閆學(xué)敏 吳英華 史艷 武喆 侯雷平 李梅蘭

摘要：胡蘿卜是重要的根菜類蔬菜之一，根部性狀影響最終的產(chǎn)量和品質(zhì)。YUCCA基因通過(guò)介導(dǎo)生長(zhǎng)素調(diào)控植物根部發(fā)育，是生長(zhǎng)素合成途徑中的關(guān)鍵基因。利用生物信息學(xué)方法對(duì)胡蘿卜YUCCA基因家族成員進(jìn)行鑒定，對(duì)其理化性質(zhì)、染色體定位、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)、蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)以及保守基序進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在胡蘿卜的5條染色體上共鑒定到了14個(gè)YUCCA基因家族成員，其大部分基因含有3～4個(gè)外顯子;該家族編碼的蛋白質(zhì)為富含堿性氨基酸的親水性蛋白質(zhì)，氨基酸數(shù)量為290～424個(gè)，其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可將其分為3個(gè)亞族，且亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，YUCCA基因家族蛋白質(zhì)大部分被定位在細(xì)胞質(zhì)中。這為YUCCA基因家族在調(diào)控胡蘿卜根發(fā)育和膨大機(jī)制研究奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：胡蘿卜;生長(zhǎng)素;YUCCA基因家族;生物信息學(xué);蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu);染色體定位

中圖分類號(hào)：S631.201? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）23-0052-06

收稿日期：2021-07-16

基金項(xiàng)目：山西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目子課題（編號(hào)：201703D211001-04-01）;山西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：201903D221063）。

作者簡(jiǎn)介：閆學(xué)敏（1997—），女，山西呂梁人，碩士研究生，主要從事蔬菜育種及生物技術(shù)應(yīng)用研究。E-mail：464679520@qq.com。

通信作者：李梅蘭，博士，教授，主要從事蔬菜育種及生物技術(shù)應(yīng)用研究。E-mail：15935485975@163.com。

植物根系的生長(zhǎng)發(fā)育存在著復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，受到環(huán)境、生理、激素等多種因素的影響[1]。近年來(lái)，植物激素作為調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育的一大類物質(zhì)而被研究者廣泛關(guān)注，生長(zhǎng)素是最早發(fā)現(xiàn)的植物生長(zhǎng)類激素，其代謝調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究較為廣泛[2]。其中，YUCCA基因家族已經(jīng)被證明調(diào)控植物的根系發(fā)育，在生長(zhǎng)素生物合成的吲哚丙酮酸途徑中YUCCA基因家族是重要酶之一，其基因編碼黃素單加氧酶（flavin-containing monooxygenase，簡(jiǎn)稱FMOs）[3-4]。YUCCA基因首次被鑒定是在擬南芥生長(zhǎng)素過(guò)量的突變體研究中[5]，目前該基因家族已經(jīng)在煙草[6]、擬南芥[7]、水稻[8]、草莓[9]等作物中進(jìn)行了全基因組鑒定分析，但在胡蘿卜中還未見(jiàn)類似的報(bào)道。

胡蘿卜（Daucus carota var. sativa DC.）是以肉質(zhì)根為食用器官的二年生草本植物，是全球性十大蔬菜中的一種。根是植物在進(jìn)化過(guò)程中適應(yīng)陸地生活而發(fā)展起來(lái)的營(yíng)養(yǎng)器官，胡蘿卜作為重要的根菜類蔬菜之一，研究其根部的生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)提高胡蘿卜的品質(zhì)和產(chǎn)量至關(guān)重要。有研究表明，生長(zhǎng)素在植物根尖形成的梯度濃度調(diào)控其合成和運(yùn)輸，從而影響植物的根際發(fā)育[10]。因此，本試驗(yàn)利用生物信息學(xué)方法鑒定胡蘿卜YUCCA基因家族，對(duì)其理化性質(zhì)、染色體定位、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)、蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)以及保守基序進(jìn)行分析，進(jìn)一步為胡蘿卜YUCCA基因功能驗(yàn)證提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 胡蘿卜YUCCA基因家族數(shù)據(jù)獲取與鑒定

