jié)果出現(xiàn)錯誤。激光頂空氣體法和高壓放電法在測試時不需依靠外力來驅(qū)動泄漏，屬非驅(qū)動型檢測方法，不需特殊工具來限制部件的移動和包裝的形變。

2 注射劑密封完整性檢測方法

2.1 質(zhì)量提取法

質(zhì)量提取法是采用智能分子流質(zhì)量傳感器，檢測在真空環(huán)境中從包裝泄漏出的氣體質(zhì)量流率的方法。將包裝放入測試倉，對測試倉進行抽真空，包裝內(nèi)的氣體或由液體揮發(fā)生成的氣體會通過漏孔泄漏出包裝，被能在分子流狀態(tài)下工作的智能分子流質(zhì)量傳感器所檢測，最后以檢測的質(zhì)量流率來判定包裝是否泄漏。

該法綜合性能強，競爭優(yōu)勢大。檢出限可達玻璃微量滴管名義孔徑1μm和鎢絲直徑15μm［6］，檢測靈敏度高；具有總泄漏、大泄漏、小泄漏檢測機制，檢測范圍寬；基于質(zhì)量流率檢測機制，檢測結(jié)果受外部環(huán)境如溫度、濕度的影響較小，穩(wěn)定性好；檢測的包裝類型包括彈性體密封件或螺紋蓋密封的玻璃瓶和塑料瓶、玻璃或塑料安瓿瓶、注射器、柔性包裝袋等，包裝的容積涵蓋幾毫升到幾升，藥品的狀態(tài)包括固態(tài)和液態(tài)，幾乎覆蓋注射劑的所有包裝類型和劑型，方法適用范圍廣。鑒于其眾多優(yōu)勢和行業(yè)內(nèi)對其的廣泛認可，質(zhì)量提取法已經(jīng)成為注射劑一致性評價中密封完整性檢測的理想方法之一。

美國材料實驗協(xié)會（ASTM）也已為該方法設立國際標準（ASTM F3287）。該標準在氣體泄漏和液體泄漏兩種模式下，建立和驗證了玻璃瓶、低密度聚乙烯瓶、玻璃注射器的密封完整性檢測方法，方法驗證的指標包括檢出限、準確度和精密度。在頂空氣體泄漏模式下，在置信概率為95%的檢出限為玻璃微量滴管名義孔徑1μm；在液體泄漏模式下，玻璃瓶和低密度聚乙烯瓶在95%置信概率下的檢出限為玻璃微量滴管名義孔徑1μm，玻璃注射器為2μm。在檢出限及以上的漏孔檢測中，方法的準確度均為100%，精密度試驗結(jié)果滿足重復性限和重現(xiàn)性限的要求。

注射劑的不同形態(tài)和組成對質(zhì)量提取法檢測結(jié)果的影響不同。YOON等［7］研究發(fā)現(xiàn)，注射劑為固體粉末（甘露醇粉）時，不會堵塞漏孔；注射劑為液態(tài)時，黏度對檢測結(jié)果影響較小。當注射劑為液態(tài)的蛋白質(zhì)類藥物且濃度較低時，漏孔不會堵塞；當藥物濃度增大時，漏孔會被堵塞，原因是大分子蛋白質(zhì)類藥物在漏孔附近聚集阻塞漏孔，產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

2.2 真空衰減法

真空衰減法采用壓力傳感器檢測包裝泄漏引起測試倉真空度的衰減值，工作原理與質(zhì)量提取法相似，具體如下，將測試包裝置入測試倉并抽真空，包裝內(nèi)的氣體或液體揮發(fā)生產(chǎn)的氣體通過漏孔進入測試倉，引起倉內(nèi)真空度變小，可使用壓力傳感器檢測真空度的衰減值，最后以衰減值來判定包裝是否泄漏。一般配合使用絕壓傳感器和差壓傳感器。絕壓傳感器用于監(jiān)測測試倉的絕對壓力，以便控制倉內(nèi)的真空度，使包裝內(nèi)的氣體能通過漏孔順利流轉(zhuǎn)至測試倉，對于液體泄漏的檢測更為重要，因為必須將測試倉的真空度提高到一定程度，才能使液體氣化而溢出包裝。在預定時間內(nèi)，如果測試倉內(nèi)的真空度不能提高到一定程度，則表明包裝有大漏存在。差壓傳感器的靈敏度更高，用于檢測從包裝流轉(zhuǎn)出的氣體引起的真空度的變化值，故用于檢測小漏。

