梁文化 陳濤 姚姝 趙凌 朱鎮(zhèn) 趙慶勇 周麗慧 趙春芳 路凱 赫磊 王才林 張亞東

摘要：挖掘水稻籽粒長寬比相關(guān)的QTL可為水稻粒型的遺傳機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。以特大粒水稻TD70和小粒秈稻Kasalath構(gòu)建的重組自交系群體為研究材料，2019、2020年連續(xù)2年考察各株系的籽粒長寬比，利用群體重測序構(gòu)建的高密度遺傳圖譜對(duì)控制水稻籽粒長寬比相關(guān)QTL進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，在重組自交系群體中籽粒長寬比呈連續(xù)變異，有明顯的超親分離現(xiàn)象。2019、2020年2年共檢測到11個(gè)QTLs，分別位于2、3、4、5、6、7、9號(hào)染色體上。QTL的LOD值介于3.74～31.41之間，單個(gè)QTL可解釋2.48%～24.67%的表型變異，2年重復(fù)檢測到的QTL位點(diǎn)共有4個(gè)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，qLWR2-2、qLWR3-1、qLWR3-2、qLWR4、qLWR5、qLWR6-2及qLWR7共7個(gè)位點(diǎn)所在區(qū)間與前人的報(bào)道相同或相似。qLWR2-1、qLWR6-1、qLWR9-1和qLWR9-2可能是新發(fā)現(xiàn)的QTL位點(diǎn)。本研究結(jié)果可用于下一步QTL的克隆及分子標(biāo)記輔助選擇育種。

關(guān)鍵詞：水稻;重組自交系;長寬比;QTL定位;高密度遺傳圖譜

中圖分類號(hào)：S511.03? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）23-0047-05

收稿日期：2021-10-06

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31901485）;江蘇省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：BE2021301）;現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（編號(hào)：CARS-01-67）。

作者簡介：梁文化（1984—），男，山東臨沂人，博士，助理研究員，主要從事水稻粒型基因研究。E-mail：liangwenhua0228@126.com。

通信作者：張亞東，博士，研究員，主要從事水稻遺傳育種研究。E-mail：zhangyd@jaas.ac.cn。

水稻產(chǎn)量由粒質(zhì)量、每穗粒數(shù)及穗數(shù)構(gòu)成，籽粒形態(tài)決定粒質(zhì)量，同時(shí)還影響稻米的外觀品質(zhì)和商品價(jià)值。粒型包括粒長、粒寬、粒厚和長寬比[1-3]，是典型的多基因控制數(shù)量性狀，目前通過遺傳作圖、關(guān)聯(lián)分析、群體測序分析等方法鑒定水稻粒型相關(guān)的QTL已經(jīng)超過500個(gè)，這些QTL分布在水稻的12條染色體上，目前已經(jīng)被克隆和功能驗(yàn)證的超過30個(gè)[4-5]。其中，GS3[6]、qGL3[7]、GL7/GW7[8-9]、GL4[10]、GL3.3/TGW3[11-12]、GLW7[13]、GLA[14]、GS9[15]等是調(diào)控粒長的QTLs，GW2[16]、GSE5/GW5/qSW5[17-19]、GS5[20]、GW8[21]等對(duì)粒寬有調(diào)控作用，TGW6[22]和GW6a[23]是千粒質(zhì)量的主效QTLs，SRS5[24]、GS2/GL2[25-26]是通過與其他基因互作調(diào)控籽粒發(fā)育的。