通過(guò)擬南芥官網(wǎng)TAIR（https：//www.arabidopsis.org/）獲取已報(bào)道過(guò)的YUCCA基因家族成員的蛋白質(zhì)序列，在NCBI網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）使用BlastP檢索，設(shè)置E-value值為10-5，獲得擬南芥、煙草、玉米和胡蘿卜中的YUCCA基因家族候選基因的蛋白質(zhì)序列和基因序列的fasta格式。通過(guò)CDD和SMART數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)驗(yàn)證候選基因的蛋白質(zhì)序列結(jié)構(gòu)域[11]，最終獲得11個(gè)擬南芥YUCCA基因、20個(gè)煙草YUCCA基因、30個(gè)玉米YUCCA基因和14個(gè)胡蘿卜YUCCA基因，并對(duì)其分別命名。

1.2 胡蘿卜YUCCA蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

將篩選出的14個(gè)胡蘿卜YUCCA基因家族蛋白質(zhì)序列通過(guò)ExPASy（https：//web.expasy. org/protparam/）在線網(wǎng)站分析其理化性質(zhì)[12]。

1.3 胡蘿卜YUCCA基因的染色體定位

從NCBI上獲取基因的染色體位置信息，使用在線網(wǎng)站MG2C_V2.0（http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）對(duì)基因進(jìn)行染色體定位繪圖并簡(jiǎn)單修飾。

1.4 擬南芥、煙草、玉米和胡蘿卜YUCCA基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

在軟件MEGA 7.0中對(duì)比4個(gè)物種的蛋白質(zhì)序列，采用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，bootstrap設(shè)為1 000[13]。用在線網(wǎng)站iTOL（https：//itol.embl.de/itol.cgi）對(duì)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行環(huán)化。

1.5 胡蘿卜YUCCA蛋白質(zhì)二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及亞細(xì)胞定位

通過(guò)在線網(wǎng)站SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）和CELLO（http：//cello.life.nctu.edu.tw/）分別對(duì)胡蘿卜YUCCA基因家族的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和亞細(xì)胞定位。通過(guò)在線網(wǎng)站SWISS-MODEL（https：//swissmodel. expasy.org/）對(duì)胡蘿卜YUCCA基因家族的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)模型分析[14]。

1.6 胡蘿卜YUCCA基因家族的基因結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)保守基序分析

將14個(gè)基因的CDS和FASTA文件導(dǎo)入在線網(wǎng)站GSDS 2.0（http：//gsds.gao-lab.org/index.php）進(jìn)行胡蘿卜YUCCA基因結(jié)構(gòu)分析[15]。使用MEME在線網(wǎng)站（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）和TBtools對(duì)胡蘿卜YUCCA蛋白質(zhì)的保守基序進(jìn)行分析[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 胡蘿卜YUCCA蛋白質(zhì)理化性質(zhì)

通過(guò)對(duì)胡蘿卜YUCCA基因家族的蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)分析（表1）可知，YUCCA蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)為290～424個(gè)，相對(duì)分子質(zhì)量為32.14～47.32 ku，氨基酸數(shù)和分子質(zhì)量最大的均為蛋白質(zhì)DcYUCCA3b，最小的均為蛋白質(zhì)DcYUCCA6;等電點(diǎn)為6.61～935;不穩(wěn)定系數(shù)為31.98～50.25，其中蛋白質(zhì)DcYUCCA5a、DcYUCCA5b、DcYUCCA5c、DcYUCCA5d、DcYUCCA10a和DcYUCCA10b均為穩(wěn)定蛋白，其余的蛋白質(zhì)（DcYUCCA2、DcYUCCA3a、DcYUCCA3b、 DcYUCCA6、 DcYUCCA8a、 DcYUCCA8b、DcYUCCA8c和DcYUCCA9）為不穩(wěn)定蛋白;親水性均為負(fù)值，說(shuō)明胡蘿卜中YUCCA蛋白質(zhì)均為親水性蛋白。