真空衰減法由于在泄漏檢測行業(yè)被廣泛使用，已為其設立國際標準（ASTM F2338），適用的包裝有無蓋的托盤和杯碟、多孔阻隔材料密封的托盤、無孔硬質(zhì)包裝、無孔軟包裝，其中無蓋的托盤和杯碟氣體泄漏的檢出限均為50μm，多孔阻隔材料密封的托盤氣體泄漏的檢出限為100μm，無孔硬質(zhì)包裝氣體和液體泄漏的檢出限均為5μm。該方法適用于檢測氣體泄漏和液體泄漏。WOLF等［8］研究發(fā)現(xiàn)，采用液體泄漏檢測方法對空氣和水分別填充的包裝進行對比檢測，發(fā)現(xiàn)水填充的包裝在相同尺寸的漏孔下產(chǎn)生的泄漏率更大，原因是水在較高真空度下會揮發(fā)產(chǎn)生大量水氣。

真空衰減法不適合頂空氣體或液體較少、且泄漏過大包裝的檢測。當包裝內(nèi)頂空氣體或液體較少時，在真空測試倉被抽真空時，包裝內(nèi)有限的氣體會通過大漏孔迅速溢出，隨測試倉內(nèi)的氣體被抽走，在測試時包裝內(nèi)無氣體流轉(zhuǎn)至測試倉而引起真空度變化，從而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。另外，其穩(wěn)定性不及質(zhì)量提取法。原因是前者基于壓力變化而后者基于質(zhì)量變化，壓力會隨環(huán)境溫度的波動而變化，而質(zhì)量則不然。

2.3 激光頂空氣體分析法

激光頂空氣體分析法通過檢測包裝內(nèi)頂空氣體對低能量激光的吸光度來檢測氣體的含量。根據(jù)檢測氣體的種類，可調(diào)整激光的頻率，使激光的波長與目標分析氣體的吸收光譜特性相匹配［9］。當激光通過包裝內(nèi)的頂空氣體，頂空氣體對激光有吸收，根據(jù)吸光度采用校準曲線推導出目標檢測氣體的含量，以此來判定包裝是否泄漏。目前，能檢測的氣體種類主要有氧氣、水蒸氣和二氧化碳，另外還可用于檢測包裝內(nèi)頂空部分的壓強。該法的檢測靈敏度很高，檢出限能達到玻璃微量滴管名義孔徑0.2μm［10］，常能滿足包裝系統(tǒng)最大允許泄漏限度值的要求，在方法的開發(fā)和驗證中，可免除與微生物挑戰(zhàn)法或液體示蹤法的比較研究。

該法的顯著特點是檢測結(jié)果能反映產(chǎn)品經(jīng)歷的生產(chǎn)、運輸、儲存等整個過程的泄漏情況，而其他檢測方法僅能表征包裝在測試時的密封狀態(tài)。這一特性對于評估在極端條件下保存藥品的密封完整性尤為重要，如在超低溫條件下保存的包裝內(nèi)具有特殊頂空氣體組成或壓強的藥品［11］。膠塞在-80℃下會喪失黏彈性，密封能力會降低，包裝會產(chǎn)生泄漏，導致頂空氣體的組成或壓強發(fā)生變化。當把產(chǎn)品取出置于常溫后，膠塞會恢復密封性能，此時若采用其他方法則無法檢出泄漏，而采用激光頂空氣體分析法則可以有效檢測出在低溫下產(chǎn)生的泄漏。

包裝內(nèi)的頂空氣體通過漏孔特別是較小的漏孔與環(huán)境的氣體交換非常慢，要想氣體交換量達到方法的檢測限，需要很長的時間。為了加快檢測方法的開發(fā)和驗證，可采用“Bombing”程序來加速氣體交換。該程序是將樣品置于具有一定真空度的環(huán)境中放置一定時間，然后取出在大氣環(huán)境中平衡一定時間，通過增加包裝內(nèi)外的壓差來加快包裝內(nèi)外氣體的交換［12-13］。但該程序中產(chǎn)品處理的壓力和時間等參數(shù)對檢測結(jié)果的影響很大。

