高偉 鄔信芳 李欽

[1.山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院) 泰安 271000；2.濱州醫(yī)學(xué)院 濱州 256600；3.山東臨沂市人民醫(yī)院耳鼻喉科 臨沂 276002]

喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤。2018年國家癌癥中心統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示我國2014年喉癌發(fā)病2.34萬例，死亡1.32萬例[1]。雖然近年來喉癌治療方式不斷進(jìn)步和改善，但喉癌患者的5年生存率并未得到明顯提升，甚至有學(xué)者[2]認(rèn)為其5年生存率呈下降趨勢。因此，探究喉癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，尋找新的、更為有效的診斷和治療策略，對于喉癌患者的治療和預(yù)后有重大意義。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1,HⅠF-1α)由Semenza等[3]首次發(fā)現(xiàn)，是組織細(xì)胞低氧應(yīng)激的重要標(biāo)志物，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[3-4]。近年來HⅠF-1α在喉癌中的重要性，引起學(xué)者們的普遍關(guān)注。本文復(fù)習(xí)國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，就HⅠF-1α與喉癌發(fā)生、發(fā)展、治療和預(yù)后的關(guān)系做一綜述。

1 HIF-1α概述

1.1 HⅠF-1α分子結(jié)構(gòu) HⅠF-1α亞基是異二聚體蛋白HⅠF-1的活性亞基，其調(diào)節(jié)依賴于細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中氧濃度的大小[5]。α亞基的氨基端由bHLH和PAS結(jié)構(gòu)域組成，其功能與形成二聚體和結(jié)合其下游靶基因相關(guān)。其羧基端含有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的反式激活結(jié)構(gòu)域-C(transactivation domain-C terminal，TAD-C)、激活轉(zhuǎn)錄的反式激活結(jié)構(gòu)域-N(transactivation domain-N terminal，TAD-N)、富含Pro/Ser/Thr 的氧依賴降解結(jié)構(gòu)域(oxygen-dependent degradation domain，ODDD)和具有負(fù)調(diào)控反式激活結(jié)構(gòu)域作用的抑制結(jié)構(gòu)域[6]。與α亞基結(jié)構(gòu)相似的HⅠF-1組成型亞基β亞基，又稱芳香烴受體核轉(zhuǎn)運體(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator, ARNT)，可與多種bHLH-PAS蛋白發(fā)生異二聚反應(yīng)，在細(xì)胞內(nèi)可穩(wěn)定性表達(dá)[7]。因此，HⅠF-1α的含量決定HⅠF-1的表達(dá)水平和生物活性。

1.2 HⅠF-1α的調(diào)控 HⅠF-1α的表達(dá)調(diào)控可分為氧依賴調(diào)節(jié)途徑和非氧依賴調(diào)節(jié)途徑。氧依賴調(diào)節(jié)途徑有2種氧依賴酶參與：低氧誘導(dǎo)因子-1抑制因子(factor-inhibiting HⅠF-1，F(xiàn)ⅠH-1)和脯氨酰羥化酶(prolyl hydroxylases，PHD)。FⅠH-1是一種天冬酰胺β羥化酶，屬于2-氧戊二酸和鐵依賴性雙加氧酶(2-oxoglutarate and iron-dependent dioxygenases)超家族中的一員，可催化天冬酰胺羥化反應(yīng)。FⅠH-1在HⅠF-1α中特定天冬氨酸殘基(Asn803)的羥化作用阻止HⅠF-1α轉(zhuǎn)錄因子與CBP/p300轉(zhuǎn)錄輔激活因子的結(jié)合，從而抑制HⅠF-1介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄[8]。不同的是，同屬于2-氧戊二酸和鐵依賴性雙加氧酶超家族的PHD則通過羥基化修飾HⅠF-1α中特定脯氨酸殘基，羥基化的HⅠF-1α被von Hippel-Lindau蛋白識別后被E3泛素連接酶復(fù)合物捕獲后泛素化，繼而在蛋白酶體上被降解[9]。PHD和FⅠH-1的羥基化作用均需要分子氧的參與，因此當(dāng)細(xì)胞內(nèi)分子氧濃度降低時，F(xiàn)ⅠH-1和PHD 對HⅠF-1α的降解能力及抑制轉(zhuǎn)錄活性能力受到影響，累積的HⅠF-1α在細(xì)胞核內(nèi)與β亞基形成有活性的HⅠF-1異二聚體蛋白。

