王 俏 柏樹令 李志遠(yuǎn) 王小紅 田曉紅 常世杰 佟 浩 范 軍△

（中國醫(yī)科大學(xué)公共基礎(chǔ)學(xué)院，1 組織工程教研室，2 生物醫(yī)學(xué)工程教研室，沈陽 110001）

脂肪干細(xì)胞是一類多能干細(xì)胞，具有多向分化潛能，在骨損傷修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用[1-5]。微小核糖核酸（microRNAs， miRNAs）是一類22 ～24 bp 的非編碼RNA，在脂肪干細(xì)胞的譜系定型、成脂和成骨發(fā)育過程發(fā)揮重要作用[6-7]。研究表明，破骨細(xì)胞分化過程中miR-150 的表達量呈現(xiàn)下降趨勢[8]。體內(nèi)研究表明，miR-150 可作為成骨負(fù)向調(diào)控因子，通過影響Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-related transcription factor 2，RUNX-2）的表達調(diào)控成骨分化[9]。然而miR-150 影響人脂肪干細(xì)胞（human adipose-derived stem cells， hADSCs）成骨分化的機制尚不清楚。研究表明，Notch3 參與成骨分化過程[10]，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)miR-150過表達后Notch3 的表達量下降。本研究通過上調(diào)miR-150 在hADSCs 中的表達，探索miR-150 通過調(diào)控Notch3 對hADSCs 成骨的影響，為臨床骨缺損的修復(fù)和治療提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

胎牛血清、DMEM/F12 培養(yǎng)基、 青霉素/鏈霉素溶液、胰蛋白酶（美國Gibco 公司）；Lipofectamine 2000（美 國Invitrogen 公 司 ）、pmirGLO 質(zhì)粒（武漢基因創(chuàng)造生物工程有限公司）；siPORTTMNeoFXTM染劑（美國Applied Biosystems公司）；SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、BCA 蛋白測定試劑盒（上海碧云天有限公司）；TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ （Tli RNaseH Plus）試劑盒（日本TaKaRa）；茜素紅染 液、TRIzol 試劑（美國Invitrogen 公司）、異丙醇、抗壞血酸、地塞米松、 β-甘油磷酸鈉（北京索萊寶科技有限公司）；堿性磷酸酶（ALP）檢測試劑盒（美國 Sigma 公司）。

1.2 hADSCs 的分離和培養(yǎng)

參照本實驗室前期工作[11]，從人脂肪組織中分離培養(yǎng)hADSCs，將細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM/F12 完全培養(yǎng)基中（10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素），置于37 °C、5%的CO2培養(yǎng)箱中。每2 ～3 d 更換 1 次細(xì)胞培養(yǎng)基。待細(xì)胞密度達到80% ～90%時應(yīng)用胰蛋白酶進行消化傳代。

1.3 hADSCs 成骨分化過程中miR-150 的表達

將hADSCs計數(shù)后接種于60 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞密度達80%～90%時加入配制好的成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液（即F12+10%胎牛血清+10 mmol/L β-甘油磷酸鈉+0.1 μmol/L地塞米松+50 mg/L維生素C）。將hADSCs分別誘導(dǎo)0、1、3、7、11、14 d。采用Real-time PCR檢測miR-150的表達。

1.4 hADSCs 的感染與轉(zhuǎn)染

將hADSCs 計數(shù)后，以1×104/孔的密度接種于6 孔板中，待細(xì)胞密度達80%～90%時，將攜帶miR-150 的腺病毒（美國維真生物）感染hADSCs 構(gòu)建miR-150 過表達組（miR-150 組）；用空載體病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建綠色熒光蛋白對照組（GFP組）；不作任何處理的設(shè)為空白對照組（NC 組），4 h 后換液。繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后更換培養(yǎng)基，用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達情況。使用針對干擾Notch3（shNotch3-siR）的慢病毒和干擾對照（shNC）的包裝有發(fā)夾（sh）RNA 的 Notch3 表達載體（Plent-U6-GFP-Puro，8.3 kb）的慢病毒感染hADSCs，構(gòu)建Notch3 敲低的hADSCs 組（Notch3-siR 組）、GFP 對照組（GFP 組）和空白對照組（NC組），4 h 后換液。繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后更換培養(yǎng)基，用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達情況。shRNA靶序列如下： 5′-GCACCCAGTCCGCCCTGAGCA AATTCAAGAGATTTGCTCAGGGCGGACTGGGT GCTTTTT-3′（shNC），5′-GATCCGCTAGCTTCT CGTGTGCTTGTTTCAAGAGAACAAGCACACG AGAAGCTAGCTTTTTTA-3′（Notch3-siR）。