激光頂空氣體分析法適用范圍有一定要求。首先是對包裝的透光性有要求，只有低能量激光能通過的透明或半透明的包裝才能檢測，該法已用于西林瓶［10，12，14-15］和安瓿瓶［13］等透明包裝的檢測，也可用于柔性包裝袋的檢測。其次是對包裝內(nèi)頂空氣體有要求，僅頂空氣體組成或壓強與所處環(huán)境不同且頂空氣體體積足夠大的藥品包裝才能檢測。對于包裝內(nèi)填充氮氣的藥品和凍干制品，可檢測包裝內(nèi)頂空氣體中氧氣的含量［10，13，16-17］；水蒸氣的檢測主要應用在包裝內(nèi)呈負壓的藥品和凍干類制劑的檢測［9，15，18］；對于儲存在干冰中的藥品，可檢測包裝頂空氣體中的二氧化碳含量［3］。對于預灌注注射器，頂空氣體體積較小，一般只有幾毫升，測試時激光可能會通過液體部分而被水吸收，導致檢測結(jié)果出現(xiàn)錯誤，因此該法不適用于檢測預灌注注射器密封的完整性。

2.4 高壓放電法

高壓放電法檢測通過藥品和包裝的電流來判斷泄漏情況，適用于液態(tài)或半液態(tài)的藥品，且藥品的導電性要比包裝好的情形。完整的包裝導電性能差，通過包裝的電流較低；當包裝中有漏孔，且藥品處于漏孔附近或填充在漏孔中時，包裝的電阻會變小，通過的電流會大幅增加。當電流增加到一定程度，超過泄漏閾值時，表明包裝泄漏。藥品與包裝導電性差異越大，施加的電壓越大，藥品與漏孔的距離越近，方法的靈敏度就越高。高壓放電法對柔性包裝袋的檢出限為激光打孔名義孔徑2.5μm，檢測范圍為2.5～11.2μm［19］，同時還能檢測出熱封時產(chǎn)生的型式缺陷［20］；對于預灌注注射器，檢出限可達到激光打孔5μm［21］。高壓放電法檢測速度非常快，往往只需要幾秒鐘，因此在生產(chǎn)線的在線檢測中使用廣泛［3］。

在確定性檢測方法中，高壓放電法僅能檢測漏孔位置，其通過各種機制確保電極探針能夠探測包裝表面的每個部位，探測電流最強部位以判斷漏孔位置。在測試柔性包裝時，采用碳刷刷毛制備的電極探針，沿不同方向掃過樣品表面，以尋找具體的漏孔位置［19］。在測試注射器時，使注射器繞其中心軸不停旋轉(zhuǎn)，而電極探針垂直于旋轉(zhuǎn)方向在注射器表面不停移動［21］，或采用多渠道電極覆蓋整個樣品［3］，以此來確定漏孔的具體位置。

該法的應用有一定局限性。首先是對注射劑狀態(tài)和包裝有選擇性，注射劑必須是液體或半液體狀態(tài)且不易燃燒，包裝應該是絕緣性能比較好的材料，如玻璃、彈性體和塑料等［22］；其次是檢測結(jié)果受包裝表面的水分影響較大，包裝表面若存在水分，會降低包裝的電阻，導致通過包裝的電流值增大，從而出現(xiàn)假陽性結(jié)果［5］。因此，采用該法檢測時要避免包裝表面出現(xiàn)水分，特別是放置溫度較低的穩(wěn)定性樣品，取出后要在室溫下進行充分平衡，避免測試時包裝表面出現(xiàn)冷凝水，從而影響檢測結(jié)果［20］。

2.5 氣體示蹤法

氣體示蹤法的檢測對象為通過包裝漏孔泄漏出的示蹤氣體，適用范圍較廣，可用于無孔的硬質(zhì)包裝［23-25］和柔性包裝［26-27］的檢測，包裝的容積覆蓋小包裝到幾升的大包裝。示蹤氣體有氦氣和氫氣。氦氣具有無毒、惰性、價格便宜、在大氣中含量較小、檢測時背景值較低等優(yōu)點，在實際檢測中使用更多。氦氣示蹤法又稱為氦質(zhì)譜法，有真空檢測和嗅探檢測2種模式。