長寬比是水稻籽粒重要的性狀之一，對(duì)稻米品質(zhì)有重要的影響。目前，雖然已經(jīng)對(duì)水稻粒長、粒寬和千粒質(zhì)量相關(guān)QTLs展開了廣泛研究，但是水稻籽粒長寬比QTL仍然沒有被精細(xì)定位和克隆。遺傳群體的構(gòu)建對(duì)于QTL的研究至關(guān)重要，與其他分離群體不同，重組自交系群體中每個(gè)株系的基因型都是純合的，方便多年多點(diǎn)試驗(yàn)，可挖掘出更多的遺傳信息，適合進(jìn)行數(shù)量性狀的研究。筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期以特大粒粳稻TD70和小粒秈稻Kasalath為親本構(gòu)建了重組自交系群體群體，對(duì)雙親和群體株系重測序構(gòu)建了高密度遺傳圖譜[27]。在此基礎(chǔ)上，本研究在不同年份分別考察雙親及群體的籽粒長寬比并進(jìn)行QTL關(guān)聯(lián)分析。2019—2020年2年的結(jié)果顯示，共定位到11個(gè)籽粒長寬比相關(guān)的QTLs，為下一步籽粒長寬比基因的克隆、研究長寬比的遺傳機(jī)制以及在水稻育種中研究和利用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

特大粒粳稻TD70是天鵝谷///9520//（72-496/蘇御糯）雜交后代選出的穩(wěn)定品系，以TD70與印度小粒秈稻品種Kasalath為親本，雜交產(chǎn)生F1代，F(xiàn)1代自交獲得F2代，進(jìn)一步通過單籽傳法構(gòu)建TD70/Kasalath的重組自交系群體，連續(xù)自交至F14代，最終獲得包含186個(gè)株系的重組自交系群體[28]。2019、2020年在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)田種植重組自交系群體及2個(gè)親本，每個(gè)株系種植4行，每行8 株，行距為26.7 cm，株距為16.7 cm，田間管理與大田相同。

1.2 性狀調(diào)查

成熟時(shí)每個(gè)小區(qū)隨機(jī)選取5株混合收種，自然晾干保存。從親本及每個(gè)重組自交系株系中隨機(jī)挑選10粒飽滿種子，用游標(biāo)卡尺（精度0.01 mm）測量粒長、粒寬，根據(jù)粒長和粒寬計(jì)算稻谷的長寬比，重復(fù)3次，以平均值作為性狀的表型值。

1.3 QTLs定位

前期利用重測序技術(shù)對(duì)重組自交系群體186個(gè)株系及2個(gè)親本分別進(jìn)行全基因組重測序，參考Huang等的方法構(gòu)建高密度的Bin-map[29]。該圖譜包含12 328個(gè)Bin 標(biāo)記，平均每條染色體上有1 027 個(gè)，相鄰Bin標(biāo)記間的物理距離平均為 30.26 kb[27]。采用軟件IciMapping Ver 4.2.53中的ICIM-ADD算法對(duì)2019、2020年重組自交系群體長寬比表型分別進(jìn)行QTL定位。作圖設(shè)定PIN為0.001，步長為1 cM，LOD閾值設(shè)定為3.0[30]。以LOD峰值作為該QTL 的LOD值，并計(jì)算每個(gè)QTL對(duì)水稻籽粒長寬比的貢獻(xiàn)率和加性效應(yīng)，遵循McCouch的方法等原則對(duì)QTL進(jìn)行命名[31]。采用Mapchart V2.32軟件繪制QTL在染色體上的位置分布[32]。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本及重組自交系群體籽粒的長寬比

2019、2020年對(duì)親本TD70、Kasalath及186個(gè)重組自交系株系長寬比進(jìn)行考察。結(jié)果表明，TD70長寬比分別為2.63±0.13、2.68±1.11，Kasalath長寬比分別為3.07±0.23、3.00±0.15。對(duì)親本籽粒大小（圖1）的2年數(shù)據(jù)進(jìn)行t測驗(yàn)，結(jié)果顯示，親本間長寬比均存在極顯著差異（表1）。重組自交系群體2年長寬比分別為2.30～4.58、2.22～4.43，呈現(xiàn)出廣泛的變異，平均值分別為3.15±0.53、3.12±0.50（表1）。對(duì)長寬比的頻率分布及峰值進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，2年的籽粒長寬比均呈現(xiàn)連續(xù)變異的近正態(tài)分布（圖2），表現(xiàn)出受多基因控制的數(shù)量性狀的遺傳特征，2年間的變化趨勢相似，且存在超親分離現(xiàn)象，符合QTL區(qū)間作圖分析的要求。

