王娜 王彪 蔡灝漾 戚昱琦 陳愛明 唐子恒 古扎來?達(dá)吾坎爾

摘要：以篩選自健康桑樹葉片的1株多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）為研究對象，通過單因素試驗、正交試驗結(jié)合生物相容性確定可濕性粉劑的最佳配方，探討可濕性粉劑的促生效應(yīng)和安全毒理性，在此基礎(chǔ)上探索菌株促生和拮抗機(jī)制。結(jié)果表明，可濕性粉劑的最佳配方為發(fā)酵液70%、載體硅藻土10%、分散劑聚乙烯醇5%、濕潤劑十二烷基苯磺酸鈉10%、穩(wěn)定劑磷酸鉀2.5%、保護(hù)劑糊精2.5%。可濕性粉劑主要性能檢測結(jié)果顯示，菌含量約為7.0×108 CFU/g，懸浮率為92.99%，濕潤時間為20 s，細(xì)度為96.2%，pH值為 6.8，含水量為1.81%?？蓾裥苑蹌岱€(wěn)定性較好，耐受弱酸弱堿環(huán)境。平板對峙試驗結(jié)果表明，可濕性粉劑對桑青枯病病原菌5號小種和灰霉菌仍有較高的拮抗性能，灌根處理對番茄幼苗有明顯促生效果。浸根和莖穿刺處理對番茄幼苗無害;經(jīng)口灌胃試驗小鼠表明可濕性粉劑低毒性，對雄性個體影響較小，對雌性個體的傷害較大。培養(yǎng)基定性分析結(jié)果顯示菌株可產(chǎn)生鐵載體，能產(chǎn)生有機(jī)酸、胞外纖維素酶和蛋白酶，從而直接或間接促進(jìn)植物生長和抑制病原菌的生長。

關(guān)鍵詞：內(nèi)生菌;多黏類芽孢桿菌;可濕性粉劑;促生;毒性;抑菌活性

中圖分類號：S482.2+92? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）23-0115-10

收稿日期：2021-04-09

基金項目：江蘇科技大學(xué)博士啟動基金（編號：1102931901）。

作者簡介：王 娜（1976—），女，山東煙臺人，博士，副教授，主要從事植物病理學(xué)研究。E-mail：biojustwn@126.com。

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)受多方面制約，植物病害是其中主要因素之一。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，化學(xué)藥劑是防治植物病害的主要手段，雖然防治效果顯著，但是由于長期不合理使用，病原菌抗藥性增強(qiáng)、環(huán)境污染嚴(yán)重、生物多樣性破壞以及高毒高殘留等[1-4]負(fù)面問題層出不窮。隨著人們環(huán)保意識以及農(nóng)產(chǎn)品安全意識的不斷增強(qiáng)，生物防治受到了國內(nèi)外植物保護(hù)工作者的重視，其中對環(huán)境友好的微生物農(nóng)藥受到人們青睞[5]。

生防細(xì)菌作為微生物農(nóng)藥的開發(fā)源之一，同其他生防微生物相比具有存在廣泛、群體龐大、繁殖迅速、代謝活動復(fù)雜、對病原菌作用方式多樣等特點，成為開發(fā)熱點。目前研究者已從不同來源分離并鑒定出多種具有抗植物病原菌活性的生防細(xì)菌，其中以芽孢桿菌屬（Bacillus）和假單胞菌屬（Pseudomonas）生防細(xì)菌研究應(yīng)用最多[6-9]。生防細(xì)菌來源廣泛[10]，但植物內(nèi)生細(xì)菌因與植物互利共生、抗逆性強(qiáng)、危害小、定殖快等優(yōu)點，成為微生物農(nóng)藥研究的主要對象[11-12]。

目前，利用植物內(nèi)生菌作為微生物農(nóng)藥防治植物病害還存在一定問題。植物內(nèi)生菌本身是一個生物活體，運輸和保存對藥效保持有重要影響。用于生物防治時，田間環(huán)境（土壤、植株表面及根際分泌物等）和植物體微生態(tài)環(huán)境中許多因子都會影響內(nèi)生菌的生長和防病作用的發(fā)揮，從而造成內(nèi)生菌的防治效果不穩(wěn)定。同時內(nèi)生菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)研究尚不成熟，難以得到較為純凈的有效成分，進(jìn)而也影響了內(nèi)生菌的實際應(yīng)用。劑型的制備有利于生防菌的保護(hù)、稀釋和緩釋有效成分，擴(kuò)大微生物農(nóng)藥的使用范圍?？蓾裥苑蹌╓P）是以包括生防菌在內(nèi)的發(fā)酵液作為劑型化研究對象，既包含生防菌菌體又包含其產(chǎn)生的對植物病害有抑制作用的物質(zhì)，制劑的防效作用更大。同時成本低、活性穩(wěn)定，便于生產(chǎn)和商品化，是微生物農(nóng)藥的主要劑型[13]。

