李素云 吳冬梅 劉慧晴 唐 磊 袁靖哲 尹菊梅 賀修勝△

（南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院，1 應(yīng)用解剖與生殖醫(yī)學(xué)研究所，2 腫瘤研究所， 3 2018級(jí)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)，4 2017級(jí)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)，衡陽(yáng) 421001）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma， NPC）是常見(jiàn)的頭頸部惡性腫瘤之一，起源于鼻咽部黏膜上皮。STGC3 基因是本課題組前期通過(guò)ESTs（expressed sequence tags，ESTs），采用定位候選克隆方法，對(duì)鼻咽癌LOH 3p21 區(qū)域比對(duì)分析與鑒定，所得到的鼻咽癌抑瘤基因[1]。前期研究表明，STGC3 基因在正常鼻咽和鼻咽癌組織中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，是鼻咽癌表達(dá)下調(diào)的基因，但其表達(dá)調(diào)控機(jī)制不清楚[2-7]。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)，預(yù)測(cè)STGC3 基因核心啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，采用電泳遷移率變動(dòng)分析（EMSA）和染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)，體內(nèi)外證實(shí)與STGC3 基因啟動(dòng)子特異性結(jié)合位點(diǎn)，從而鑒定出STGC3 基因表達(dá)調(diào)控的元件，以期為研究STGC3基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供前期基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 生物信息學(xué)分析軟件

AliBaba2.1：http://www.gene-regμLation.com/pub/programs/alibaba2/index.html。TESS：http://www.cbil.upenn.edu/tess。TFSEARCH：http://mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html。

1.2 細(xì)胞

人鼻咽癌細(xì)胞系（CNE2）由本研究所保存，用10 %新生小牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基，置于恒溫37℃、含5% CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素、鏈霉素（雙抗）購(gòu)自Gibico公司；DMSO購(gòu)自杭州四季青公司；高保真DNA聚合酶購(gòu)自Fermentas公司；DNA Marker DL2000購(gòu)自廣州美津生物公司；胰酶購(gòu)自HyClone公 司；BCA Protein Assay Kit、核蛋白抽提試劑盒、LightShift Chemiluminescent EMSA Kit、Halt Protease Inhibition Cocktail Kit購(gòu)自Pierce公司；Sp1抗體、磁場(chǎng)、ChIP試劑盒購(gòu)自Millipore公司；正電荷尼龍膜購(gòu)自Amersham公司；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；2×Taq PCR Master Mix、EB購(gòu)自Sigma公司；瓊脂糖、無(wú)水乙醇、氯仿、甲醛分析純購(gòu)自國(guó)產(chǎn)分析純公司。

1.4 引物設(shè)計(jì)

運(yùn)用生物信息學(xué)，預(yù)測(cè)STGC3基因核心啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子Sp1結(jié)合位點(diǎn)所在序列為-832 ～ -807 bp，采用Primer 5.0設(shè)計(jì)ChIP實(shí)驗(yàn)、PCR實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)錄因子Sp1（Sp1）所需的引物，由上海生工公司合成（表1）。

表1 PCR 引物序列與產(chǎn)物長(zhǎng)度Tab 1 PCR primer sequence and product size

1.5 CNE2 細(xì)胞核蛋白抽提步驟

取呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞；棄培養(yǎng)液，胰酶消化，將懸液轉(zhuǎn)移至1.5 mL無(wú)酶EP管；離心：4℃、1 500 r/min、10 min，棄上清；用預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞，同條件離心，棄上清液；重復(fù)離心1次；加冰上預(yù) 冷 的CERⅠ200 μL（含Halt Protease Inhibitor， 2 μL），輕輕振搖15 s，重懸細(xì)胞，冰上置10 min；加冰上預(yù)冷的CERⅡ11 μL，輕輕振搖5 s，冰上置1 min；振搖5s后，離心：4 ℃、13 000 r/min、 5 min；迅速轉(zhuǎn)上清，即胞質(zhì)蛋白提取物，至一潔凈的冰上預(yù)冷的EP管中，標(biāo)記后，置于-80℃冰箱備用；向沉淀中加入冰上預(yù)冷的NER100 μL（含Halt Protease Inhibitor， 1 μL），輕輕振搖15 s，重懸細(xì)胞，冰上置10 min；離心：4℃、13 000 r/min、5 min；迅速轉(zhuǎn)上清，即胞核蛋白提取物，至另一冰上預(yù)冷的無(wú)酶EP管中；BCA法測(cè)定核蛋白濃度，存于-80℃冰箱備用。

