鄭光柄，王 欣，于紅松

(遵義醫(yī)科大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院貴州省眼疾病特色重點實驗室，貴州 遵義 563099)

Behcet病(Behcet's disease,BD)為炎癥性疾病，以反復發(fā)作的口腔潰瘍、生殖器潰瘍、葡萄膜炎和皮膚損傷為主要臨床表現(xiàn)，并可累及關(guān)節(jié)、消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等[1-2]。該病好發(fā)于地中海沿岸、遠東及中東地區(qū)，因其分布與古絲綢之路相吻合，故又稱絲綢之路病(Silk road disease)[3]。迄今為止，BD的發(fā)病機制尚不明確，據(jù)報道，HLA-B51是與BD相關(guān)性最強的易感基因，但所占風險不到20%[4]。近期研究表明，遺傳、表觀遺傳、免疫及環(huán)境因素與BD的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)[5-6]，尤其是環(huán)境因素引起的表觀遺傳修飾改變在BD的發(fā)病機制中起著重要的作用。

表觀遺傳學研究可遺傳的基因表達變化，而這些變化并不涉及DNA序列的改變[7]，因而表觀遺傳變化具有可逆性，這種可逆性與可控性已證實可被諸如特殊飲食、藥物及生活環(huán)境改變等方法予以糾正和逆轉(zhuǎn)[8-9]。近年來大量研究表明表觀遺傳修飾的改變在人類疾病的發(fā)生過程中發(fā)揮重要的作用[10-12]。DNA甲基化、組蛋白修飾及非編碼RNA是表觀遺傳的三大主要調(diào)控機制，其作用是調(diào)控基因的表達和參與細胞的發(fā)育、分化以及活性的維持[13]。本文就表觀遺傳學因素(DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA)在BD發(fā)病機制中的研究進展作一綜述。

1 DNA甲基化與BD

DNA甲基化是指DNA序列上特定的堿基在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase,DNMT)的催化作用下，以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)作為甲基供體，通過共價鍵結(jié)合的方式獲得一個甲基基團的化學過程[14]。DNA甲基化主要發(fā)生在CpG二核苷酸中胞嘧啶上第5位碳原子上，其產(chǎn)物為5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5-mC)，DNA甲基化不改變DNA的序列，但可通過改變DNA與蛋白質(zhì)的相互作用，從而影響基因轉(zhuǎn)錄活性[15]。DNA甲基化是人類基因組中一種常見的修飾方式，在CpG二核苷酸中的發(fā)生率為70%～80%。CpG島與啟動子相關(guān)的異常DNA甲基化可導致基因表達缺失，而基因表達降低是基因失活的一種關(guān)鍵機制[16]。通常情況下，啟動子區(qū)域DNA甲基化程度與基因表達水平呈負相關(guān)，高甲基化抑制基因表達，低甲基化則促進基因表達[17]。

近期研究表明，全基因組水平的DNA甲基化異常參與了BD的發(fā)生。Yu等[18]采用Infinium Human Methylation 450K芯片技術(shù)分析方法，對60個BD患者和60個正常對照外周血液樣本開展了全表觀基因組關(guān)聯(lián)研究(Epigenome-wide association studies,EWAS)，鑒定了與BD相關(guān)聯(lián)的4332個差異DNA甲基化位點，其中547個位點在BD中呈現(xiàn)高甲基化，3785個位點在BD中呈現(xiàn)低甲基化，其中Delta-β≥0.14的位點共5個，包括FKBP5/cg03546163、FKBP5/cg25114611、NFIL3/ cg142905 76、RUNX2/cg23261343和FLJ43663/ cg20228731；課題組進一步采用焦磷酸測序的方法在100例BD患者和100個正常對照者中驗證候選的5個差異的甲基化位點，結(jié)果證實了候選的5個差異的甲基化位點與BD顯著相關(guān)，均在BD中呈現(xiàn)低甲基化，其中P值最小的位點為FKBP5/cg03546163(P=3.81E-13)；利用100例BD患者和100個正常對照的焦磷酸測序結(jié)果進行BD生物學標記篩選，結(jié)果表明，其中4個差異的甲基化位點(cg03546163,cg25114611,cg23261343 and cg14290576)可以作為BD疾病診斷的生物標記物(AUC=83.95%)；課題組還初步探索了異常DNA甲基化的功能：其中BD患者中低甲基化的FKBP5基因和FLJ43663基因，相對于正常對照，mRNA表達水平顯著升高；相對于未用DNA甲基化抑制劑5-氮雜-2’-脫氧胞苷(DAC)處理培養(yǎng)的外周血單個核細胞(PBMC)組，DAC處理的PBMC組中FKBP5基因和FLJ43663基因的mRNA表達水平顯著升高，DAC處理的PBMC組中IL-1β的分泌顯著增加；以上研究結(jié)果均揭示了DNA甲基化異常在BD發(fā)病機制中起著非常重要的作用。Hughes[19]應用Infinium Human Methylation 450K芯片技術(shù)，對土耳其16例年齡、性別和種族相匹配且未經(jīng)治療的BD患者和16個健康對照進行研究，評估了單核細胞和CD4+T細胞中485000個甲基化位點在全基因組中的甲基化狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對照相比，BD患者單核細胞中有383個CpG差異表達的甲基化位點，包括129個高甲基化CpG位點和254個低甲基化CpG位點；在BD患者CD4+T細胞中發(fā)現(xiàn)了125個CpG差異甲基化位點，其中67個低甲基化位點和58個高甲基化位點；進一步研究發(fā)現(xiàn)，BD患者接受治療后CD4+T細胞及單核細胞的差異甲基化位點發(fā)生了逆轉(zhuǎn)，檢測到單核細胞共有1426個差異甲基化的CpG位點；其中790個為高甲基化，636個為低甲基化。在CD4+T細胞中，共有2044個CpG位點在治療后發(fā)生差異性甲基化，其中1032個位點出現(xiàn)高甲基化，1012個位點發(fā)生低甲基化；研究者還通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)細胞骨架動力學的基因在兩組之間存在異常的DNA甲基化，揭示調(diào)控蛋白的多種細胞骨架結(jié)構(gòu)基因的異常DNA甲基化與BD的發(fā)病機制密切相關(guān)，是BD的發(fā)病機制及其治療的基礎(chǔ)。