多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）是芽孢桿菌科（Bacillaceae）類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）革蘭氏陽性細(xì)菌，在自然界中分布廣泛[14]。多黏類芽孢桿菌可以產(chǎn)生多種性能穩(wěn)定的抗菌抑菌物質(zhì)，可以防治多種由卵菌、真菌、細(xì)菌和線蟲等引起的植物病害;同時還可以作為植物根際促生菌，通過產(chǎn)生激素、鐵載體、溶磷性等直接或間接促進(jìn)植物生長[15-18]。多黏類芽孢桿菌是被美國環(huán)境保護(hù)署（EPA）列為可商業(yè)應(yīng)用的微生物種類之一，可用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)和水處理等方面[19];2006年也被我國農(nóng)業(yè)部列為免做安全鑒定的一級菌種，是一種重要的病害生物防治微生物。

筆者所在課題組在前期工作中從健康桑樹葉片中分離篩選出1株多黏類芽孢桿菌，對多種植物病原細(xì)菌和病原真菌具有廣譜抗性，根際澆灌植物，能促進(jìn)植物生長，在生物防治方面具有一定的潛能[20]。本研究以此菌株發(fā)酵液為原藥，研究不同載體、濕潤劑、分散劑和保護(hù)劑等助劑與菌細(xì)胞的生物相容性，通過正交試驗篩選可濕性粉劑的優(yōu)良配方，并測定該制劑對番茄生長的影響以及應(yīng)用安全性和毒理性，并初步探究該菌株的促生長和拮抗特性，為此多黏類芽孢桿菌的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗時間及地點

試驗于2019—2020年在江蘇省鎮(zhèn)江市四擺渡江蘇科技大學(xué)西校區(qū)植物生物技術(shù)試驗室開展。

1.2 供試菌株

供試內(nèi)生菌株381分離自健康桑樹（Morus alba L.）葉片，桑葉于2018年4月采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所國家種質(zhì)鎮(zhèn)江桑樹圃（桑樹品種為9703）。生防細(xì)菌對多種病原細(xì)菌和病原真菌有較強(qiáng)拮抗作用。結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化特征以及16S rRNA序列分析鑒定其為多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）[20]，現(xiàn)保存在江蘇科技大學(xué)植物生物技術(shù)試驗室。

供試病原細(xì)菌為桑青枯菌5號小種（Ralstonia solanacearum race 5），由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所桑病研究室提供。供試病原真菌為灰霉菌（Botrytis cinerea），由江蘇科技大學(xué)植物生物技術(shù)試驗室提供。

1.3 可濕性粉劑的制備

1.3.1 菌株粉劑制備液制備

用接種環(huán)將菌株接種于LB（lysogeny broth）液體培養(yǎng)基中（50 mL/150 mL），37? ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，即得種子液。將種子液以體積分?jǐn)?shù)3%接種量接入裝液量為125 mL/250 mL的LB液體培養(yǎng)基中，32 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng) 20 h，即得粉劑制備液。經(jīng)測定制備液中菌含量為2.0×108～7.0×108 CFU/mL，芽孢率≥90%。

1.3.2 載體與助劑的初步篩選

分別將載體（滑石粉、高嶺土、硅藻土、輕質(zhì)碳酸鈣）按照質(zhì)量濃度為5%的比例，分散劑[木質(zhì)素磺酸鈉、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）、聚乙烯醇（PVA）]按1.5 mg/mL的比例，濕潤劑[十二烷基硫酸鈉（SDS）、十二烷基苯磺酸鈉（SDBS）、皂莢粉]按照0.25 mg/mL的比例，穩(wěn)定劑[碳酸鈣（CaCO3）、磷酸鉀（K3PO4）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）]按照1.0 mg/mL的比例添加進(jìn)LB培養(yǎng)基內(nèi)，高壓蒸汽滅菌后，制成平板。吸取1 mL粉劑制備液稀釋105倍，分別取0.1 mL稀釋液涂布在含有不同載體、分散劑、濕潤劑和穩(wěn)定劑的LB培養(yǎng)基平板上，以LB培養(yǎng)基作對照，每組3次重復(fù)。將平板置于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)12 h，記錄各平板菌落數(shù)量，初步篩選出優(yōu)勢載體和助劑[21]。

