謝慧，高蕾，趙丹丹，張宏森，毛國濤，王風(fēng)芹，宋安東

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州， 450002)

據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織估計(jì)，全世界25%的谷物供應(yīng)受真菌毒素污染，其中2%的糧食由于發(fā)生霉變而不能食用[1]。農(nóng)作物污染給食品工業(yè)、飼料工業(yè)和畜牧業(yè)的發(fā)展帶來了重大問題，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，已引起全球的廣泛關(guān)注[2-3]。真菌毒素種類繁多，其中黃曲霉毒素(aflatoxin，AF)是迄今發(fā)現(xiàn)農(nóng)產(chǎn)品污染中毒性最強(qiáng)的一類生物毒素，對人類和動物具有極強(qiáng)的致突變、致癌和致畸性[4]。玉米、小麥、高粱、花生餅、豆粕、棉籽粕、玉米秸稈等農(nóng)產(chǎn)品因貯存不當(dāng)或其他原因都會污染AF[5]，這些原料經(jīng)污染后，AF含量可高達(dá)50～80 μg/kg，遠(yuǎn)高于中國規(guī)定的最高限量標(biāo)準(zhǔn)20 μg/kg[6]。在動物生產(chǎn)中，一旦日糧(如小麥、麩皮、玉米、豆粕等)被AF污染，輕則導(dǎo)致動物體增重降低，飼料轉(zhuǎn)化率下降，重則誘發(fā)腫瘤和癌癥，甚至死亡，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[7]。人類攝入AF后，被細(xì)胞色素P450酶代謝形成活性中間體，與肝細(xì)胞相互作用引起肝癌[8]。因此防止貯存過程中原料發(fā)生霉變是食品與飼料生產(chǎn)過程中的必要環(huán)節(jié)，同時對于已發(fā)生霉變的食品與飼料原料，如何高效去除AF就成為當(dāng)今亟待解決的重大問題。本文對生物法降解AF進(jìn)行了闡述，重點(diǎn)介紹了微生物和昆蟲對AFB1的降解作用及降解機(jī)制，為后續(xù)生物法降解AF提供理論依據(jù)。

1 AF的去除

AF有20多種，常見的有AFB1、AFB2、AFG1和AFG2。其中AFB1的毒性最強(qiáng)，因此被用來作為AF的評價指標(biāo)[9]。目前市場上常用的降解AF的方法主要有物理方法，化學(xué)方法和生物方法。物理法通過高溫加熱、紫外線照射等使AFB1結(jié)構(gòu)破壞或通過吸附劑將AFB1吸附從而達(dá)到去除AFB1的效果[10-12]。MARKOV等[13]利用5kGy γ-射線對47個污染的玉米樣品進(jìn)行照射，AFB1去除率可達(dá)69.8%，而經(jīng)10-kGy γ-射線照射后，AFB1的去除率提高到94.5%。物理法操作簡單，但是去除效率低且耗時。化學(xué)法去除AFB1的方法包括強(qiáng)氧化劑和堿處理，通過打開AFB1的某些化學(xué)鍵從而達(dá)到去除效果[14-15]。將污染AFB1的花生放置到臭氧發(fā)生器中，熏蒸60 h后，檢測到89.4%的AFB1被降解[16]。研究發(fā)現(xiàn)，弱堿高溫處理法對花生原料中AFB1有較好的去除效果，在121 ℃，pH 10條件下將花生粕處理60 min，AFB1降解率高達(dá)84.50%，將花生油在23.42%堿濃度下進(jìn)行處理，AFB1含量從34.78 μg/kg下降到0.37 μg/kg[17]?；瘜W(xué)法操作簡單、去除效果佳，但化學(xué)試劑會嚴(yán)重破壞飼料的營養(yǎng)物質(zhì)，對飼料造成二次污染。

生物法主要是利用微生物或酶制劑進(jìn)行脫毒。FARZANEH等[18]分離出1株枯草芽孢桿菌UTBSP1(BacillussubtilisUTBSP1)，該菌株可以降解肉湯培養(yǎng)基中AFB1，降解率達(dá)到85.66%。TOPCU等[19]研究了屎腸球菌(Enterococcusfaecium)降解AFB1的能力，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)48 h后，大約有40%的AFB1被降解。生物降解法是目前最環(huán)保最高效的降解方法，不僅可以有效降解毒素，還能提高飼料或食品的營養(yǎng)價值，不會造成二次污染。