氦質(zhì)譜真空檢測模式是將充氦氣的測試包裝放入真空測試倉內(nèi)，對測試倉進行抽真空，氦氣通過漏孔泄漏出包裝，被氦質(zhì)譜檢測器所檢測，最后以氦氣的泄漏率來判定包裝是否泄漏（參見標準ASTM F2391）。氦質(zhì)譜檢測器的靈敏度高和大氣中氦氣背景含量值很低［9］，因此氦質(zhì)譜法真空檢測模式的靈敏度非常高，且是目前檢測靈敏度最高的方法。對于硬質(zhì)包裝，檢出限可以達到10-7～10-5scc/s，相當于玻璃微量滴管名義孔徑0.1～0.3μm［23，28］，柔性包裝袋中的檢出限可達到針孔型漏孔10μm［26］。氦質(zhì)譜真空檢測模式的靈敏度能夠滿足硬質(zhì)包裝最大允許泄漏限度值的要求，采用該法可以免除與微生物挑戰(zhàn)法或示蹤液體法的比較研究。鑒于真空模式的高靈敏度，該法常用于研究泄漏率或漏孔大小與微生物侵入概率的關(guān)系［28］，也用于研究泄漏率與漏孔尺寸的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)泄漏率與玻璃微量滴管和激光打孔的名義孔徑的平方均成正比［24，29］。真空檢測模式能夠檢測整個包裝，也能夠檢測包裝的某一部分，如包裝部分表面和封口處。

氦質(zhì)譜嗅探檢測模式是采用與氦質(zhì)譜檢測器相連的嗅探探針掃描包裝表面，以捕捉和檢測泄漏的示蹤氦氣的檢測方法，可以檢測包裝漏孔的位置。實際應用中，需要確定漏孔具體位置時才選用該方法。從包裝內(nèi)泄漏出的示蹤氦氣在包裝表面的集聚是不可預測的，且嗅探掃描程序由于操作者的技能差異而對檢測結(jié)果影響較大，因此該方法是一種概率性檢測方法。

氣體示蹤法也有一些缺陷。首先是檢測結(jié)果易受示蹤氣體的滲透影響。示蹤氣體可能會滲透通過包裝壁（特別是塑料和橡膠類的包裝壁），從而掩蓋泄漏的示蹤氣體，造成假陽性結(jié)果。采用氦質(zhì)譜法真空檢測模式時，泄漏閾值應該根據(jù)檢測的溫度來確定，因為氦氣在不同溫度下滲透性能不一樣，溫度越高，氦氣的滲透性能越強。如果以低溫時的泄漏閾值來判定較高溫度時的泄漏率，較高溫度下氦氣的滲透量有可能超過低溫時的泄漏閾值，產(chǎn)生假陽性結(jié)果［3］。因此，要充分評估示蹤氣體滲透對泄漏檢測結(jié)果的影響。其次是不適宜檢測小包裝的大漏。灌注示蹤氣體和泄漏檢測有一定的時間間隔，在這段時間內(nèi)，對于一些具有大漏孔的小包裝，填充在包裝內(nèi)的示蹤氣體可能會通過大漏孔全部逃逸，在檢測時沒有示蹤氣體逸出包裝，出現(xiàn)假陰性結(jié)果［9］。另外，在檢測注射液包裝時，特別是在真空模式下，應避免注射液或其揮發(fā)生成的水蒸氣進入測試系統(tǒng)損壞檢測設備［5］。

2.6 微生物挑戰(zhàn)法

微生物挑戰(zhàn)法檢測在高濃度微生物環(huán)境下是否有微生物侵入包裝，通過向空包裝中注入無菌培養(yǎng)基，密封，滅菌，培養(yǎng)，檢查包裝內(nèi)是否有菌落生長。若包裝內(nèi)無菌落生長，將包裝放入具有高濃度微生物的介質(zhì)中，施加一定驅(qū)動力并保持一定時間，促進介質(zhì)中的微生物通過漏孔向包裝內(nèi)轉(zhuǎn)移；然后撤銷驅(qū)動力，使樣品在大氣壓環(huán)境下平衡一定時間；再將樣品從介質(zhì)中取出并進行微生物培養(yǎng)，采用視覺觀察法，檢查包裝內(nèi)是否有菌落生長。微生物挑戰(zhàn)法的檢出限一般為玻璃微量滴管名義孔徑5μm［5］。