1.3.3 可濕性粉劑的母粉制備

將生防菌粉劑制備液與初步篩選出的優(yōu)勢載體、分散劑、濕潤劑和穩(wěn)定劑按照制備液70%、載體15%、分散劑5%、濕潤劑5%和穩(wěn)定劑5%的比例混合攪勻，真空冷凍干燥24 h。干燥后的粉劑研磨成粉，制成可濕性粉劑母粉，用于復(fù)篩分散劑和濕潤劑。

1.3.4 分散劑與濕潤劑的復(fù)篩

在母粉制作中，制備液、載體、濕潤劑和穩(wěn)定劑種類及比例不變，分別將3種分散劑按照5%比例添加進(jìn)母粉中，以不添加分散劑為對照，綜合懸浮率、潤濕力和生物相容性考慮，選擇效果最佳分散劑。

在母粉制作中，制備液、載體和穩(wěn)定劑種類及比例不變，按5%比例添加上述篩選的最佳分散劑，分別將3種濕潤劑按照5%比例添加進(jìn)母粉中，以不添加濕潤劑為對照，綜合懸浮率、潤濕力和生物相容性考慮，選擇效果最佳的濕潤劑。

1.3.5 正交設(shè)計

在上述試驗的基礎(chǔ)上，為了使可濕性粉劑的濕潤時間和懸浮率達(dá)到最優(yōu)，利用正交試驗法（表1），以懸浮率和濕潤時間為考察因素，對篩選出的載體和助劑進(jìn)行考察，以確定最佳添加比例。

1.3.6 紫外保護(hù)劑的篩選

將4種紫外保護(hù)劑抗壞血酸、熒光素鈉、糊精和黃原膠按與穩(wěn)定劑添加量相同的比例添加到已確定的最佳配比中，制成可濕性粉劑。將可濕性粉劑和無菌蒸餾水按照1 g ∶9 mL的比例混合均勻，置于距離紫外燈（254 nm，20 W）40 cm處照射12、24 h。將粉劑液用無菌蒸餾水稀釋104倍，取0.1 mL涂布在LB平板上，37 ℃ 培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)12 h，計算存活率。以不加保護(hù)劑作對照，每個處理重復(fù)3次。

1.4 可濕性粉劑指標(biāo)檢測

1.4.1 粉劑懸浮率、濕潤時間、細(xì)度和pH值

按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T14825—2006[22]、GB/T5451—2001[23]、GB/T16150—1995[24]、GB/T1601—1993[25]分別對粉劑的懸浮率、濕潤時間、細(xì)度、pH值進(jìn)行測定。

1.4.2 粉劑含水量

稱取 10 g 樣品放在已準(zhǔn)確稱量的培養(yǎng)皿（m1）中，105 ℃烘箱中持續(xù)烘干至恒質(zhì)量（m2）。含水率=（m1+10-m2）/10×100%。

1.4.3 粉劑穩(wěn)定性

熱穩(wěn)定性：1 g粉劑用500 mL無菌蒸餾水稀釋，平均分成5份，分別置于25、30、50、75、100 ℃溫度下水浴20 min，冷卻至室溫。各取 0.1 mL 稀釋液均勻涂布在LB平板上，每組重復(fù)3次。將平板放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，記錄平板菌落數(shù)。

酸堿穩(wěn)定性：1 g粉劑用500 mL蒸餾水稀釋制成稀釋液。取稀釋液8份，每份50 mL，分別用 0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH調(diào)至pH值為 4、5、6、7、8、9、10、11。各取0.1 mL稀釋液均勻涂布在LB平板上，每組重復(fù)3次。將平板放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，記錄平板菌落數(shù)[26]。