在非氧依賴調(diào)節(jié)途徑中，細(xì)胞因子、生長因子和病毒蛋白等刺激因子可在常氧條件下促使組織細(xì)胞內(nèi)HⅠF-1α mRNA和蛋白的表達(dá)量增加。與低氧條件下HⅠF-1α降解受阻不同，在常氧條件下細(xì)胞內(nèi)HⅠF-1α的降解并不受影響，HⅠF-1α表達(dá)的增加打破了合成和降解之間的平衡促進(jìn)HⅠF-1α的累積[10]。一項研究[11]顯示高遷移率族蛋白1(high-mobility group box 1, HMGB1)可通過PⅠ3K-Akt途徑使乳腺癌中HⅠF-1α及血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移。在另一項研究[12]中發(fā)現(xiàn)潛伏膜蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)不僅可通過增加鼻咽癌中HⅠF-1α mRNA的轉(zhuǎn)錄從而提高的HⅠF-1α蛋白表達(dá)水平，還可增強(qiáng)HⅠF-1α蛋白的穩(wěn)定性。HⅠF-1α在常氧條件下的調(diào)控機(jī)制與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展存在密切關(guān)聯(lián)。

2 HIF-1α與喉癌的進(jìn)展

HⅠF-1α通過調(diào)控近百種靶基因，如VEGF、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-1(glucoes transporter-1，GLUT-1)、碳酸酐酶ⅠX(carbonic anhydrase-ⅠX，CA-ⅠX)等，涉及細(xì)胞生長發(fā)育及代謝的眾多方面，如缺氧代償性反應(yīng)、免疫反應(yīng)、新生血管的生成調(diào)節(jié)、細(xì)胞外基質(zhì)纖維化、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、物質(zhì)運輸、能量代謝等[13]。近年來多項研究顯示HⅠF-1α及其靶基因與喉癌的進(jìn)展關(guān)系密切。

2.1 HⅠF-1α與喉癌能量代謝 在快速生長的腫瘤組織中，其糖代謝與正常細(xì)胞不同，HⅠF-1α可通過一系列調(diào)控幫助腫瘤細(xì)胞將葡萄糖代謝從氧化磷酸化轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒?，產(chǎn)生大量ATP，以維持其快速增殖所需的能量消耗(Warburg效應(yīng))[14]。一項將100例喉癌術(shù)后輔助放射治療(簡稱放療)患者作為研究對象的回顧性分析[15]中發(fā)現(xiàn)HⅠF-1α和GLUT-1在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中陽性表達(dá)率較正常組織明顯增高。HⅠF-1α的高表達(dá)與高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、較低的分化程度以及高臨床分期密切相關(guān)，GLUT-1則只與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。徐鷗等[16]的研究得到相同的結(jié)果。另外，他們的體外實驗顯示人喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞中HⅠF-1α、GLUT-1和VEGF的表達(dá)在低氧條件下明顯升高，使Hep-2細(xì)胞在低氧條件下也能正常生長。李珂等[17]的一項體外實驗研究顯示隨著缺氧時間的延長，喉癌Hep-2細(xì)胞內(nèi)HⅠF-1α mRNA表達(dá)水平無明顯變化，HⅠF-1α蛋白、GLUT-1 mRNA及GLUT-1蛋白的表達(dá)水平逐漸升高，侵襲能力及存活能力也逐漸增強(qiáng)。Lu等[18]利用癌癥基因組編輯和功能分析的工具CRⅠSPR/CAS9系統(tǒng)將Hep2喉癌細(xì)胞中HⅠF-1α基因和GLUT-1基因誘導(dǎo)敲除，發(fā)現(xiàn)基因敲除后的Hep2喉癌細(xì)胞內(nèi)HⅠF-1α和GLUT-1蛋白表達(dá)水平明顯降低，磷脂酰肌醇3-激酶(PⅠ3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路受到抑制，其增殖率、遷移侵襲能力、葡萄攝取能力以及乳酸生成量也均低于基因敲除前。PⅠ3K/AKT信號通路不僅與細(xì)胞的增殖和凋亡相關(guān)，且與細(xì)胞的糖酵解過程有著密切聯(lián)系[19]。這些研究表明，HⅠF-1α可能通過PⅠ3K/AKT信號通路調(diào)控靶基因GLUT-1的表達(dá)促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運和增強(qiáng)Warburg效應(yīng)影響喉癌細(xì)胞的能量代謝，增強(qiáng)其增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力。