2.2 籽粒長寬比QTL定位

利用前期研究構(gòu)建的高密度遺傳圖譜，連續(xù)2年對(duì)親本及186個(gè)重組自交系株系的籽粒長寬比數(shù)據(jù)進(jìn)行考察，采用QTL IciMapping V 4.2.53軟件的ICIM-ADD算法進(jìn)行QTL作圖及分析。結(jié)果（圖3）表明，2年共檢測到11個(gè)與籽粒長寬比相關(guān)的QTLs，分別位于2、3、4、5、6、7、9號(hào)染色體的不同位置。籽粒長寬比QTL在染色體上的分布并不均勻，其中，2、3、6、9號(hào)染色體分別檢測到2個(gè)QTLs;4、5、7號(hào)染色體分別檢測到1個(gè)QTL。qLWR3-1、qLWR3-2、qLWR5和qLWR6-1等4個(gè)QTL在2019、2020年2年均被檢測到，說明這4個(gè)QTL受環(huán)境影響小，遺傳較穩(wěn)定。

2.3 籽粒長寬比QTL分析

對(duì)檢測到的11個(gè)QTLs進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)QTL的LOD值最小為3.74，最大為31.41，貢獻(xiàn)率在248%～24.67% 之間。 2年分析結(jié)果（表2） 顯示，這些QTL分別解釋74.55%和74.69%的表型變異。其中，qLWR2-2位于2號(hào)染色體，LOD值為14.52，貢獻(xiàn)率為9.00%，定位在標(biāo)記Bin1570～Bin1571之間;qLWR4位于4號(hào)染色體，LOD值為410可解釋2.68%的表型變異。2019、2020年2年均檢測到的QTL有4個(gè)：qLWR3-1的2年貢獻(xiàn)率分別為12.26%和1499%，加性效應(yīng)均為0.18;qLWR3-2的2年貢獻(xiàn)率分別為13.07%和1126%，加性效應(yīng)分別為 -0.19 和-0.16;qLWR5位于5號(hào)染色體上，貢獻(xiàn)率最大，2年貢獻(xiàn)率分別為24.67%和22.70%，加性效應(yīng)分別為0.25和0.23;qLWR6-1的2年貢獻(xiàn)率分別為4.90%和6.95%，加性效應(yīng)分別為-0.11和-0.12。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，QTLs定位物理區(qū)間在11 332～68 084 bp之間，其中qLWR3-1、qLWR3-2分別定位在11 332、32 249 bp 的染色體區(qū)段內(nèi);qLWR5定位在 30 824 bp 物理區(qū)間內(nèi);qLWR6-1被定位在 27 693 bp 的物理區(qū)間內(nèi);qLWR7定位于7號(hào)染色體上 29 299 bp 物理區(qū)間（表2）。

3 討論與結(jié)論

水稻粒型與粒質(zhì)量密切相關(guān)，且對(duì)產(chǎn)量和品質(zhì)均有影響[1]。在水稻長寬比相關(guān)的QTL研究方面，方先文等以秈稻扎西瑪與優(yōu)質(zhì)粳稻南粳46構(gòu)建了重組自交系群體，利用202對(duì)SSR標(biāo)記進(jìn)行籽粒性狀的QTL分析，檢測到6個(gè)長寬比相關(guān)的QTL[33]。