2 生物法降解AFB1

2.1 微生物對AFB1的降解作用

微生物法降解 AFB1已經(jīng)逐漸成熟，近幾年，發(fā)現(xiàn)多種微生物對AFB1具有顯著的降解作用。例如，嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)、施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、藤黃單胞菌(Luteimonassp.)、泉水單胞菌(Silanimonassp.)、溶桿菌 (Lysobactersp.)、乳酸桿菌(Lactobacillussp.)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)和 紅串紅球菌(Rhodococcuserythropolis)等等。大多數(shù)研究者通過高通量測序如利用香豆素平板篩選出解毒效率高的優(yōu)勢菌株，表1為降解AFB1的部分菌株。

2.1.1 細(xì)菌對AFB1的降解作用

利用細(xì)菌對AFB1進(jìn)行高效降解是解決AF污染的一大研究熱點(diǎn)。WAN等[20]觀察到地衣芽孢桿菌BL010(BacilluslicheniformisBL010)具有較高的AFB1降解活性，是一種高效的AFB1降解菌株。SHU等[21]利用香豆素培養(yǎng)基分離到1株具有較強(qiáng)AFB1降解活性的細(xì)菌，鑒定為芽孢桿菌DY3108(BacillusvelezensisDY3108)，進(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn)其AFB1降解活性主要來源于菌株無細(xì)胞上清液，對蛋白酶K處理具有熱穩(wěn)定性和抗性，對十二烷基硫酸鈉處理具有敏感性，耐高溫且最適pH值寬泛。KARUNARATNE等[22]測定了3種乳酸桿菌(Lactobacillusp.)對黃曲霉菌生長和AF產(chǎn)生的影響，結(jié)果表明，3種乳酸桿菌能有效地抑制黃曲霉菌的生長，并能有效地減少AF的產(chǎn)生。SANGI等[23]分離出5株AFB1降解菌株，分別為短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、3株擬灰色赭桿菌(Ochrobactrumpseudogrigonens)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和陰溝腸桿菌(Enterobactercloace)，降解活性分別達(dá)到88%、78%、61%、58%和51%，這是首次證實(shí)了短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)對AFB1的降解，并首次報(bào)道了擬灰色赭桿菌(Ochrobactrumpseudogrigonens)和陰溝腸桿菌(Enterobactercloace)具有AFB1降解活性。XU等[24]測定了從玉米、水稻和土壤樣本中采集的43個細(xì)菌菌株的AFB1降解活性，分離出活性較高的菌株L7，鑒定為沙克氏桿菌(Bacillusshackletonii)。SILIVANO等[25]發(fā)現(xiàn)擬香味類香味菌3 J2MO(Myroidesodoratimimusstrain 3 J2MO)能很好地降解AFB1，采用高效液相色譜-熒光檢測法測定AFB1的含量，結(jié)果表明，在37 ℃ LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，約93.82%的AFB1被降解，該菌在農(nóng)產(chǎn)品和食品工業(yè)基質(zhì)中都有潛在的AF污染生物防治策略的生物修復(fù)和解毒作用。CHLEBICZ等[26]研究了12株乳酸桿菌和6株釀酒酵母對AF的降解作用，乳酸桿菌平均解毒效率為60%，酵母平均解毒效率為65%。WANG等[27]從雞盲腸篩出1株具有AFB1降解能力的菌株，用高效液相色譜法測定AFB1降解率為93.7%，經(jīng)16S rDNA基因序列分析和多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)鑒定為非致病性大腸桿菌CG1061(EscherichiacoliCG1061)。細(xì)菌是AFB1降解菌株的主力軍，但是其研究內(nèi)容較為簡單，只是研究了降解率、最適溫度、最適pH和有效降解成分的性質(zhì)，因此對細(xì)菌降解機(jī)理還需要進(jìn)一步研究。