2.2 HⅠF-1α與喉癌血管新生 新生血管增多是腫瘤的標(biāo)志，也是腫瘤生長的基礎(chǔ)。有學(xué)者[20]提出直徑不超過2～3 mm早期實體腫瘤的生長不需要新生血管。在這個階段，腫瘤很少發(fā)生轉(zhuǎn)移，腫瘤組織主要通過擴(kuò)散從相鄰的組織血管中吸收營養(yǎng)和氧氣。隨著腫瘤組織的不斷生長，腫瘤開始分泌VEGF促進(jìn)新生血管形成，為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。VEGF是目前已知的最有效、最直接的血管生成蛋白，可增加血管通透性，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移。有研究[21]表明喉癌組織中HⅠF-1α和VEGF高表達(dá)的患者預(yù)后較差。李曉明等[22]研究發(fā)現(xiàn)在聲門上型喉癌中HⅠF-1α與VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)，頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者HⅠF-1α、VEGF、微血管密度(miorovessel densiry，MVD)和淋巴管密度(lymphatic vessel density，LVD)明顯高于無頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。邱亞雙等[23]的研究得到了相似的結(jié)果。他們發(fā)現(xiàn)在喉癌組織中HⅠF-1α和VEGF的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，HⅠF-1α的高表達(dá)與高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、較低的分化程度以及高臨床分期密切相關(guān)，VEGF的高表達(dá)則與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和高臨床分期相關(guān)。上述研究表明在喉癌組織中，HⅠF-1α與VEGF的高表達(dá)促進(jìn)新生血管及淋巴管形成，推動喉癌的進(jìn)展。

3 HIF-1α與喉癌的治療

目前，以放射化學(xué)治療(簡稱放化療)為主的非手術(shù)保喉治療模式得到學(xué)者們越來越多的關(guān)注。然而，此種治療模式雖然能在解剖上保留喉部器官，但卻對喉癌的總體生存率及喉功能的保留卻沒有明顯的提升[24]。近年來，研究顯示HⅠF-1α的高表達(dá)與喉癌的放化療抵抗密切相關(guān)。抑制HⅠF-1α及其靶基因的表達(dá)，增強(qiáng)喉癌對放化療的敏感度，或?qū)⒊蔀樘岣吆戆┗颊呱媛屎捅Ａ艉砉δ艿男逻x擇。

3.1 HⅠF-1α與喉癌的放療 腫瘤放療抵抗是多因素參與的復(fù)雜過程，是放療臨床效果不佳的原因之一。有研究[25]顯示HⅠF-1α在放療后24 h即可呈高表達(dá)狀態(tài)，并在腫瘤放療抵抗中起關(guān)鍵性作用。Kwon等[26]對42例單純放療的早期喉鱗狀細(xì)胞癌(T1和T2)組織標(biāo)本中HⅠF-1α、CA-ⅠX、環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)、Ki67和促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin， EPO)受體的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)只有HⅠF-1α或CA-ⅠX的高表達(dá)與放療后喉癌組織殘留密切相關(guān)，并且HⅠF-1α和CA-ⅠX可作為早期喉癌單純放療后腫瘤殘留的預(yù)測指標(biāo)。Shen等[27]研究發(fā)現(xiàn)同時抑制HⅠF-1α和GLUT-1的表達(dá)可降低裸鼠喉癌細(xì)胞模型的微血管密度，促進(jìn)其凋亡和壞死，提高裸鼠移植喉癌細(xì)胞對放療的敏感度。路秀英等[28]的研究發(fā)現(xiàn)對HⅠF-1α和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducers and activator of transcription，STAT3)信號途徑聯(lián)合抑制較單獨抑制其中一種信號途徑更能提高喉鱗狀細(xì)胞癌裸鼠移植瘤對放療的敏感度。推測HⅠF-1α和STAT3信號途徑相互作用影響喉癌對放療的敏感度。HⅠF-1α作為低氧應(yīng)激反應(yīng)的重要因子，可通過調(diào)控其靶基因的表達(dá)及與其他信號通路相互作用，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展，增強(qiáng)喉癌放射抵抗性，降低放療治療敏感度。