梁云濤等構(gòu)建了F2群體，利用184對(duì)SSR標(biāo)記共檢測到3個(gè)粒型QTL，表型貢獻(xiàn)率為10.56%～1477%，QTL物理區(qū)間為254 720～407 666 bp[34]。李金吉等利用大粒品種和東北小粒中的F2群體的156對(duì)多態(tài)SSR標(biāo)記定位到5個(gè)長寬比相關(guān)的QTL，分別位于水稻2、3、5號(hào)染色體上，貢獻(xiàn)率為4%～18%，其中，qL/W-2-1和qL/W-2-2均位于1 274 508 bp物理區(qū)間內(nèi)，qL/W-3-1定位區(qū)間為2 706 165 bp[35]。前人通過構(gòu)建不同的遺傳群體對(duì)粒型QTL進(jìn)行檢測，但是傳統(tǒng)的分子標(biāo)記構(gòu)建的遺傳圖譜不夠精細(xì)，因而定位到的QTL位點(diǎn)區(qū)間較大，后續(xù)難以進(jìn)行精細(xì)定位和候選基因的克隆工作。

利用2代測序技術(shù)構(gòu)建高密度遺傳圖譜對(duì)QTL的定位更加精細(xì)，徐建軍等利用重測序技術(shù)構(gòu)建了包含401個(gè)Bin的遺傳圖譜，定位到8個(gè)粒型QTL，定位區(qū)間為200 070～5 792 954 bp[36];衛(wèi)純潔等利用該群體定位到4個(gè)水稻籽粒長寬比相關(guān)的QTL，定位區(qū)間在17 825～945 168 bp之間[37]。張健等以特異矮桿突變體CHA-1為母本、以秈稻H335為父本構(gòu)建了275個(gè)重組自交系群體，利用簡化基因組測序構(gòu)建的高密度遺傳圖譜包含2 498個(gè)Bin標(biāo)記，利用該圖譜共檢測到26個(gè)籽粒大小相關(guān)的QTL，最小定位區(qū)間為90 416 bp[38]。由此可見，2代高通量測序構(gòu)建的圖譜確實(shí)優(yōu)于傳統(tǒng)的分子標(biāo)記圖譜，這可能是重測序獲得的基因組變異信息更全面，因而圖譜標(biāo)記密度更大，也較均勻。筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期研究對(duì)重組自交系群體186個(gè)株系進(jìn)行全基因組重測序，由于是秈粳交后代基因組差異大，因而SNP位點(diǎn)較多，過濾掉低質(zhì)量的位點(diǎn)后最終構(gòu)建的圖譜包含12 328個(gè)Bin 標(biāo)記，相鄰標(biāo)記間平均物理距離僅為30.26 kb[27]。本研究利用該圖譜對(duì)長寬比進(jìn)行QTL分析，結(jié)果表明，11個(gè)長寬比相關(guān)的QTL定位區(qū)間最小為11 332 bp，最大為 68 084 bp，平均為30 083 bp的定位區(qū)間較精細(xì)，有助于后續(xù)對(duì)基因的克隆和功能分析。

本研究中qLWR2-2和qLWR7所在區(qū)間與張亞東等對(duì)粒型QTL定位的區(qū)間[28，35]相近，深入分析發(fā)現(xiàn)，這2個(gè)區(qū)間內(nèi)分別存在已知粒型基因GW2和GL7/GW7[8，9，16]。qLWR3-1、qLWR3-2、qLWR5是2年均檢測到的主效QTL位點(diǎn)，定位區(qū)間與前人相關(guān)的研究結(jié)果一致，且區(qū)間內(nèi)分別存在已知的粒型基因GS3、qGL3和GW5[28，38]。qLWR4、qLWR6-2分別位于4、6號(hào)染色體上，該區(qū)間附近存在已克隆的粒型相關(guān)基因D11和TGW6[22，39]。qLWR2-1、qLWR6-1、qLWR9-1和qLWR9-2等4個(gè)QTL位點(diǎn)所在區(qū)間未見相關(guān)報(bào)道，可能是本研究新發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)，其中，qLWR6-1在2019、2020年2年均檢測到，說明該位點(diǎn)遺傳較穩(wěn)定，后續(xù)試驗(yàn)將對(duì)4個(gè)新的位點(diǎn)進(jìn)一步驗(yàn)證并深入研究。本研究通過高密度Bin圖譜定位到控制籽粒長寬比相關(guān)QTL位點(diǎn)，既包含前人已經(jīng)定位或克隆的粒型基因，也發(fā)現(xiàn)4個(gè)新的QTL位點(diǎn)，有利于下一步相關(guān)基因的深入研究和分子標(biāo)記輔助育種應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：

[1]徐正進(jìn)，陳溫福，馬殿榮，等. 稻谷粒形與稻米主要品質(zhì)性狀的關(guān)系[J]. 作物學(xué)報(bào)，2004，30（9）：894-900.