表1 AFB1降解菌株Table 1 Aflatoxin B1 degradation strain

2.1.2 真菌對AFB1的降解作用

真菌降解AF對發(fā)酵生產(chǎn)和飼料利用更具實(shí)際應(yīng)用價值。降解AF的真菌主要包括雜色云芝(Trametesversicolor)、白腐真菌(Phanerochaete)和黑曲霉(Aspergillusniger)等。DAS等[28]將發(fā)霉的秸稈與不同菌株進(jìn)行共培養(yǎng)，利用高效液相色譜法測定AFB1的降解程度，發(fā)現(xiàn)黃曲霉MTCC 2798與糙皮側(cè)耳菌GHBBF10(PleurotusostreatusGHBBF10)共培養(yǎng)時，AFB1降解率可達(dá)89.41%，該菌株可進(jìn)一步開發(fā)，有效降解發(fā)霉稻草中的AFB1。ROOHOLLA等[29]研究了乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)對黃曲霉菌生長的影響，發(fā)現(xiàn)在30 ℃下孵育7 d，酵母最低群體濃度為1.5×105CFU/mL時，乳酸克魯維酵母抑制了黃曲霉的生長，并使AF的總產(chǎn)量降低了97.9%，其中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2分別降解了97.8%、98.6%、98%和94%。WANG等[30]對白腐菌(Phanerochaetesordida)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該菌可去除86.0%的AFB1。與細(xì)菌降解相比較，大多數(shù)真菌存在降解AFB1時間長、操作繁瑣和降解率低的問題，大大限制了真菌在工業(yè)上的實(shí)際應(yīng)用。李冰等[31]利用黑曲霉(Aspergillusniger)降解AFB1，液相色譜法測定AFB1含量，結(jié)果表明在處理72 h后，黑曲霉對AFB1的降解率高達(dá)93.28%，其中在12 h時，降解率已達(dá)到63.48%，分離菌體細(xì)胞與胞外粗提液，分別測定降解能力，發(fā)現(xiàn)胞外粗提液AFB1降解能力最強(qiáng)(84.20%)，推測是由于黑曲霉細(xì)胞壁的吸附作用、胞內(nèi)物質(zhì)的降解作用共同去除AFB1。ZJALIC等[32]凍干不同的雜色云芝(Trametesversicolor)提取液，通過一系列步驟提取胞外多糖和糖蛋白，添加到寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)的液體培養(yǎng)基中，對寄生曲霉的菌絲生長和AF的產(chǎn)生進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中1株雜色云芝在9 d完全抑制了分生孢子的萌發(fā)和曲霉菌絲的生長，另外2株在3～6 d起抑制作用。

2.2 昆蟲對AFB1的降解作用

昆蟲作為一種營養(yǎng)豐富、高效、可持續(xù)的動物蛋白和熱量來源，越來越受到人們的關(guān)注。一些昆蟲由于其在特殊的自然環(huán)境下生長繁殖，能夠以受到霉菌毒素污染的營養(yǎng)食物為能源，因此在昆蟲進(jìn)化過程中已經(jīng)對霉菌毒素以及其他毒素產(chǎn)生了應(yīng)對能力。NIU等[33]發(fā)現(xiàn)臍橙螟對AFB1和赭霉毒素A具有極高的耐受性，推測其耐受性可能是由于昆蟲的解毒能力，產(chǎn)生了無毒的代謝產(chǎn)物。VAN-BROEKHOVEN等[34]發(fā)現(xiàn)未受污染飼糧處理的黃粉蟲幼蟲與受污染飼糧處理的黃粉蟲幼蟲體重增加無差異，且存活率都較高，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)分析了幼蟲和幼蟲糞便中霉菌毒素的存在情況，都未檢出受污染飼糧或受污染飼糧衍生物，說明霉菌毒素被幼蟲降解。NIERMANS等[35]發(fā)現(xiàn)玉米烯酮不會在黃粉蟲的幼蟲體內(nèi)積累，并且黃粉蟲能夠代謝和排泄霉菌毒素，其降解產(chǎn)物主要是玉米烯酮的偶聯(lián)物。CAMENZULI等[36]在黑蠅蟲和黑蠅幼蟲的飼料中添加AFB1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(fusarium oxysporum enol, DON)、赭霉毒素A(ochatoxin A, OTA)和玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)的混合物，其濃度分別為歐盟委員會規(guī)定的完全飼料最高濃度的1倍、10倍和25倍，所有霉菌毒素均未在幼蟲體內(nèi)積累，質(zhì)量平衡計(jì)算表明黑蠅蟲和黑蠅幼蟲對4種霉菌毒素有不同程度的代謝，其代謝物為黃曲霉毒醇，AFP1，AFQ1和AFM1，3-乙酰-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3-acetyl-DON), 15-乙酰-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(15-acetyl-DON)和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇-3-糖苷(DON-3-glycoside)，α-和β-玉米赤霉烯。BOSCH等[37]研究表明，用添加AFB1的家禽飼料喂養(yǎng)黑水虻幼蟲和黃粉蟲幼蟲，其飼料中AFB1含量分別為0.01、0.025、0.05、0.10、0.25和0.5 mg/kg，對黑水虻幼蟲和黃粉蟲幼蟲的存活率和體重沒有影響，結(jié)果表明黑水虻幼蟲和黃粉蟲幼蟲均具有較高的AFB1耐受性，且不積累AFB1。此外，黃粉蟲對惡劣的生活環(huán)境適應(yīng)性極強(qiáng)。YANG等[38-39]發(fā)現(xiàn)黃粉蟲能夠?qū)⒕郾揭蚁┧芰贤耆到獾V化為CO2或同化為蟲體脂肪，且以聚苯乙烯為食的黃粉蟲的存活率與對照組無明顯差別，首先黃粉蟲將聚苯乙烯咀嚼成小碎片，并攝入腸道，攝入的片段與腸道微生物區(qū)系混合，腸道微生物區(qū)系分泌細(xì)胞外酶，催化片段解聚成小分子產(chǎn)物，從黃粉蟲腸道篩選出1株能夠?qū)⒕郾揭蚁┧芰献鳛槲ㄒ坏纳L營養(yǎng)物質(zhì)的細(xì)菌，命名為微小桿菌YT2(ExiguobacteriumYT2)，該菌株被證實(shí)能夠降解聚苯乙烯，說明腸道菌群在黃粉蟲降解外源物質(zhì)的過程中發(fā)揮著重要的作用。