1.5 Real-time PCR 檢測miR-150-5p 的表達

MiR-150 引物（銳博生物，貨號：MQP-O102），每（5 ～10）×106個細(xì)胞加1 mL TRIzol 后，反復(fù)用槍吹打以裂解細(xì)胞后轉(zhuǎn)入 1.5 mL EP 管中；以每1 mL TRIzol 液加入0.2 mL氯仿，劇烈震蕩后離心。取上層水相再加入等體積異丙醇，放置10 min 后，再離心10 min。棄去上清液，用75%乙醇洗滌沉淀。棄上清再把沉淀干燥得到的RNA 加無酶水溶解。分別用400 ng RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再把得到的cDNA 用Tli RNaseH Plus 試劑盒進行擴增。

1.6 熒光素酶報告實驗分析 miR-150 的下游靶基因

運用TargetScan 軟件預(yù)測分析，Notch3 可能是miR-150 的下游靶基因。用點突變試劑盒（Agilent Technologies 公司）使Notch3 3′端的miR-150 的結(jié)合序列突變，然后把突變的Notch3（Mut-Notch3）和野生型Notch3（WT-Notch3）分別插入到pmirGLO質(zhì)粒（武漢基因創(chuàng)造生物工程有限公司）的SacI和XhoI切割位點之間。采用Lipofectamine 2000（Invitrogen）將含有Mut-Notch3或WT-Notch3螢光素酶報道分子和miR-150模擬物或陰性對照（Control）聯(lián)合轉(zhuǎn)染至hADSCs。48 h后，按試劑盒說明書操作檢測細(xì)胞螢火蟲和海腎熒光素酶活性，將海腎熒光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化為螢火蟲熒光素酶 活性。

1.7 hADSCs 的成骨誘導(dǎo)

NC組、GFP組、miR-150組細(xì)胞于6孔板中培養(yǎng)48 h 后，去除培養(yǎng)液和懸浮細(xì)胞。加入成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液連續(xù)誘導(dǎo)7 d 后進行ALP 染色及ALP 活性檢測。將NC 組、GFP 組、Notch3-siR 組 于6 孔 板中培養(yǎng)48 h 后，去除培養(yǎng)液和懸浮細(xì)胞。加入成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液連續(xù)誘導(dǎo)7 d 后，采用免疫印跡檢測RUNX-2 表達。

1.8 免疫印跡檢測Notch3 和RUNX-2 蛋白的表達

用蛋白裂解液收集各組細(xì)胞的蛋白質(zhì)， BCA法檢測各組蛋白質(zhì)濃度，等質(zhì)量蛋白上樣，SDSPAGE 電泳后用濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，再用5%的奶粉溶液室溫封閉2 h。加入Notch3 鼠來源抗體（sc-515617， 1∶200， Santa Cruz， 美國）、RUNX-2 兔來源抗體（AB41419，1∶1 000， AbSci， 美國）、GAPDH 鼠來源單克隆抗體（60004，1∶5 000， Proteintech，美國），4°C 孵育過夜。次日用TBST 洗膜后加入HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠、山羊抗兔的二抗（1∶5 000，AbSci， 美國）室溫孵育 2 h。TBST 洗膜3 次，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。用Image J 對圖像進行灰度值統(tǒng)計分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS18.0 軟件對數(shù)據(jù)進行分析，2 組資料均值之間用獨立樣本t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hADSCs 成骨誘導(dǎo)過程中miR-150 的表達變化

Real-time PCR 結(jié)果顯示 hADSCs 成骨誘導(dǎo)1、3、7、11、14 d 后， miR-150 的表達量隨著誘導(dǎo)時間的延長出現(xiàn)下降（圖1）。