除了全基因組水平鑒定BD異常甲基化的研究外，最近也有多項研究發(fā)現(xiàn)單個CpG位點的 DNA 甲基化異常也參與了BD的發(fā)生。Ali等[20]分析了伊朗51例 BD 患者和63個健康對照組的白介素10(Interleukine-10,IL-10)基因啟動子區(qū)域的甲基化水平以及IL-10基因mRNA及蛋白質(zhì)表達水平，結(jié)果表明，與對照組相比，BD患者組中IL-10基因mRNA表達水平顯著降低，血清中IL-10水平也顯著降低，且BD患者組IL-10基因 mRNA表達水平和血清中IL-10分泌水平均與IL-10基因啟動子的甲基化程度呈負相關(guān)；IL-10是一種免疫調(diào)節(jié)細胞因子，研究發(fā)現(xiàn)IL-10的表達缺失與許多自身免疫性疾病發(fā)病有關(guān)[21]，提示啟動子區(qū)高甲基化是BD患者IL-10基因失活的關(guān)鍵機制之一。Zhu[22]等對16 名活動期BD患者、11例非活動期BD患者及19個健康對照組CD4+T細胞中的轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、白介素4(Interleukine-4,IL-4)及GATA 結(jié)合蛋白-3(GATA-3)CpG啟動子區(qū)域的DNA甲基化及mRNA表達水平進行了研究，結(jié)果表明，與健康個體相比，活動期BD患者中GATA3和TGF-β的甲基化水平顯著升高且mRNA表達顯著降低，非活動期BD患者GATA3啟動子區(qū)域CG-7.8.9位點較活動期BD患者甲基化水平顯著降低；同樣，與活動期BD患者相比，非活動期BD患者TGF-β中CG-2.3.4.5和CG-10.11位點的甲基化水平也顯著降低；在使用了糖皮質(zhì)激素和環(huán)孢素治療后，非活動期BD患者的GATA3和 TGF-β甲基化水平降低，提示GATA3 和TGF-β的異常DNA甲基化與它們的mRNA表達相關(guān)，且GATA3和TGF-β啟動子區(qū)域的高甲基化可能導致其基因轉(zhuǎn)錄沉默，進而參與BD的發(fā)病。Abdi等[23]檢測BD患者和健康對照組外周血中細胞因子信號轉(zhuǎn)導抑制因子1(Suppressors of cytokine signaling 1,SOCS1)基因的甲基化水平，結(jié)果顯示，與健康對照組比，BD患者組中SOCS1甲基化水平升高，且BD患者組中SOCS1基因表達的水平較健康對照組顯著降低，進一步揭示了BD患者SOCS1基因啟動子DNA甲基化程度與基因表達活性程度呈負相關(guān)，SOCS1 基因甲基化水平增高可能是最終導致BD的發(fā)病原因之一。Qiu等[24]對BD患者及健康對照組樹突狀細胞( Dendritic cell,DC)中干擾素調(diào)節(jié)因子8(Interferon regulatory 8,IRF 8)CpG啟動子區(qū)域的DNA甲基化水平進行了研究，結(jié)果顯示，活動期BD患者IRF 8甲基化水平顯著高于非活動BD患者及正常對照組，且活動期BD患者的IRF8基因mRNA表達健康對照較顯著降低；研究還發(fā)現(xiàn)，DAC處理能降低IRF8基因CpG位點甲基化水平，進而增強IRF8基因的mRNA表達，提示IRF8的表觀遺傳調(diào)控可能為BD治療的新靶點。