3 生物法降解AFB1的機(jī)制

AFB1結(jié)構(gòu)式中含有1個雙呋喃環(huán)和1個氧雜萘鄰?fù)?，有研究表明前者為發(fā)揮毒性作用的主要基團(tuán)，而后者主要與致癌性有關(guān)[40]。目前關(guān)于物理法和化學(xué)法對AFB1降解機(jī)理的研究報(bào)道較少，大多數(shù)報(bào)道只是利用液相與質(zhì)譜聯(lián)用測定AFB1降解產(chǎn)物分子式，二級質(zhì)譜對比庫或利用軟件推測降解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)式，根據(jù)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)分析出AFB1降解途徑[20,41-42]，而涉及生物降解AFB1機(jī)理的相關(guān)報(bào)道較多，主要包括酶降解AFB1、揮發(fā)性有機(jī)化合物對AFB1的影響、AFB1相關(guān)基因的表達(dá)等。

3.1 酶降解AFB1

酶作為AFB1降解機(jī)制研究中起催化作用的主要組成，在AFB1的生物法降解研究中占據(jù)了重要地位。WANG等[30]利用白腐菌YK-624(PhanerochaetesordidaYK-624)的錳過氧化物酶(manganese peroxidase，MnP)對AFB1進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)86%的AFB1被去除，通過UMU試驗(yàn)(DNA損傷物誘導(dǎo)應(yīng)急反應(yīng)表達(dá)umuC基因的能力)得知MnP顯著降低了AFB1的致突變活性，而20 nkat MnP處理AFB1即可使其誘變活性降低69.2%，如圖1所示，氫核磁共振譜(H-nuclear magnetic resonance spectroscopy，H-NMR)和高分辨率電噴霧質(zhì)譜(high-resolution electrosprayionization mass spectrometry，HR-ESI-MS)分析表明，AFB1首先被MnP氧化成AFB1-8,9-環(huán)氧化物，然后水解成AFB1-8,9-二氫二醇，這是首次報(bào)道MnP通過將AFB1轉(zhuǎn)化為AFB1-8,9-二氫二醇來有效去除AFB1的致突變活性。WAN等[20]在對地衣芽孢桿菌BL010(BacilluslicheniformisBL010)的研究中發(fā)現(xiàn)并證明了其無細(xì)胞提取物在AFB1的降解中起重要作用，利用生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn)了2個降解酶基因漆酶和幾丁質(zhì)酶基因(Lac010和Chia010)，對Lac010和Chia010中的保守位點(diǎn)和可變位點(diǎn)進(jìn)行多重序列比對，以確定在蛋白水平上的序列相似性，分析確定了這2種酶的二級結(jié)構(gòu)，為后續(xù)的同源性建模和功能預(yù)測提供了重要依據(jù)，對Lac010和Chia010構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明Chia010與地衣芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶的遺傳距離較短，Lac010與枯草芽孢桿菌亞種之間的遺傳距離較短。XU等[24]在對沙克氏桿菌L7(BacillusshackletoniiL7)的研究中發(fā)現(xiàn)，其上清液對AFB1的降解率高于活細(xì)胞和細(xì)胞提取物，在蛋白酶K(protease K)和十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)存在下，AFB1降解率有所下降，從煮沸上清液中純化出一種耐熱酶，稱為AF降解酶，這也是首次報(bào)道了從沙克氏桿菌中分離出的一種AF降解酶，它在食品和飼料加工中對AF的解毒具有潛在的應(yīng)用價值。SONG等[43]對M19型銅綠假單胞菌(PseudomonasaeruginosaM19)降解AF進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)分別添加蛋白酶K、SDS和加熱后，銅綠假單胞菌M19培養(yǎng)上清液的降解能力顯著降低，推測存在AF降解酶，采用硫酸銨分步沉淀、離子交換層析和凝膠過濾層析三步程序從假單胞菌中分離出AF降解酶，使其成為一種很有前景的AFB1生物降解候選物。XIE等[44]利用二乙氨基乙醇-瓊脂糖色譜法從泛生菌T6(Pantoeasp.T6)上清液中分里出一種胞外酶，命名為AF降解酶，用質(zhì)譜法鑒定為外膜蛋白A，這是首次報(bào)道泛生菌T6可以分泌外膜蛋白A出膜并降解AFB1。