1.5 可濕性粉劑安全性和毒理性試驗

1 g粉劑用500 mL蒸餾水稀釋制成稀釋液。取在盆缽中培育30 d且生長良好、長勢一致的番茄幼苗20株（1株/盆），分為4組，每組5株。對2組試驗組幼苗進(jìn)行浸根和針穿刺莖處理。浸根處理時將幼苗小心拔起，流水清洗去掉浮土，再用無菌水反復(fù)沖洗多次。將幼苗根完全浸泡在粉劑稀釋液中 30 min，以無菌水處理作對照，處理后重新移栽在滅菌營養(yǎng)土中，常規(guī)培養(yǎng)14 d后觀察生長情況。針穿刺莖處理時在幼苗莖高度一半的位置用滅菌刀片劃5 mm的小口并用移液槍吸取40 μL粉劑稀釋液接種，以無菌水作對照。常規(guī)培養(yǎng)14 d后觀察生長情況。

依據(jù)文獻(xiàn)[27]，以小鼠為材料，運用霍恩氏法將小白鼠分為劑量組1（0.316 mg/20 g）、劑量組2（1.000 mg/20 g）、劑量組3（3.160 mg/20 g）、劑量組4（10.000 mg/20 g）、空白對照組（0 mg/20 g）以測定半數(shù)致死量（LD50）。每組10只，雌雄各半（5雄5雌），灌胃前隔夜禁食但不禁水，稱質(zhì)量后1次灌胃給藥，灌胃后至少間隔3 h進(jìn)食。4組分別按劑量組用量 2 mL 無菌水稀釋后經(jīng)口灌胃。以14 d（每天固定時間灌胃1次）為1個周期測試粉劑急性經(jīng)口毒性，并分析小鼠體質(zhì)量和臟器系數(shù)變化，確定粉劑毒理性。

1.6 可濕性粉劑對病原菌的抑制效果

取直徑為6 mm的病原菌菌塊接種在KB培養(yǎng)基（病原細(xì)菌）和馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基（病原真菌）平板中央，兩側(cè)適當(dāng)距離處各放一無菌濾紙片（直徑6 mm）。0.1 g粉劑用50 mL無菌蒸餾水稀釋，取20 μL粉劑稀釋液滴加在濾紙片上，37 ℃ 靜置培養(yǎng)24 h，觀察試驗結(jié)果。

1.7 可濕性粉劑促生效果試驗

取生長良好、生長勢一致的15 d盆栽番茄幼苗（1棵/盆），試驗組每2 d澆灌1次粉劑稀釋液，每次50 mL，以澆灌蒸餾水為對照。每組重復(fù)10次，培養(yǎng)30 d，觀察番茄幼苗生長效果[28]。

1.8 菌株的促生長和拮抗特性分析

1.8.1 促生長特性分析

溶磷性分析：將菌株點接在NBRIP培養(yǎng)基[葡萄糖10.00 g，MgCl2·6H2O 5.00 g，Ca3（PO4）2 5.00 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，KCl 0.20 g，（NH4）2SO4 0.10 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0]平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)4 d，觀察是否有無色透明圈[29]。

產(chǎn)鐵載體分析：將菌株點接在CAS培養(yǎng)基平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)4 d，觀察是否有黃色光圈[30]。

產(chǎn)吲哚-3-乙酸（IAA）分析：將菌株接種于濃度為100 mg/L色氨酸的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h。取100 μL菌懸液滴于白色瓷板上，同時加入等量的Salkowski顯色液進(jìn)行顯色反應(yīng)。同時以加入100 μL IAA（50 mg/L）的標(biāo)準(zhǔn)溶液為陽性對照。室溫避光條件下30 min后，若顏色變紅則表示有IAA產(chǎn)生[31]。

1.8.2 拮抗特性

產(chǎn)有機(jī)酸分析：將菌株點接在產(chǎn)有機(jī)酸分析培養(yǎng)基（葡萄糖6.0 g，酵母浸膏1.0 g，蛋白胨1.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCO3 1.0 g，溴甲酚紫微量，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH值為7.2～7.4）平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)2 d，觀察是否有黃色的光圈[32]。

產(chǎn)纖維素酶分析：配制產(chǎn)纖維素酶分析培養(yǎng)基（葡萄糖1.0 g，酵母浸膏0.1 g，蛋白胨0.5 g，瓊脂15.0 g，羧甲基纖維素鈉5.0 g，蒸餾水1 000 mL），將菌株點接在平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)3 d。培養(yǎng)皿中加入0.2 %剛果紅染液，40 min后倒掉染色液，再加入1 mol/L NaCl脫色15 min，觀察是否有黃色降解圈[33]。