綜上所述，異常DNA甲基化可能通過調(diào)控目標基因的表達，參與BD的發(fā)病。因此，異常DNA甲基化位點可能成為BD診斷的生物標志物和治療靶點。

2 組蛋白修飾與BD

組蛋白修飾(Histone modification)是指組蛋白在相關(guān)酶作用下發(fā)生甲基化、乙酰化、磷酸化、腺苷酸化、泛素化、ADP核糖基化等修飾的過程。組蛋白修飾是表觀遺傳調(diào)控的重要手段之一，已有研究已經(jīng)證實，組蛋白乙酰化主要與基因激活有關(guān)[25]。近年來，組蛋白修飾在自身免疫性疾病中的作用已被廣泛關(guān)注，且與BD的發(fā)生也有一定關(guān)聯(lián)。

SIRT1 (Sirtuins 1)是一種依賴NAD+輔酶的組蛋白去乙酰化酶，通過對組蛋白進行去乙酰化修飾，調(diào)控基因的表達，進而調(diào)節(jié)細胞功能存活及調(diào)節(jié)炎癥[26]。Gardner等[27]研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1激活物通過下調(diào)STAT5A / B的表達和抑制對IL-2的pSTAT5A/B信號傳導，從而抑制T細胞增殖。對實驗性自身免疫性葡萄膜炎(Experimental autoimmune uveitis,EAU)小鼠進行口服SIRT1激活劑治療可抑制疾病的發(fā)展，并伴有視網(wǎng)膜白細胞浸潤的減少，抑制抗原特異性T細胞反應，降低了包括IL-6、IL-17A和干擾素-γ等促炎細胞因子的產(chǎn)生，進而抑制EAU的發(fā)展。前期已有研究發(fā)現(xiàn)，IL-6、IL-17等細胞因子在BD發(fā)病中發(fā)揮著重要作用[2]。因此，未來對SIRT1的靶向激活有望成為BD的潛在治療方法。Kubota等[28]通過對注射脂多糖誘導的葡萄膜炎(Endotoxin induced uveitis,EIU)小鼠喂飼白藜蘆醇，研究白藜蘆醇在內(nèi)毒素誘導的EIU中的眼部作用，結(jié)果顯示，白藜蘆醇給藥可以顯著降低單核細胞趨化蛋白1(Monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)和細胞間黏附分子1(Intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)的蛋白水平以及核因子-κB (Nuclear factor-κB，NF-κB)水平；與對照組相比，視網(wǎng)膜血管白細胞黏附能力也顯著降低，抑制眼部炎癥反應的發(fā)生；除了具有抗氧化作用外，白藜蘆醇還可作為組蛋白脫乙?；窼irt1的活化劑，白藜蘆醇能夠顯著增強Sirt1基因在EIU小鼠視網(wǎng)膜色素上皮細胞和脈絡(luò)膜中的表達，SIRT1激活物可抑制與BD的發(fā)展，因此SIRT1激活物可能是BD潛在的藥物靶點。

綜上所述，組蛋白修飾參與了BD的發(fā)生發(fā)展，但相關(guān)的研究偏少且不夠深入，其參與BD發(fā)生的具體機制有待于進一步研究。

3 非編碼RNA與BD

非編碼RNA(Non-coding RNA)是指不編碼蛋白質(zhì)的RNA，包括微小RNA(microRNA，miRNA)、短干擾RNA(Small interfering RNA，siRNA)、piRNA(piwi-interacting RNA)和長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)。人的基因組大概含有32億個堿基，編碼蛋白的基因僅占全基因組的1%～2%，而剩余的98%都是非編碼DNA。近年研究表明，非編碼RNA在各種復雜性疾病的調(diào)控中起到非常重要的作用。目前研究最多的是miRNA，其長度約為22個核苷酸，也是一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，通過對靶基因的調(diào)控進而參與細胞增殖、分化及凋亡等過程。miRNA自身表達的調(diào)控機制尚不明確，單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP )為其調(diào)控機制之一，其主要通過miRNA基因中的SNPs對miRNA表達活性進行調(diào)節(jié)，從而通過調(diào)控靶基因產(chǎn)生生物學效應[29]。目前，多項研究表明，miRNA可能成為BD潛在的生物學診斷標志。