根據(jù)含有高濃度微生物的介質(zhì)不同，微生物挑戰(zhàn)法分為浸沒模式和氣溶膠模式。浸沒模式是以含有高濃度微生物的培養(yǎng)基為介質(zhì)。微生物挑戰(zhàn)法需選擇尺寸較小、運動能力較強的微生物。浸沒模式常用的微生物有缺陷短波單胞菌Brevundimonas diminuta、沙雷氏菌Serratia marcescens［5，30］、大腸桿菌Escherichia coli［31］，以及缺陷短波單胞菌和大腸桿菌的混合菌［28，32］。培養(yǎng)基介質(zhì)中微生物濃度一般不低于105cfu/mL。常用的培養(yǎng)基有乳糖生理鹽水［28，31-32］和大豆酪蛋白消化培養(yǎng)基［5］。乳糖生理鹽水為非蛋白培養(yǎng)基，不會產(chǎn)生細胞聚集，可避免漏孔堵塞［31］。浸沒模式主要用于硬質(zhì)包裝的檢測［28，31-32］。氣溶膠模式是以含有高濃度微生物的氣溶膠為介質(zhì)。氣溶膠中使用的微生物主要為金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus和大腸桿菌Escherichia coli。金黃色葡萄球菌為革蘭陽性菌，易獲取，菌落形態(tài)易鑒別，更重要的是在霧化過程中能完好地存活［33］。大腸桿菌為革蘭陰性菌，常用于生物氣溶膠樣品的測試［34-35］，因此也是氣溶膠檢測模式下較理想的菌種。采用特殊的噴霧器將菌液霧化形成的氣溶膠粒徑為1～5μm，有利于生成溶膠化的細菌［36］。氣溶膠中微生物的濃度一般不低于2.0×107cfu/m3。氣溶膠模式對包裝施加的外力較小，主要適用于易產(chǎn)生形變的柔性包裝袋的檢測［6，36］。

微生物挑戰(zhàn)法的檢測結(jié)果受眾多不確定因素影響。首先，微生物能否找到漏孔不可預測和控制；其次，即使微生物能找到漏孔，微生物能否順利通過漏孔進入包裝也受諸多因素，如漏孔的幾何尺寸和形狀、包裝的材料和結(jié)構(gòu)、漏孔內(nèi)是否存在液體、菌液的表面強度、漏孔是否被堵塞等影響。微生物侵入的檢測結(jié)果是不可預測和不可控的，特別是漏孔較小時，檢測結(jié)果的差異極大。故屬概率性檢測方法。另外，微生物挑戰(zhàn)法只適用于空包裝的檢測，不適用于含藥品包裝的檢測，檢測周期比較長（每次需數(shù)周）。一般在沒有合適的方法，或其他檢測方法的結(jié)果需要微生物侵入的直接證據(jù)時才選用。

2.7 液體示蹤法

液體示蹤法是檢測通過包裝漏孔的示蹤液體中示蹤劑的方法。通過將測試包裝置于裝有示蹤液體的容器中，把容器放入真空倉中，對真空倉進行抽真空或加壓，并在相應的真空度或壓力下保持一定的時間，釋放真空或壓力，在大氣壓條件下平衡一定時間，然后檢測包裝內(nèi)是否含有示蹤劑。示蹤液體主要有染料溶液、金屬離子溶液和放射性核素溶液。當采用染料溶液作為示蹤液體時，又稱為色水侵入法，常用的染料有亞甲基藍、赤蘚紅［31］和羅丹明B［3］等。試驗前需將配制的染料溶液用0.2μm的膜過濾，以免染料溶液中的不溶性物質(zhì)造成漏孔堵塞［31］。金屬離子溶液常用的是含Mg2＋溶液［32］。對于示蹤劑的檢測，主要有化學分析法和目測法?；瘜W分析法是采用化學分析手段對包裝內(nèi)示蹤劑的濃度進行檢測，如采用紫外-可見分光光度法檢測染料濃度，采用原子吸收光譜法分析Mg2＋濃度［31-32］，但需對方法進行方法學驗證。目測法主要用于色水侵入法，是對包裝內(nèi)是否有染料溶液侵入進行視覺判斷，不但與檢測者的技能和經(jīng)驗有關(guān)，還受檢測環(huán)境如光照度、光源種類、觀察背景等的影響。