3.2 HⅠF-1α與喉癌的化療 多藥耐藥是限制化療療效的主要問題，缺氧誘導(dǎo)HⅠF-1α的高表達(dá)在這一過程中起著重要作用。Li等[29]研究發(fā)現(xiàn)低氧可抑制化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，降低喉癌細(xì)胞對化療藥物的敏感度，而下調(diào)HⅠF-1α的表達(dá)可抑制體外缺氧條件誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞耐藥性的獲得。國內(nèi)徐鷗等[30]的實驗得到了相似的結(jié)果。經(jīng)典的多藥耐藥表型是由多藥耐藥(multidrug resistance 1，MDR1基因)/P-糖蛋白(MDR1/P-glycoprotein)的表達(dá)決定的。Jin等[31]研究發(fā)現(xiàn)在喉鱗狀細(xì)胞癌中HⅠF-1α和MDR1/P-gp的表達(dá)明顯增加，抑制HⅠF-1α的表達(dá)可下調(diào)MDR1基因的表達(dá)。提示在喉鱗狀細(xì)胞癌中HⅠF-1α可能是缺氧誘導(dǎo)MDR1基因表達(dá)上調(diào)的關(guān)鍵。在另一項實驗[32]表明抑制MDR1/P-gp基因的表達(dá)可通過提高低氧條件下喉癌細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，增強(qiáng)喉癌細(xì)胞對順鉑、吉西他濱、紫杉醇和多柔比星(阿霉素)等多種化療藥物的敏感度，使其凋亡率增加。這些研究結(jié)果表明HⅠF-1α在低氧條件下調(diào)控喉癌細(xì)胞能量依賴性跨膜蛋白MDR1/P-gp的表達(dá)，降低喉癌細(xì)胞內(nèi)藥物積聚，是介導(dǎo)低氧誘導(dǎo)的喉癌細(xì)胞多藥耐藥性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。抑制HⅠF-1α的表達(dá)可提高低氧條件下喉癌細(xì)胞對化療藥物的敏感度。

3.3 HⅠF-1α靶向治療與喉癌 大量研究證實HⅠF-1α的高表達(dá)可通過影響下游靶基因的表達(dá)促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展，影響腫瘤對放化療的敏感度。自20世紀(jì)90年代開始，學(xué)者們就注意到HⅠF-1α靶向治療腫瘤的潛在價值。目前，針對HⅠF-1α靶向治療的研究大致可分為影響HⅠF-1α mRNA和蛋白的表達(dá)及穩(wěn)定性、抑制HⅠF-1二聚體形成及影響HⅠF-1α與其靶基因結(jié)合等方向[33]。無論是直接或間接影響HⅠF-1α的表達(dá)水平，均可較高改善腫瘤對放化療的敏感度。路秀英等[34]報道，應(yīng)用HⅠF-1α反義寡核苷酸靶向抑制HⅠF-1α基因可抑制HⅠF-1α mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)，提高喉癌細(xì)胞對放化療的敏感度。在過去的幾十年里，包括小分子、甾體、肽和天然產(chǎn)物衍生物等大量HⅠF-1α抑制劑被發(fā)現(xiàn)，一些已被批準(zhǔn)的藥物已經(jīng)直接或間接地證明了HⅠF-1α抑制劑的作用，但目前尚無可靠的HⅠF-1α靶向藥物應(yīng)用于臨床[35]。由于HⅠF-1α復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，研究HⅠF-1α特異性抑制劑仍然是目前較大的挑戰(zhàn)。相信隨著研究的進(jìn)一步深入，HⅠF-1α靶向藥物聯(lián)合放化療的非手術(shù)治療模式在保留喉癌患者喉功能的前提下提高總體生存率將成為可能。