2.2 過表達miR-150 可抑制hADSCs 的成骨分化

熒光倒置顯微鏡下觀察到GFP 組和miR-150組中有大量綠色熒光蛋白表達，而對照組未見表達（圖2）。Real-time PCR 結(jié)果顯示，miR-150 組miR-150 表達量明顯高于GFP 組和NC 組（圖3），表明包裝miR-150 的腺病毒成功感染hADSCs。成骨誘導(dǎo)7 d 后，免疫印跡檢測結(jié)果顯示，miR-150組RUNX-2蛋白表達量明顯低于NC組和GFP 組（圖4）；ALP 活性檢測結(jié)果顯示，miR-150 組ALP活性低于NC 組和GFP 組（圖5）；ALP 染色結(jié)果顯示，與NC 組 和GFP 組比較，miR-150 組ALP染色強度減弱（圖6）。

2.3 miR-150 靶向調(diào)控Notch3

為明確miR-150 對Notch3 的直接靶向調(diào)控，采用熒光素酶報告分析證明預(yù)測的相互作用。結(jié)果顯示，miR-150 過表達通過與Notch3 的3′UTR相互作用顯著抑制熒光素酶的活性，而miR-150 對Mut-Notch3 組的熒光素酶無影響（圖7）。免疫印跡結(jié)果顯示，miR-150 組Notch3 蛋白的表達量明顯低于NC 組和GFP 組（圖8）。

2.4 Notch3 的下調(diào)減弱了hADSCs 的成骨分化

熒光倒置顯微鏡下觀察到GFP組和Notch3-siR組中有大量綠色熒光蛋白表達，而NC組未見表達，表明成功轉(zhuǎn)染Notch3-siR至hADSCs（圖9）。免疫印跡檢測結(jié)果顯示，Notch3-siR組Notch3蛋白的表達量明顯低于NC組和GFP組（圖10）。成骨誘導(dǎo) 7 d后，Notch3-siR組RUNX-2的表達顯著低于NC組和GFP組（圖11）。

3 討論

外傷、骨折或腫瘤切除可導(dǎo)致骨丟失、骨缺損。骨移植手術(shù)是治療大骨缺損的主要治療手段，但手術(shù)存在諸如供體組織不足和潛在的免疫原性等不足[12]。近年來，組織工程學(xué)提供了一種新的策略，可以體外培養(yǎng)出生物活性組織，用于骨缺損的修復(fù)治療。一些臨床研究已經(jīng)證實了干細(xì)胞具有分化為成骨細(xì)胞的潛力，可促進骨缺損的愈合[13-15]。hADSCs 具有來源相對豐富，易于分離的特性，因此被廣泛用作骨再生研究。另一方面，培養(yǎng)細(xì)胞的高增殖和向間充質(zhì)譜系分化的潛力是選擇hADSCs的原因[4，16]。

miRNA 是一種內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA 分子，可通過與3′非翻譯區(qū)（3′-UTR）或核苷酸不完全互補來調(diào)控靶基因開放閱讀框，最終通過抑制翻譯或促進mRNA 衰減來抑制基因表達[17]。miRNA參與多種生理和病理過程，在干細(xì)胞的成脂、成骨和增殖過程中發(fā)揮重要作用[18-19]。Notch 信號是由配體（Jagged-1，-2 和Delta-like-1、-3、-4）與細(xì)胞表面Notch 受體（Notch-1、-2、-3、-4）在早老素-γ-分泌酶復(fù)合物上最終裂解受體，并釋放Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（NICD），后者移入細(xì)胞核并激活細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄[20]。Notch 通路參與人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程[21]。miRNA 可通過Notch 通路調(diào)控細(xì)胞增殖、分化，例如miR-34a 調(diào)控Notch 信號通路促進了根尖乳頭干細(xì)胞成骨分化[22]。本研究通過TargetScan 軟件預(yù)測分析，Notch3 可能是miR-150 的靶基因，雙熒光素酶報告實驗也證實了miR-150 可靶向調(diào)控Notch3。進一步研究結(jié)果顯示，hADSCs 過表達miR-150 后，顯著抑制Notch3 的表達水平。但miR-150 和Notch3 是否參與hADSCs的成骨分化尚不清楚。本研究證實miR-150 過表達抑制了hADSCs 成骨分化，Notch3 敲除后同樣抑制hADSCs 的成骨分化。郭偉壯等[8]研究也顯示，miR-150 通過負(fù)性調(diào)控RUNX-2 的表達影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。