[2]高志強(qiáng)，占小登，梁永書，等. 水稻粒形性狀的遺傳及相關(guān)基因定位與克隆研究進(jìn)展[J]. 遺傳，2011，33（4）：314-321.

[3]Harberd N P.Shaping taste：the molecular discovery of rice genes improving grain size，shape and quality[J]. Journal of Genetics and Genomics，2015，42（11）：597-599.

[4]Li N，Xu R，Li Y H.Molecular networks of seed size control in plants[J]. Annual Review of Plant Biology，2019，70：435-463.

[5]Chan A N，Wang L L，Zhu Y J，et al. Identification through fine mapping and verification using CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis for a minor QTL controlling grain weight in rice[J]. Theoretical and Applied Genetics，2021，134（1）：327-337.

[6]Fan C C，Yu S B，Wang C R，et al. A causal C-A mutation in the second exon of GS3 highly associated with rice grain length and validated as a functional marker[J]. Theoretical and Applied Genetics，2009，118（3）：465-472.

[7]Zhang X J，Wang J F，Huang J，et al. Rare allele of OsPPKL1 associated with grain length causes extra-large grain and a significant yield increase in rice[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2012，109（52）：21534-21539.

[8]Wang Y X，Xiong G S，Hu J A，et al. Copy number variation at the GL7 locus contributes to grain size diversity in rice[J]. Nature Genetics，2015，47（8）：944-948.

[9]Wang S K，Li S，Liu Q A，et al. The OsSPL16-GW7 regulatory module determines grain shape and simultaneously improves rice yield and grain quality[J]. Nature Genetics，2015，47（8）：949-954.

[10]Wu W G，Liu X Y，Wang M H，et al. A single-nucleotide polymorphism causes smaller grain size and loss of seed shattering during African rice domestication[J]. Nature Plants，2017，3：17064.

[11]Xia D，Zhou H，Liu R J，et al. GL3.3，a novel QTL encoding a GSK3/SHAGGY-like kinase，epistatically interacts with GS3 to produce extra-long grains in rice[J]. Molecular Plant，2018，11（5）：754-756.

[12]Ying J Z，Ma M，Bai C，et al. TGW3，a major QTL that negatively modulates grain length and weight in rice[J]. Molecular Plant，2018，11（5）：750-753.

[13]Si L Z，Chen J Y，Huang X H，et al. OsSPL13 controls grain size in cultivated rice[J]. Nature Genetics，2016，48（4）：447-456.

[14]Zhang Y P，Zhang Z Y，Sun X M，et al. Natural alleles of GLA for grain length and awn development were differently domesticated in rice subspecies Japonica and indica[J]. Plant Biotechnology Journal，2019，17（8）：1547-1559.

[15]Zhao D S，Li Q F，Zhang C Q，et al. GS9 acts as a transcriptional activator to regulate rice grain shape and appearance quality[J]. Nature Communications，2018，9：1240.

[16]Song X J，Huang W，Shi M，et al. A QTL for rice grain width and weight encodes a previously unknown RING-type E3 ubiquitin ligase[J]. Nature Genetics，2007，39（5）：623-630.

[17]Duan P G，Xu J S，Zeng D L，et al. Natural variation in the promoter of GSE5 contributes to grain size diversity in rice[J]. Molecular Plant，2017，10（5）：685-694.

[18]Liu J F，Chen J，Zheng X M，et al. GW5 acts in the brassinosteroid signalling pathway to regulate grain width and weight in rice[J]. Nature Plants，2017，3：17043.