產(chǎn)蛋白酶分析：配制產(chǎn)蛋白酶分析培養(yǎng)基（葡萄糖1.0 g，酵母浸膏0.1 g，蛋白胨0.5 g，瓊脂 15.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH值為6.0。高壓滅菌后再加入50 mL滅菌的8%明膠溶液），將菌株點接在平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)3 d。培養(yǎng)皿中加入飽和硫酸銨溶液浸沒菌落，30 min后倒掉溶液，觀察是否有無色透明圈[33]。

產(chǎn)幾丁質(zhì)酶分析：將菌株點接在產(chǎn)幾丁質(zhì)酶分析培養(yǎng)基（膠體幾丁質(zhì)5.0 g，蛋白胨5.0 g，酵母浸膏2.5 g，NaCl 5.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH值為7.0～7.4）平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)2 d，觀察是否有無色透明圈[34]。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2007軟件處理數(shù)據(jù)和制圖，采用SPSS軟件Duncans多重分析進(jìn)行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體及助劑的初篩

以粉劑活菌量為檢測指標(biāo)，從生物相容性的角度來分析，高嶺土、滑石粉和輕質(zhì)碳酸鈣3種載體顯著抑制生防菌的生長，而硅藻土與對照組差異不顯著（圖1-A）;SDS、SDBS和皂莢粉3種濕潤劑中，SDS對生防菌生長影響最大，SDBS的影響次之，而皂莢粉對菌生長基本無影響（圖1-B）;木質(zhì)素磺酸鈉和PVA對生防菌生長有一定的影響，但CMC-Na與對照組相比差異不顯著（圖1-C）;碳酸鈣、磷酸鉀、磷酸二氫鉀、CMC-Na 4種穩(wěn)定劑中，磷酸鉀對生防菌的活性影響很小，與對照組差異不顯著（圖1-D）。初步確定選擇硅藻土、皂莢粉、CMC-Na和磷酸鉀制備可濕性粉劑的母粉。

2.2 助劑中分散劑和濕潤劑的復(fù)篩

濕潤時間和懸浮率是評價可濕性粉劑的2個重要指標(biāo)，國標(biāo)要求可濕性粉劑懸浮率≥70%，濕潤時間≤120 s，因此對濕潤劑和分散劑進(jìn)一步復(fù)篩。將分散劑木質(zhì)素磺酸鈉、CMC-Na和PVA分別按照5%比例添加進(jìn)母粉中，測定母粉懸浮率和濕潤時間。結(jié)果（表2）表明，PVA的分散效果[（88.09±2.03）%]和濕潤時間[（74.00±5.29）s]均達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)要求。又因為其生物相容性較好，最終確定分散劑為PVA。以相同方法測定濕潤劑對母粉的影響，結(jié)果（表3）表明SDBS的分散性和濕潤時間均最佳，由于其生物相容性較好，最終確定濕潤劑為SDBS。

2.3 載體和助劑最佳配比優(yōu)化

經(jīng)過上述篩選，確定可濕性粉劑的載體為硅藻土，濕潤劑為十二烷基苯磺酸鈉（SDBS），分散劑為聚乙烯醇（PVA），穩(wěn)定劑為磷酸鉀。由表4可知，A因素載體對懸浮率和濕潤時間的影響均較大，說明載體的用量不易過少，但是載體為A2和A3時懸浮率都達(dá)不到國家標(biāo)準(zhǔn)（懸浮率≥70%），所以選擇載體A1（10%）。各組合中濕潤時間均符合國家標(biāo)準(zhǔn)（濕潤時間≤120 s），因此懸浮率為主要選擇指標(biāo)。正交試驗表中A1B3C3D1組合的懸浮率為最佳配方組合，此組合不在試驗組合中。補(bǔ)充試驗結(jié)果表明，A1B3C3D1的懸浮率不符合國家標(biāo)準(zhǔn)。而組合A1B3C3D3的懸浮率達(dá)到了國家標(biāo)準(zhǔn)，所以選擇A1B3C3D3作為試驗配比，制備可濕性粉劑。