2.2 胡蘿卜YUCCA基因的染色體定位

胡蘿卜共有9條染色體。染色體定位結(jié)果（圖1）顯示，胡蘿卜YUCCA基因家族中有7個(gè)基因被定位在1號(hào)染色體上，分布最多，基因存在聚集現(xiàn)象，說(shuō)明這類基因功能具有一定的相似性。其次，有2個(gè)基因被定位在3號(hào)染色體上，2個(gè)基因被定位在5號(hào)染色體上，2個(gè)基因被定位在8號(hào)染色體上，1個(gè)基因被定位在9號(hào)染色體上。

2.3 擬南芥、煙草、玉米和胡蘿卜YUCCA基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

為進(jìn)一步了解胡蘿卜YUCCA基因家族進(jìn)化情況，選用擬南芥（11個(gè)）、煙草（20個(gè)）、玉米（30個(gè)）YUCCA基因家族基因?yàn)閰⒖夹蛄袠?gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖2），結(jié)果分為6個(gè)亞族。其中胡蘿卜YUCCA基因家族主要分布在Ⅵ亞族中，有10個(gè)基因，其次為Ⅲ和Ⅴ亞族中。

2.4 胡蘿卜YUCCA蛋白質(zhì)二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及亞細(xì)胞定位

對(duì)胡蘿卜YUCCA蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果（表2）顯示，14個(gè)蛋白質(zhì)主要以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成。為了驗(yàn)證二級(jí)結(jié)構(gòu)的結(jié)果準(zhǔn)確性，對(duì)14個(gè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行模型預(yù)測(cè)（圖3），結(jié)果顯示三級(jí)結(jié)構(gòu)與二級(jí)結(jié)構(gòu)基本一致。蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示大多數(shù)的蛋白質(zhì)均被定位在細(xì)胞質(zhì)中（13個(gè)），還有少部分的蛋白質(zhì)被定位在周質(zhì)和外膜上。

2.5 胡蘿卜YUCCA基因結(jié)構(gòu)

為了分析胡蘿卜YUCCA基因家族的功能，對(duì)14個(gè)基因進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析（圖4），結(jié)果得出基因的長(zhǎng)度不同，外顯子和內(nèi)含子也存在差別。基因DcYUCCA2、DcYUCCA6、DcYUCCA10a和DcYUCCA10b均含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，其中基因DcYUCCA10a無(wú)上下游;基因DcYUCCA3a、DcYUCCA3b、DcYUCCA5a、DcYUCCA5b、DcYUCCA5c、DcYUCCA5d、DcYUCCA8a、DcYUCCA8b和DcYUCCA8c含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，其中基因DcYUCCA5a、DcYUCCA5b、DcYUCCA5c、DcYUCCA5d和DcYUCCA8b無(wú)上下游;基因DcYUCCA9含有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子。

2.6 胡蘿卜YUCCA基因家族蛋白質(zhì)保守基序

對(duì)胡蘿卜YUCCA基因家族蛋白質(zhì)序列進(jìn)行保守基序分析（圖5），發(fā)現(xiàn)14個(gè)蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域?yàn)?～10個(gè)。蛋白質(zhì)DcYUCCA3a、DcYUCCA3b、DcYUCCA5a、DcYUCCA5b、DcYUCCA5c、DcYUCCA5d、DcYUCCA8c和DcYUCCA9含有10個(gè)motif，結(jié)構(gòu)和功能最為相似，14個(gè)YUCCA蛋白質(zhì)中均含有motif 1、motif 7和motif 3。蛋白質(zhì)DcYUCCA2不含motif 9、motif 6和motif 10;蛋白質(zhì)DcYUCCA6不含motif 5、motif 4、motif 6和motif 10;蛋白質(zhì)DcYUCCA10a和DcYUCCA10b結(jié)構(gòu)基本一致，均不含motif 8、motif 9和motif 10;蛋白質(zhì)DcYUCCA8a不含motif 9、motif 4和motif 10;蛋白質(zhì)DcYUCCA8b不含motif 2、motif 5和motif 6。