1.6 EMSA 檢測(cè)

制備6%非變性聚丙烯酰胺凝膠；預(yù)電泳：用0.25×TBE 緩沖液，120 V 電壓、冰浴中預(yù)電泳 1 h；DNA-蛋白結(jié)合反應(yīng)：以AliBaba 2.1 預(yù)測(cè)結(jié)果為基準(zhǔn)，結(jié)果顯示STGC3 基因核心啟動(dòng)子區(qū) -825 bp ～-816 bp 區(qū)域只有Sp1 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，截取該區(qū)域26 bp（-932 ～-807 bp）寡核苷酸序列制作特異性探針，探針序列為：

Wt-Sp1， 5'-AAAAAGGCCGGGCGCGGTGG CTCACG-3'， Mt-Sp1， 5'- AAAAAGGCCAAGCA TGGTGGCTCACG-3'， 并對(duì)Wt-Sp1 和Mt-Sp1 結(jié)合的DNA 雙鏈探針的5'-端進(jìn)行生物素標(biāo)記，生物素標(biāo)記野生型和突變型探針，以及未標(biāo)記的野生型探針均由北京微奧基因科技有限公司合成；上樣；電泳及轉(zhuǎn)膜；紫外交聯(lián)：轉(zhuǎn)膜完成后，將膜取出，置于一干燥的濾紙上，溴酚藍(lán)面向上，將膜放置于紫外燈（波長(zhǎng)254 nm）下約10 cm 處，紫外交聯(lián)10 min；化學(xué)發(fā)光檢測(cè)生物素標(biāo)記的DNA。

1.7 ChIP 分析

體內(nèi)交聯(lián)與裂解；超聲波斷裂DNA；免疫沉淀已交聯(lián)的蛋白/DNA 復(fù)合物；洗脫蛋白/DNA 復(fù)合物與解交聯(lián)蛋白/DNA 復(fù)合物使DNA 游離；Spin Columns 洗脫DNA；PCR 擴(kuò)增，其中PCR 擴(kuò)增反應(yīng)：根據(jù)Primer 5.0 設(shè)計(jì)的引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min 后循環(huán)，94℃變性 30 s，54℃退火50 s，72℃延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)后于72 ℃終延伸5 min，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL 與1 μL 6×上樣緩沖液混勻后，于1%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，檢測(cè)擴(kuò)增片段。

2 結(jié)果

2.1 STGC3 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件預(yù)測(cè)

AliBaba 2.1、TESS 和TFSEARCH 3 種在線軟件，預(yù)測(cè)并分析STGC3 基因核心啟動(dòng)子-934 ～ -653 bp 區(qū)域序列內(nèi)存在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。結(jié)果顯示，該基因核心啟動(dòng)區(qū)域內(nèi)存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件較多，綜合分析預(yù)測(cè)結(jié)果，確定以AliBaba 2.1 軟件預(yù)測(cè)結(jié)果作為本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如圖1 所示，在軟件默認(rèn)參數(shù)條件下，即：Pairsim to known sites：50；Mat width in bp：10；Min num of sites：4；Min mat. Conservation：75%；Sim of seq to mat：1%；Factor class level：4，結(jié)果顯示，STGC3 基因核心啟動(dòng)區(qū)域存在AP-1、Sp1、GAL4、HNF-3B、USF、C/EBPalp 等21 個(gè)相關(guān)調(diào)控元件，其中9 個(gè)為Sp1 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。嚴(yán)格限定其參數(shù)后（Pairsim to known sites ：64 ；Min mat. Conservation ：80%），結(jié)果顯示，STGC3 基因核心啟動(dòng)區(qū)域有5個(gè)轉(zhuǎn)錄相關(guān)調(diào)控元件，其中2 個(gè)為Sp1 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（圖2）。

圖1 參數(shù)默認(rèn)時(shí)，STGC3 基因核心啟動(dòng)區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件預(yù)測(cè)結(jié)果Fig 1 The predicted result of transcription regulatory elements in the core promoter region of STGC3 gene by default

2.2 EMSA 鑒定STGC3 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件

根據(jù)生物信息預(yù)測(cè)結(jié)果，STGC3 基因存在轉(zhuǎn)錄因子Sp1 結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)行EMSA 實(shí)驗(yàn)，選擇STGC3 基因核心啟動(dòng)子區(qū)中轉(zhuǎn)錄因子Sp1 結(jié)合位點(diǎn)的26 bp（-832 ～-807 bp）寡核苷酸序列，人工合成5'末端生物素辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的野生型（Biotin-Wt Sp1）和突變型（Biotin-Mt Sp1）雙鏈探針，同時(shí)合成未生物素辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的野生型（Wt Sp1）探針，未標(biāo)記的野生型探針（Wt Sp1）作為特異性競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)（圖3）。將所合成的探針與實(shí)驗(yàn)所提取的CNE2 細(xì)胞核蛋白質(zhì)進(jìn)行EMSA 實(shí)驗(yàn)，以確定轉(zhuǎn)錄因子Sp1 與其特異性結(jié)合位點(diǎn)是否特異性結(jié)合。結(jié)果顯示，Sp1 探針與CNE2 細(xì)胞提取的核蛋白結(jié)合，形成特異性DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物條帶 （圖4，第2 泳道）；當(dāng)加入100倍和50 倍的末端未標(biāo)記野生探針（Wt Sp1）競(jìng)爭(zhēng)性探針后，特異性DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物條帶消失（圖4，第3 ～4 泳道）；加入突變探針，未形成特異性DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物條帶 （圖4，第5 泳道）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明STGC3 核心啟動(dòng)子區(qū)存在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