綜上，本研究證實了miR-150 對hADSCs 成骨分化具有抑制作用，其機制可能是miR-150 下調(diào)Notch3 的表達，進而抑制成骨分化，為后期臨床骨組織缺損的修復(fù)和治療提供了新的實驗依據(jù)，但具體作用機制還需進一步研究。

圖1 miR-150 在hADSCs 成骨誘導(dǎo)分化的表達， *P＜0.05、**P＜0.01 vs 0 d.圖2 過表達miR-150 的hADSCs 的構(gòu)建，標(biāo)尺=100 μm。A：NC 組；B：GFP 組；C： miR-150 組.圖3 miR-150 在hADSCs 中的表達。 *P＜0.05 vs GFP 組.圖4 hADSCs 成骨誘導(dǎo)7 d RUNX-2 表達。A： RUNX-2 在hADSCs 中的表達情況，免疫印跡；B： RUNX-2 半定量分析，*P＜0.05 vs GFP 組.圖5 hADSCs 成骨誘導(dǎo)7 d ALP 活性，**P＜0.01 vs GFP 組.圖6 hADSCs 成骨誘導(dǎo)7 d ALP 染色，標(biāo)尺=50 μm。A： NC 組；B： GFP 組；C： miR-150 組.圖7 熒光素報告實驗結(jié)果，**P＜0.01 vs NC 組.圖8 Notch3 在hADSCs 中的表達。Notch3 在hADSCs 中的電泳圖及Notch3 半定量分析， **P＜0.01 vs GFP 組.圖9 Notch3-siR 感染hADSCs， 標(biāo)尺=100 μm。A：NC 組；B： GFP 組；C： Notch3-siR 組.圖10 Notch3 在hADSCs 中的表達。Notch3 在hADSCs 中的電泳圖及Notch3 半定量分析，*P＜0.05 vs GFP 組.圖11 RUNX-2 在hADSCs 的表達。RUNX-2 在hADSCs 的電泳圖及 RUNX-2 半定量分析， *P＜0.05 vs GFP 組.Fig 1 Expression of miR-150 in hADSC osteogenic differentiation on 0 d， 1 d， 3 d， 7 d， 11 d and 14 d. *P＜0.05， **P＜0.01 vs 0 d.Fig 2 Construction of hADSCs overexpressing miR-150， bar=100 μm. A：NC group； B： GFP group； C： miR-150 group.Fig 3 miR-150 expression in hADSCs. *P＜0.05 vs GFP group.Fig 4 RUNX-2 expression of hADSCs at 7 d after osteogenesis induction. A： RUNX-2 expression in hADSCs； B：Semi-quantitative analysis of RUNX-2， *P＜0.05 vs GFP group.Fig 5 ALP activity at 7 d after hADSCs osteogenic induction. **P＜0.01 vs GFP group.Fig.6 ALP staining at 7 d after hADSCs osteogenic induction， bar=50 μm. A： NC group； B： GFP group； C：miR-150 group.Fig 7 Fluorescein reported experimental results， **P＜0.01 vs NC group.Fig 8 Notch3 expression in hADSCs. The electrophoretogram of Notch3 expression in hADSCs and semi-quantitative analysis of Notch3，**P＜0.01 vs GFP group.Fig 9 Knockout of Notch3 protein in hADSCs， bar=100 μm. A：NC group； B： GFP group； C：Notch3-siR group.Fig 10 Notch3 expression in hADSCs. The electrophoretogram of Notch3 expression in hADSCs and semi-quantitative analysis of Notch3， *P＜0.05 vs GFP group.Fig 11 Expression of RUNX-2 in hADSCs. The electrophoretogram of expression of RUNX-2 and semi-quantitative analysis of RUNX-2， *P＜0.05 vs GFP group.