液體示蹤法是基于示蹤液體與漏孔的接觸、示蹤液體的侵入、示蹤劑的擴散等多個環(huán)節(jié)的檢測方法，均具有不可預期性和不可控性，特別是在漏孔較小的情況下，即使漏孔孔徑相同，檢測結(jié)果的差異也較大［3］。因此，液體示蹤法也是典型的概率性檢測方法。

液體示蹤法中使用得最多的是色水侵入法，色水侵入法的原理與微生物挑戰(zhàn)法相似，但不需微生物培養(yǎng)，檢測周期比微生物法短，且能夠用于含有藥品的包裝的檢測［9］。由于色水侵入法具有簡單、成本低、檢測周期短等優(yōu)點，在藥品行業(yè)應用的時間較長、范圍較廣，已形成眾多檢測方法標準。但WOLF等［37］的研究表明，采用這些標準方法均不能可靠地檢測激光打孔5～15μm的陽性樣品，方法的靈敏度和準確度欠佳，僅適合檢測大漏。通過對這些標準方法進行優(yōu)化，如增加包裝內(nèi)外的壓強差，采用正壓和負壓組合［3，38］，延長作用時間，加大檢測的樣本量，增加染料溶液中染料和表面活性劑濃度［21，31，37］等，可提高方法的靈敏度，檢出限可達5μm［3］。但優(yōu)化的條件相對苛刻，會導致陰性樣品也有色水侵入，從而出現(xiàn)假陽性結(jié)果［37］。因此，色水侵入法的開發(fā)和驗證的難度較大，也不適用于西林瓶包裝的檢測，因為很難清除膠塞和玻璃瓶間的染料［13］。

3 展望

值得注意的是，上述所有檢測方法的開發(fā)和驗證均需針對待測藥品和包裝定制相關(guān)樣品或器具。所有的檢測方法均需定制與待測藥品和包裝相同的、包括多個泄漏級別的陽性樣品。質(zhì)量提取法需針對待測樣品定制實心體、測試腔體或填充塊，真空衰減法需要定制實心體和腔體，激光頂空氣體分析法需定制校準用的標準樣品，高壓放電法需定制電極。

目前，我國藥品包裝密封完整性研究還處于初級階段。為適應我國注射劑仿制藥一致性評價工作的趨勢，應進一步加強密封完整性檢測的研究工作。密封完整性檢測方法各有優(yōu)劣勢，在注射劑一致性評價中應根據(jù)注射劑和包裝的情況選用合適的檢測方法。實際上，當漏孔直徑達到1μm時，微生物才開始侵入［9］。目前，只有質(zhì)量提取法、激光頂空氣體分析法和氦質(zhì)譜法（真空模式）能滿足1μm檢出限的要求。同時，質(zhì)量提取法不但能檢測小漏，還能檢測大漏，檢測范圍寬；基于質(zhì)量流率的檢測機制，質(zhì)量提取法檢測結(jié)果受環(huán)境影響較小，穩(wěn)定性好；檢測對象覆蓋注射劑的所有包裝類型和劑型，適用范圍廣；屬無損檢測方法，在方法開發(fā)和驗證過程中，陽性樣品可重復使用，需要的陽性樣品數(shù)量較少，檢測成本低；穩(wěn)定性樣品檢測中，通過質(zhì)量提取法檢測的樣品可繼續(xù)用于相容性檢測，需要的樣本量小；實現(xiàn)了審計追蹤功能，能夠確保檢測數(shù)據(jù)完整性?？梢?，質(zhì)量提取法具有較強的綜合性能，是注射劑一致性評價中密封完整性檢測較理想的方法之一。