下劃線為Sp1 核心序列；方格中為突變堿基；Wt Sp1 為未標(biāo)記的野生型探針；Biotin-Mt Sp1 為生物素標(biāo)記的突變型探針；Biotin-Wt Sp1 為生物素標(biāo)記的野生型探針（圖3）。

圖2 嚴(yán)格限定參數(shù)后，STGC3 基因核心啟動(dòng)區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件預(yù)測(cè)結(jié)果Fig 2 The prediction result of transcription regulatory elements in the core promoter region of STGC3 gene after strictly defining parameters

圖3 人工合成的Sp1 寡核苷酸雙鏈探針序列Fig 3 The synthetic SP1 oligonucleotide double strand probe sequence

2.3 ChIP 鑒定STGC3 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件

采用ChIP 進(jìn)一步鑒定STGC3 基因核心啟動(dòng)區(qū)存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。實(shí)驗(yàn)中為排除可能出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，實(shí)驗(yàn)分5 組，分別是陽(yáng)性對(duì)照組，即沒(méi)有用抗體處理的含有總基因DNA 的imput，陰性對(duì)照組是用IgG 處理的DNA，同時(shí)設(shè)Anti-Polymerase Ⅱ和No antibody 組排除假陽(yáng)性及假陰性，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)錄因子Sp1 抗體實(shí)驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照Input 組、假陽(yáng)性Anti-Polymerase Ⅱ組均檢測(cè)到與目的片段大小一致的200 bp 擴(kuò)增片段，而陰性IgG 組和假陰性No antibody 組均未產(chǎn)生目的條帶（圖5）。結(jié)果表明，STGC3 基因核心啟動(dòng)子區(qū)含有轉(zhuǎn)錄因子Sp1 結(jié)合位點(diǎn)，STGC3 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件預(yù)測(cè)正確。

圖4 EMSA 鑒定STGC3 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件結(jié)果Fig 4 Transcription regulatory element of idenffied by EMSA

圖5 ChIP 鑒定STGC3 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件Fig 5 Transcription regulatory element of STGC3 gene identified by ChIP

3 討論

隨著生命科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，海量信息數(shù)據(jù)庫(kù)不斷完善，生物信息學(xué)已成為當(dāng)今基因結(jié)構(gòu)及功能研究中不可缺少的重要工具之一。生物信息學(xué)是一個(gè)龐大的系統(tǒng)，可以對(duì)基因組中海量調(diào)控序列數(shù)據(jù)進(jìn)行研究，如啟動(dòng)子及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè) 分析[8]。

激發(fā)轉(zhuǎn)錄的不可缺少的部分是核心啟動(dòng)子，核心啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)通常有一些重要的調(diào)控元件[9]。前期研究采用生物信息學(xué)，預(yù)測(cè)STGC3 基因的啟動(dòng)子，將啟動(dòng)子構(gòu)建報(bào)告基因載體，對(duì)報(bào)告基因表達(dá)產(chǎn)物活性進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測(cè)，確定了STGC3 基因核心啟動(dòng)子區(qū)[10]。為揭示STGC3 基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子機(jī)制，運(yùn)用3 種不同的在線軟件AliBaba 2.1、TESS和TFSEARCH， 對(duì)STGC3基因核心啟動(dòng)子可能存在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，當(dāng)AliBaba 2.1 軟件默認(rèn)參數(shù)時(shí)預(yù)測(cè)，顯示該核心啟動(dòng)子區(qū)存在多個(gè)重要調(diào)控元件如AP-1、Sp1、GAL4、HNF-3B、USF、C/EBPalp等，且Sp1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)最多；嚴(yán)格調(diào)整其參數(shù)，結(jié)果顯示，STGC3基因核心啟動(dòng)子區(qū)存在5個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，其中Sp1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)同樣最多。Sp1普遍存在于生物各種細(xì)胞與組織中，是DNA 結(jié)合蛋白，能特異性與DNA 結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，調(diào)控富含GC序列的細(xì)胞和病毒基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄[11-12]。