2.4 紫外保護(hù)劑的篩選

當(dāng)可濕性粉劑施用時，菌體會受到紫外線照射，影響活性，使粉劑生防效果大大減弱。在粉劑中加入紫外保護(hù)劑，可吸收掉大部分的紫外輻射從而保持生防菌的活性。按照“2.3”節(jié)中確定的最優(yōu)配方并加入2.5%的紫外線保護(hù)劑，篩選最佳保護(hù)劑。由表5可知，在經(jīng)過紫外線（UV）照射12 h后，添加黃原膠和糊精的可濕性粉劑芽孢存活率和菌含量均較高，但是經(jīng)24 h UV照射后，添加黃原膠的粉劑芽孢存活率和菌細(xì)胞含量都有所下降，因此選擇糊精作為紫外保護(hù)劑。

2.5 可濕性粉劑指標(biāo)檢測

根據(jù)篩選的載體和助劑及紫外保護(hù)劑制備生防菌可濕性粉劑（表6），經(jīng)測定懸浮率為92.99%，濕潤時間為20 s，細(xì)度為96.2%，pH值為6.8，含水量為1.81%，菌含量約7.0×108 CFU/g，均符合國家標(biāo)準(zhǔn)值。

可濕性粉劑經(jīng)不同溫度（25、35、50、75、100 ℃）處理20 min后，溫度低于50 ℃時菌含量保持穩(wěn)定;隨著溫度的上升，菌含量逐漸降低但是仍保持在一定水平，表明可濕性粉劑的耐熱性較強(qiáng)（圖2-A）。因此在大田使用時不會受到實際環(huán)境溫度的影響。從酸堿處理結(jié)果可以看出，粉劑在pH值為6～9時保持較高的菌含量，且彼此間差異不顯著，表明粉劑在弱酸弱堿環(huán)境下菌活性保持穩(wěn)定（圖2-B）。自然界中潔凈水的pH值范圍基本上都在6～9之間，實際使用時只需用常規(guī)潔凈水稀釋即可。

2.6 可濕性粉劑抑菌效果和盆栽促生效果

用平板對峙法檢測可濕性粉劑對2種指示菌的抑制效果，結(jié)果（圖3）表明該粉劑對桑青枯病病原菌5號小種和灰霉菌有良好的抑制效果。說明粉劑制備過程中仍然保持了生防菌的抑菌特性。

1 g粉劑用500 mL蒸餾水稀釋制成稀釋液澆灌番茄幼苗。經(jīng)15 d和30 d灌根處理，試驗組番茄長勢良好，無病變發(fā)生，高度和增長率均顯著高于對照組（表7）。表明可濕性粉劑能促進(jìn)番茄生長，保持了生防菌的促生長特性。

2.7 可濕性粉劑安全性和毒理性分析

經(jīng)過稀釋液浸根和穿刺處理的番茄幼苗移栽后生長發(fā)育狀況正常，番茄幼苗的葉片未出現(xiàn)黃葉和枯萎狀況，莖部和根系無病變狀況發(fā)生，與對照組無明顯差異，表明可濕性粉劑對植物無危害。

對小鼠經(jīng)口灌胃14 d后，高劑量組（劑量組3和劑量組4）小鼠行動遲緩、精神低郁;低劑量組（劑量組1和劑量組2）小鼠活動正常，行動靈敏。通過霍恩氏法測定半數(shù)致死量LD50>500 mg/kg，確定可濕性粉劑為低毒性（表8）。各組小鼠在經(jīng)口灌胃后，雌雄小鼠體質(zhì)量增長率受影響程度不同。低劑量組對雄性小鼠體質(zhì)量增長無影響，但高劑量組顯著抑制小鼠體質(zhì)量增加（P<0.05）;雌性小鼠中劑量組1顯著增加小鼠體質(zhì)量，而劑量組2和劑量組3對生長無影響，劑量組4則明顯抑制雌性小鼠生長（P<0.05）（表9）。4個劑量組粉劑對雄性小鼠的心臟、脾臟、腎臟和胃均無傷害，甚至在一定程度上能夠促進(jìn)其生長發(fā)育，但對肝臟有顯著影響（P<0.05）;雌性小鼠中除了對胃無影響外，4個劑量組對心臟、脾臟、腎臟和肝臟均有顯著影響（P<0.05）（表10）。表明可濕性粉劑具有一定毒性，但對雄性個體影響較小，對雌性個體影響較大。