3 討論與結(jié)論

植物根部的生長(zhǎng)發(fā)育是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，是由根尖分生區(qū)細(xì)胞的分裂和伸長(zhǎng)區(qū)細(xì)胞的伸長(zhǎng)而生長(zhǎng)的，在這個(gè)過(guò)程中植物激素發(fā)揮了重要的作用[17]。生長(zhǎng)素是其中一類生長(zhǎng)調(diào)節(jié)激素，可以促進(jìn)細(xì)胞的伸長(zhǎng)、木質(zhì)部和韌皮部的分化，從而使根部增粗[18]。在胡蘿卜中，研究根部膨大增粗可以提高其品質(zhì)和產(chǎn)量，提高經(jīng)濟(jì)效益。YUCCA基因家族蛋白是植物中第一個(gè)被鑒別的FMO類超家族，調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育和植物的耐受性[19]。有研究證實(shí)YUCCA基因介導(dǎo)生長(zhǎng)素的生物合成，在擬南芥中抑制YUCCA表達(dá)會(huì)抑制生根，調(diào)控根器官發(fā)育[20]。

本研究利用生物信息學(xué)方法鑒定胡蘿卜YUCCA基因家族成員共14個(gè)，與擬南芥YUCCA基因家族的11個(gè)成員數(shù)量較接近。通過(guò)理化性質(zhì)分析得出，胡蘿卜YUCCA基因家族蛋白質(zhì)基本為堿性氨基酸（除了蛋白質(zhì)DcYUCCA8a），且14個(gè)蛋白質(zhì)均為親水性蛋白質(zhì)，基因分別定位在5條染色體上（1、3、5、8、9號(hào)），其中在1號(hào)染色體上較聚集，結(jié)構(gòu)和功能最為相似。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中聚集在一起的亞族具有相似的進(jìn)化源和基因功能，通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)將胡蘿卜YUCCA基因家族分為3個(gè)亞族（Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ亞族），與煙草和擬南芥的親緣關(guān)系較近，其中，Ⅲ亞族中的DcYUCCA2和DcYUCCA6與擬南芥的ArYUCCA2和ArYUCCA6親緣關(guān)系最近，推測(cè)可能通過(guò)調(diào)控生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和早期花粉發(fā)育[21]。

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定其生物學(xué)功能，結(jié)構(gòu)相似其功能相似，在分析蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)模型時(shí)發(fā)現(xiàn)，YUCCA基因家族蛋白質(zhì)主要以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，位于同一家族成員的結(jié)構(gòu)具有一致性。在亞細(xì)胞定位中發(fā)現(xiàn)大部分的蛋白質(zhì)被定位在細(xì)胞質(zhì)中，表明這些基因合成生長(zhǎng)素基本上是在細(xì)胞質(zhì)中完成的，這與王仁漢等的結(jié)果[6，22]一致。通過(guò)分析胡蘿卜YUCCA基因家族蛋白質(zhì)的保守基序發(fā)現(xiàn)，14個(gè)蛋白質(zhì)的motif有6～10個(gè)不等，說(shuō)明基因家族功能的多樣性，但其中有大部分YUCCA蛋白質(zhì)的motif數(shù)量均為10個(gè)，說(shuō)明基因家族的功能具有相似性?？傮w來(lái)看，位于同一基因家族的成員在植物中的結(jié)構(gòu)和功能均具有相似性，為進(jìn)一步研究基因家族提供參考，為胡蘿卜根部膨大形成機(jī)制的研究奠定了理論基礎(chǔ)。

本研究在胡蘿卜的5條染色體上共鑒定到了14個(gè)YUCCA基因家族成員，其大部分基因含有3～4個(gè)外顯子;該家族編碼的蛋白質(zhì)為富含堿性氨基酸的親水性蛋白質(zhì)，氨基酸數(shù)量為290～424個(gè)，其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可將其分為3個(gè)亞族，且亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，YUCCA基因家族蛋白質(zhì)大部分被定位在細(xì)胞質(zhì)中。這為YUCCA基因家族在調(diào)控胡蘿卜根發(fā)育和膨大機(jī)制研究奠定了理論基礎(chǔ)。

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