EMSA 和ChIP 技術(shù)，是當(dāng)前研究基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的經(jīng)典方法，從體外、體內(nèi)驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件中轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)及兩者的相互作用關(guān)系。EMSA 是體外檢測(cè)蛋白質(zhì)和DNA 序列相互結(jié)合的技術(shù)，最初用于DNA 結(jié)合蛋白質(zhì)與相關(guān)DNA 結(jié)合序列相互作用，可定性和定量，現(xiàn)已用于RNA 結(jié)合蛋白和特異性RNA 序列結(jié)合研究[13]。由于有些轉(zhuǎn)錄因子不具有結(jié)合的特異性，即便轉(zhuǎn)錄因子和寡核苷酸探針結(jié)合，不能說(shuō)明在體情況下轉(zhuǎn)錄因子不能和其他寡核苷酸結(jié)合，有一定的局限性。ChIP 技術(shù)是體內(nèi)檢測(cè)與特異性蛋白結(jié)合的DNA 序列，此項(xiàng)技術(shù)最大的優(yōu)點(diǎn)是在活體狀態(tài)下，檢測(cè)蛋白質(zhì)和目的DNA 結(jié)合情況，減少了體外實(shí)驗(yàn)的誤差，在活體細(xì)胞中，首先對(duì)與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA 分離，通過(guò)一定的方法隨機(jī)剪切染色質(zhì)，用調(diào)節(jié)蛋白抗體沉淀目的染色質(zhì)，再用PCR 檢測(cè)目的DNA 片段。

EMSA結(jié)果證實(shí)，STGC3核心啟動(dòng)區(qū)內(nèi)有轉(zhuǎn)錄因子Sp1結(jié)合位點(diǎn)，其結(jié)合具有特異性。ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明STGC3基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件預(yù)測(cè)與實(shí)驗(yàn)吻合。上述實(shí)驗(yàn)說(shuō)明STGC3基因核心啟動(dòng)子區(qū)有轉(zhuǎn)錄因子Sp1結(jié)合位點(diǎn)，STGC3基因核心啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)為STGC3基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。本實(shí)驗(yàn)對(duì)STGC3基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的鑒定，將為STGC3基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的相關(guān)分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

參與文獻(xiàn)

[1]賀修勝， 肖志強(qiáng)， 陳主初， 等.STGC3 新基因的克隆及功能初步分析[J]. 癌癥，2004， 23（10）： 1110-1115.

[2]鄧敏， 賀修勝， 羅橋，等.Tet 調(diào)控STGC3 基因表達(dá)CNE2 細(xì)胞系的建立及其功能初步研究[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展， 2006， 33（1）：39-44.

[3]胡波， 邱青朝，賀修勝，等.雌激素對(duì)轉(zhuǎn)STGC3 基因CNE2 細(xì)胞系生長(zhǎng)增殖的影響[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展， 2007， 34（5）：538-545.

[4]邱青朝， 胡波， 賀修勝， 等.Tet 調(diào)控STGC3 基因表達(dá)的CNE2 細(xì)胞系裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)性研究[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展， 2007， 34（4）：359-365.

[5]He X S， Deng M， Yang S， et al. The tumor supressor function of STGC3 and its reduced expression in nasopharyngeal carcinoma[J]. Cell Mol Biol Lett，2008，13（3）：339-352.

[6]李麗， 賀修勝， 羅橋， 等.STGC3 基因缺失對(duì)CNE2 細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力的影響[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展， 2011，38（3）：248-253.

[7]Qiu Q C， Hu B， He X P， et al. STGC3 inhibits xenograft tumor growth of nasopharyngeal carcinoma cells by altering the expression of proteins associated with apoptosis [J]. Genet Mol Biol， 2012，35（1）：18-26.

[8]Xiong Q，Jiang X，Liu X et al. Prediction of IER5 structure and function using a bioinformatics approach[J]. Mol Med Rep，2019，19（6）：4631-4636.

[9]Levy S， Hannenhalli S. Identification of transcription factor binding sites in the human genome sequence[J]. Mamm Genome， 2002，13（9）：510-514.

[10]Li SY， Wang L L， Sheng H X，et al. Identification and analysis of the promotor region of STGC3 gene[J]. Arch Med Sci，2015，11（5）：1095-1100.

[11]Vizcaíno C， Mansilla S， Portugal J， et al. Sp1 transcription factor ： a long-standing target in cancer chemotherapy[J]. Pharmacol Ther， 2015，152（4）：111-124.

[12]Noda K，Yamazaki M， Iwai Y， et al. IL-1β and TNF-α regulate mouse amelotin gene transcription in gingival epithelial cells[J]. J Oral Sci，2018， 60（3）：388-398.

[13]Pan Y，Comiskey D F，Kelly L E， et al. Regulation of photoreceptor gene transcription via a highly conserved transcriptional regulatory element by vsx gene products[J]. Mol Vis，2016， 14 （22）：1421-1428.