2.8 菌株的促生長和拮抗特性分析

在定性分析試驗中，溶磷性檢測培養(yǎng)基和幾丁質(zhì)酶檢測培養(yǎng)基平板上菌落周圍無無色透明圈，液體培養(yǎng)加入顯色劑后無紅色產(chǎn)生，表明菌株無溶磷性、不能產(chǎn)生IAA和胞外幾丁質(zhì)酶。產(chǎn)鐵載體、有機(jī)酸、蛋白酶和纖維素酶檢測培養(yǎng)基平板上菌落周圍有明顯的透明圈或光圈形成， 表明菌株381可產(chǎn)生鐵載體、有機(jī)酸、蛋白酶和纖維素酶（圖4）。

3 討論與結(jié)論

生物農(nóng)藥的開發(fā)利用既提高了經(jīng)濟(jì)效益，又保護(hù)生態(tài)環(huán)境，是當(dāng)前農(nóng)藥行業(yè)綠色發(fā)展的重要方式[35]。生物農(nóng)藥菌劑的研制，微生物活性是決定生防菌能否走向市場的關(guān)鍵[36]。農(nóng)藥中可濕性粉劑不使用溶劑和乳化劑，對植物較為安全。但可濕性粉劑中的載體和助劑，不僅影響菌劑的理化性質(zhì)，還與微生物活性密切相關(guān)，因此必須考慮載體和助劑與微生物的相容性，保證生防菌的數(shù)量。本試驗以單因素和正交試驗相結(jié)合的方法探究載體和各種助劑與生防菌多黏類芽孢桿菌381的相容性，并測定可濕性粉劑的重要指標(biāo)，以此篩選出最佳的載體和助劑及其配比。通過對載體、濕潤劑、分散劑、穩(wěn)定劑、紫外保護(hù)劑的篩選，確定多黏類芽孢桿菌381可濕性粉劑的最佳配比為發(fā)酵液70%、硅藻土10%、聚乙烯醇（PVA）5%、十二烷基苯磺酸鈉（SDBS）10%、磷酸鉀2.5%、糊精 2.5%。該配方的可濕性粉劑的懸浮率為92.99%，濕潤時間為 20 s， 菌含量約7.0×108 CFU/g，各項指標(biāo)均達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)。

可濕性粉劑是以包括生防菌在內(nèi)的發(fā)酵液作為劑型化研究的對象，既包含生防菌菌體又包含其產(chǎn)生的對植物病害有抑制作用的物質(zhì)，防治作用更大。目前可濕性粉劑是微生物農(nóng)藥的主要劑型，在生產(chǎn)上得到廣泛應(yīng)用[26]。多黏類芽孢桿菌是具有極高應(yīng)用價值的安全生防菌株，對青枯病、枯萎病、根腐病、軟腐病等多種土傳植物病害有較好的防控效果[37-38]。多名學(xué)者對多黏類芽孢桿菌可濕性粉劑的制備及其應(yīng)用進(jìn)行了研究[39-41]。本試驗測定的可濕性粉劑主要性能指標(biāo)均明顯高于其他研究研制的可濕性粉劑，但菌含量略低，這可能與381菌株粉劑制備液的配制有關(guān)。

可濕性粉劑的載體是一種惰性填料，具有多網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)或片、層狀結(jié)構(gòu)，有較強(qiáng)的吸附能力和吸附容量。載體在可濕性粉劑中占有較大比例，對制劑的性能和微生物活性有主要影響。賀振寧等制備枯草芽孢桿菌 B1514可濕性粉劑[42]，李磊等制備解淀粉芽胞桿菌Ht-q6可濕性粉劑[43]，凡超等制備發(fā)光桿菌可濕性粉劑[44]時，都選用硅藻土作為載體，與本試驗確認(rèn)的載體一致。而硅藻土與蘇云金芽孢桿菌、白僵菌[45]以及解淀粉芽孢桿菌BA-12[26]的相容性較差。由此可見，不同種類的載體對微生物的存活和活性影響差異很大，即使同一載體，不同微生物也會產(chǎn)生不一樣的效果。