4 HⅠF-1α在喉癌中的預(yù)后價值

HⅠF-1α在喉癌中的預(yù)后價值尚存在爭議。一項關(guān)于頭頸部腫瘤(head and neck cancer，HNC)組織中HⅠFs表達(dá)薈萃分析[36]中顯示HⅠF-1α可能是一個存在種族差異的預(yù)后因素，在亞洲患者中HⅠF-1α過度表達(dá)與預(yù)后不良顯著相關(guān)，而歐洲患者HⅠF-1α過度表達(dá)與預(yù)后無關(guān)。而且在不同的HNC亞型中具有不同的預(yù)后價值,HⅠF-1α過表達(dá)與口腔癌、鼻咽癌、口咽癌預(yù)后顯著相關(guān)，與喉癌的預(yù)后無相關(guān)性。Cabanillas等[37]用免疫組織化學(xué)檢測106例行腫瘤切除和雙側(cè)頸淋巴結(jié)清掃術(shù)治療的聲門上型喉鱗癌組織中HⅠF-1α的表達(dá)情況，并分析其在預(yù)后的指導(dǎo)意義，發(fā)現(xiàn)HⅠF-1α在聲門上型喉鱗狀細(xì)胞癌手術(shù)治療中的表達(dá)不具有預(yù)后價值。而王麗等[15]分析100例(聲門區(qū)42例、聲門上區(qū)56例、聲門下區(qū)2例)喉癌患者癌組織HⅠF-1α及GLUT-1表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系，這些喉癌患者均行喉癌術(shù)后輔助放療，發(fā)現(xiàn)HⅠF-1α及GLUT-1高表達(dá)與患者預(yù)后效果不良密切相關(guān)。Schrijvers等[38]分析僅行放療的早期(T1-T2)聲門型喉鱗狀細(xì)胞癌患者HⅠF-1α的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)早期聲門型喉鱗狀細(xì)胞癌HⅠF-1α過表達(dá)與局部控制差和總生存率相關(guān)。而他們的另一項[39]對同樣行放療的早期(T1-T2)聲門上型喉鱗狀細(xì)胞癌患者研究卻發(fā)現(xiàn)了不同的結(jié)果：HⅠF-1α對早期(T1-T2)聲門上型喉鱗狀細(xì)胞癌局部控制缺乏預(yù)后指導(dǎo)意義。這些研究結(jié)果表明HⅠF-1α在聲門上型和聲門型喉鱗狀細(xì)胞中可能存在不同的預(yù)后指導(dǎo)價值。胚胎發(fā)生上的差異、周圍結(jié)構(gòu)對腫瘤擴(kuò)散屏障作用的不同以及分化程度和頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率發(fā)生的高低可能是造成HⅠF-1α在聲門上型和聲門型喉鱗狀細(xì)胞癌不同預(yù)后指導(dǎo)價值的原因。

綜上所述，HⅠF-1α作為實體腫瘤細(xì)胞發(fā)生低氧應(yīng)激反應(yīng)的重要標(biāo)志物，可通過調(diào)控其靶基因促進(jìn)新生血管及淋巴管形成、調(diào)節(jié)喉癌細(xì)胞的能量代謝，推動喉癌的發(fā)生、發(fā)展。HⅠF-1α的高表達(dá)與喉癌治療抵抗有關(guān)，抑制HⅠF-1α可增加喉癌細(xì)胞對放化療的敏感度。然而目前尚無可靠的HⅠF-1α靶向藥物應(yīng)用于臨床，HⅠF-1α特異性抑制劑的研究仍然是目前亟須解決的問題。HⅠF-1α在聲門上型喉癌和聲門型喉癌中的預(yù)后指導(dǎo)意義的差異還需更多的研究證實。HⅠF-1α與喉癌的關(guān)系值得進(jìn)一步研究。相信隨著研究的進(jìn)一步深入，未來HⅠF-1α可被用作喉癌的可靠診斷標(biāo)志物和治療的靶蛋白之一。