[19]Shomura A，Izawa T，Ebana K，et al. Deletion in a gene associated with grain size increased yields during rice domestication[J]. Nature Genetics，2008，40（8）：1023-1028.

[20]Li Y B，F(xiàn)an C C，Xing Y Z，et al. Natural variation in GS5 plays an important role in regulating grain size and yield in rice[J]. Nature Genetics，2011，43（12）：1266-1269.

[21]Wang S K，Wu K，Yuan Q B，et al. Control of grain size，shape and quality by OsSPL16 in rice[J]. Nature Genetics，2012，44（8）：950-954.

[22]Ishimaru K，Hirotsu N，Madoka Y，et al. Loss of function of the IAA-glucose hydrolase gene TGW6 enhances rice grain weight and increases yield[J]. Nature Genetics，2013，45（6）：707-711.

[23]Song X J，Kuroha T，Ayano M，et al. Rare allele of a previously unidentified histone H4 acetyltransferase enhances grain weight，yield，and plant biomass in rice[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2015，112（1）：76-81.

[24]Segami S，Kono I，Ando T，et al. Small and round seed 5 gene encodes alpha-tubulin regulating seed cell elongation in rice[J]. Rice，2012，5（1）：4.

[25]Hu J A，Wang Y X，F(xiàn)ang Y X，et al. A rare allele of GS2 enhances grain size and grain yield in rice[J]. Molecular Plant，2015，8（10）：1455-1465.

[26]Che R H，Tong H N，Shi B H，et al. Control of grain size and rice yield by GL2-mediated brassinosteroid responses[J]. Nature Plants，2016，2：15195.

[27]張亞東，梁文化，赫 磊，等.? 水稻RIL群體高密度遺傳圖譜構(gòu)建及粒型QTL定位[J/OL]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué).[2021-09-21]. https：//www.chinaagrisci.com/CN/abstract/abstract21723.shtml.

[28]張亞東，張穎慧，董少玲，等. 特大粒水稻材料粒型性狀的QTL檢測[J]. 中國水稻科學(xué)，2013，27（2）：122-128.

[29]Huang X H，F(xiàn)eng Q，Qian Q A，et al. High-throughput genotyping by whole-genome resequencing[J]. Genome Research，2009，19（6）：1068-1076.

[30]Meng L，Li H H，Zhang L Y，et al. QTL IciMapping：Integrated software for genetic linkage map construction and quantitative trait locus mapping in biparental populations[J]. The Crop Journal，2015，3（3）：269-283.

[31]McCouch S R.Gene nomenclature system for rice[J]. Rice，2008，1（1）：72-84.

[32]Voorrips R E.MapChart：Software for the graphical presentation of linkage maps and QTLs[J]. Journal of Heredity，2002，93（1）：77-78.

[33]方先文，張?jiān)戚x，肖西林，等. 基于重組自交系群體的水稻粒形QTL定位[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，33（2）：241-247.

[34]梁云濤，潘英華，徐志健.利用野栽分離群體定位水稻粒型相關(guān)QTL[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，30（10）：2161-2167.

[35]李金吉，張銀霞，趙 娜，等. 水稻粒形與千粒質(zhì)量的QTL分析[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2021，49（2）：54-60.

[36]徐建軍，趙 強(qiáng)，湯在祥，等. 利用重測序的染色體片段代換系群體定位水稻粒型QTL[J]. 中國水稻科學(xué)，2011，25（4）：365-369.

[37]衛(wèi)純潔，陶亞軍，范方軍，等. 利用重測序染色體片段代換系群體定位水稻籽粒長寬比QTL[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（6）：36-40.

[38]張 健，楊 靖，王 豪，等. 基于高密度遺傳圖譜定位水稻籽粒大小相關(guān)性狀QTL[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，53（2）：225-238.

[39]Tanabe S，Ashikari M，F(xiàn)ujioka S，et al. A novel cytochrome P450 is implicated in brassinosteroid biosynthesis via the characterization of a rice dwarf mutant，dwarf11，with reduced seed length[J]. The Plant Cell，2005，17（3）：776-790.