助劑不僅可以提高防效，延長貨架期，還能降低成本。倪榮等的研究表明，PVA和CMC-Na對可濕性粉劑的濕潤時間有不同的影響。本研究中PVA大大降低可濕性粉劑的濕潤時間，與其結(jié)果一致[46]。此外，明亮等研究發(fā)現(xiàn)，可濕性粉劑的理化因素會在干燥、粉碎過程中受到影響[47]。因此，生防菌381可濕性粉劑的工藝優(yōu)化還可以進(jìn)行進(jìn)一步完善。

本試驗制備的可濕性粉劑的耐熱性良好，溫度低于50 ℃時菌含量保持穩(wěn)定，溫度較高時菌含量仍保持在較高水平。因此，田間葉片噴施或者灌根使用時，實際環(huán)境溫度不會影響粉劑的作用效果。粉劑稀釋液pH值偏中性，在pH值為6～9時保持較高的菌含量，且彼此間差異不顯著。自然界中潔凈水的pH值范圍基本上都在6～9之間，實際使用時只需用常規(guī)潔凈水稀釋懸浮，無需特殊處理，而且此pH值范圍也不受植物體本身酸堿度的影響。粉劑處理番茄幼苗，對植物無毒害作用;小鼠經(jīng)口灌胃試驗結(jié)果表明粉劑對動物有一定的毒害作用，但屬于低毒級別，田間可以放心施用。

鐵是植物生命活動的重要營養(yǎng)元素，參與或調(diào)控了光合作用、呼吸作用、固氮、DNA合成等多個代謝過程。在自然界中，鐵主要以難溶的Fe3+化合物形式存在，可溶性鐵含量相對較低，使鐵的生物有效性大大降低。鐵載體（siderophore）是生長在低鐵環(huán)境中的細(xì)菌、真菌合成的一類具有高度專一性的低分子量的鐵螯合劑。在缺鐵條件下，微生物依賴其分泌的鐵載體來溶解、運輸環(huán)境中的難溶性鐵，提高土壤中有效鐵的濃度，同時被微生物同化的鐵在微生物死亡或鐵載體被分解后可釋放出來被植物所利用[48]。試驗菌株381及其粉劑均能夠促進(jìn)植物生長，鐵載體的分泌發(fā)揮著一定的作用。

鐵載體在生防菌抑制病原菌中也發(fā)揮著重要作用。大部分病原微生物不具有分泌鐵載體的能力或能力很低。低鐵環(huán)境中生防菌分泌鐵載體到環(huán)境中，螯合鐵來維持自身生長的需要，并且分泌的鐵載體一般不會被病原微生物利用，因此創(chuàng)造了鐵濃度更低的環(huán)境從而抑制植物病原菌的生長[49]。菌株381及其粉劑可有效抑制檢測菌株的生長，定性平板檢測除了能夠分泌鐵載體外，還能夠分泌有機(jī)酸，產(chǎn)生胞外纖維素酶和蛋白酶。有機(jī)酸可通過能量競爭、透化細(xì)菌外膜、提高胞內(nèi)滲透壓、抑制生物大分子合成、誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗菌肽等方式抑制微生物生長[50-52];蛋白酶屬于水解酶類，可有效分解蛋白質(zhì)，通過抑制細(xì)菌體外生物膜的形成、破壞細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的結(jié)構(gòu)或真菌細(xì)胞壁蛋白質(zhì)成分等方式達(dá)到抑制微生物生長的效果[53-54];低等真菌細(xì)胞壁成分以纖維素為主，而高等真菌則以幾丁質(zhì)為主，纖維素酶或幾丁質(zhì)酶可有效破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步影響真菌的生長。前期試驗中菌株381還可能代謝產(chǎn)生生物堿、黃酮或萜類物質(zhì)，這些物質(zhì)在一定程度上均有殺菌抑菌的作用[20]。因此菌株381及其粉劑對多種病原細(xì)菌或真菌的廣譜抗性可能是其產(chǎn)生的多種物質(zhì)綜合作用的結(jié)果。

本研究中，確定了內(nèi)生生防菌381可濕性粉劑的配方、性質(zhì)、安全性、毒理性、抑菌性及其促生效果，并初步探索了促生和抑菌的可能機(jī)制。但是菌株在植物體內(nèi)的定殖繁殖規(guī)律、粉劑在田間施用的防控效果及防控注意因素、菌株與其他生物間的作用關(guān)等還需要進(jìn)一步探究。

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