Antonio等[30]使用Affymetrix陣列分析法，全面覆蓋miRNA序列分析BD患者及正常對照組miRNA的表達譜，鑒定了BD中47組差異表達的miRNA，其中miR-4505和miR-149-3p較對照組表達顯著升高，其余45組miRNA表達顯著降低；研究還確定了與活動性BD患者相關(guān)的特定miRNA特征，這些失調(diào)的miRNA通過靶向信號傳導途徑參與BD的發(fā)生，如TNF、IFN-γ、VEGF和VEGFR信號轉(zhuǎn)導通路等。Woo等[31]分析了BD患者PBMC中miRNA(miR-638、miR-4488、miR-3591-3p和miR-1915)的表達水平，分析結(jié)果顯示，與健康對照組相比，靜止期BD患者的miR-638和miR-4488 的表達水平降低；相較于靜止期BD患者，活動期BD患者的miR-3591-3p表達顯著增加；在脂多糖刺激下，活動期BD 患者PBMC中IL-6表達顯著上調(diào)； BD患者PBMC中分別轉(zhuǎn)染miR-638和miR-4488抑制劑以及miR-3591-3p模擬物后，可顯著增加IL-6 mRNA表達水平。該研究探索了BD患者的PBMC中相關(guān)miRNA的差異表達，并表明miRNA可對IL-6的產(chǎn)生起到調(diào)節(jié)作用。Zhou等[32]研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，BD患者PBMC和DC中miR-155表達顯著減少，而蛋白激酶結(jié)合蛋白2表達增加；體外實驗表明可通過改變miR-155水平調(diào)控靶基因TAB2蛋白水平的表達，發(fā)揮樹突狀細胞的細胞因子的作用，進而參與BD發(fā)病。Qi等[33]對miR-196a2的SNP進行了兩階段關(guān)聯(lián)研究，第一階段的研究結(jié)果顯示，BD患者miR-196 a2/rs11614913 TT基因型和T等位基因頻率較正常對照組顯著增高，而CC基因型在BD出現(xiàn)頻率顯著降低；第二階段的研究證實了rs11614913 TT基因型與CC基因型和C等位基因相比miR-196a表達減少，且miR-196a靶基因Bach1、炎癥因子IL-1β和MCP-1的表達增加；該研究揭示，rs11614913的miR-196a2表達的改變與BD的發(fā)生發(fā)展顯著相關(guān)，其主要通過調(diào)節(jié)基因表達與促炎細胞因子的產(chǎn)生，進而參與BD的發(fā)病。Qi等[34]采用熒光定量聚合酶聯(lián)反應、流式細胞術(shù)等探討Notch信號通路與相關(guān)miRNA在BD中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在BD活動期，Notch信號通路參與反應途徑且增強，使用DAPT阻斷Notch信號通路后能明顯抑制IL-17的產(chǎn)生及Th細胞的數(shù)量，表明其主要通過激活與信號轉(zhuǎn)導因子和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT3)磷酸化相關(guān)的Notch通路，促進Th17細胞反應，導致BD的發(fā)病。此外，與Notch1相關(guān)的miRNA中，僅miR-23b在BD患者CD4+T細胞中表達降低，揭示miR-23b在活動期BD的低表達是導致Notch信號通路異常和發(fā)病的主要原因。Zhou等[35]研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，BD患者中miR-146ars2910164位點CC基因型和C等位基因的頻率顯著降低，且該GG基因型個體miR-146a的表達分別比CC基因型和GC基因型高2.45倍和1.99倍，rs2910164位點 CC基因型在PBMC中IL-17和IL-1β的表達水平顯著低于GG基因型，該研究確定了中國漢族人群中miR-146a的rs2910164多態(tài)性與BD的相關(guān)性，且該SNP可能通過調(diào)節(jié)成熟miR-146a/表達和促炎細胞因子的產(chǎn)生，進而參與BD的發(fā)生。

近期研究表明，其它非編碼RNA如lncRNA的異常表達與自身免疫性疾病的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)[36-37]。lncRNA是炎癥免疫反應的重要調(diào)節(jié)因子，在各種生理過程中起著重要作用，包括轉(zhuǎn)錄、染色質(zhì)修飾及轉(zhuǎn)錄后的處理[38-39]。已有研究證實110個lncRNA的SNPs與Vogt-小柳原田綜合征、強直性脊柱炎等多種自身免疫性疾病的發(fā)病有關(guān)[40-41]，但參與BD發(fā)病的lncRNA及其具體機制仍有待進一步研究。

綜上，正確認識非編碼RNA參與BD發(fā)生的作用機制，將為BD的診斷與治療提供新的策略。

4 展望

本文通過探討異常DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA在BD發(fā)生發(fā)展中的重要作用，這加深了我們對BD的病因病理學的理解。然而，目前表觀遺傳因素參與BD發(fā)生的具體作用機制研究偏少，尚不能完全解決BD缺乏防治和預后特異性生物學標記物的難題。未來仍須更深入的研究表觀遺傳因素發(fā)生異常的原因及其作用機制，新的研究結(jié)果將可能為BD的臨床診斷、治療和預后提供新的途徑或新的靶點。