圖1 錳過氧化物酶氧化AFB1的機(jī)理Fig.1 Proposed mechanism of AFB1 oxidation by MnP

3.2 揮發(fā)性有機(jī)化合物對AFB1的影響

文獻(xiàn)報(bào)道表明，揮發(fā)性有機(jī)化合物(volatile organic compounds, VOCs)對真菌病原菌具有顯著的抗真菌活性[45-48]。一些微生物通過揮發(fā)性有機(jī)化合物的釋放，如鏈霉菌和芽孢桿菌等，對植物病原菌顯示出巨大的潛在生物作用[49-53]。YANG等[54]研究了鏈霉菌TD-1(StreptomycesalboflavusTD-1)中揮發(fā)性有機(jī)化合物對黃曲霉的抑菌作用，利用2個面對面無蓋培養(yǎng)皿，將鏈霉菌TD-1置于下方，黃曲霉菌置于上方，結(jié)果發(fā)現(xiàn)揮發(fā)性有機(jī)化合物對黃曲霉菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)有較強(qiáng)的抑制作用，此前關(guān)于利用鏈霉菌揮發(fā)性有機(jī)化合物抑制黃曲霉的報(bào)道很少。LYU等[55]在對鏈霉菌3-10(Streptomycesyanglinensis3-10)的研究中也發(fā)現(xiàn)了可揮發(fā)性有機(jī)化合物在體外能抑制黃曲霉和寄生黃曲霉的菌絲生長、產(chǎn)孢、孢子萌發(fā)和AF生物合成基因的表達(dá)，通過掃描電鏡觀察表明，高劑量的可揮發(fā)性化合物可抑制2種曲霉菌在花生籽粒上的分生孢子萌發(fā)和定殖，采用固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對19種主要揮發(fā)性有機(jī)物進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)其中2-甲基異莰醇是主要揮發(fā)性成分，2-甲基丁酸甲酯、2-苯乙醇和β-石竹烯3種標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)物質(zhì)對黃曲霉和寄生曲霉均具有抗真菌活性，其中2-甲基丁酸甲酯對黃曲霉和寄生曲霉孢子萌發(fā)的抑制作用最強(qiáng)，這是2-甲基丁酸甲酯對黃曲霉和寄生曲霉抗真菌活性的首次報(bào)導(dǎo)。BOUKAEW等[56]采用同樣的方式在PDA平板上進(jìn)行抗真菌生物測定，結(jié)果表明鏈霉菌RL-1-178(StreptomycesphilanthiRL-1-178)對寄生曲霉TISTR 3276(AspergillusparasiticusTISTR 3276)和黃曲霉PSRDC-4(AspergillusflavusPSRDC-4)表現(xiàn)出抑制作用(圖2)，通過氣相-質(zhì)譜聯(lián)用檢測鑒定出39種化合物，其中含量最多的物質(zhì)是土臭(3.75%)，其次是41種L-芳樟醇(13.55%)，2-巰基乙醇(9.71%)和庚烷(5.96%)。土臭素，L-芳樟醇和2-巰基乙醇完全抑制了菌絲體的生長，庚烷的抑制作用僅為45.7%。在貯存的大豆種子上使用可揮發(fā)性化合物作為生物熏蒸劑，可以完全保護(hù)種子免受感染，并完全抑制AFB1、AFB2和AFG2的產(chǎn)生，這些發(fā)現(xiàn)表明，揮發(fā)性有機(jī)化合物可以用作生物熏蒸劑，以抑制貯存的種子中2種真菌的生長和AF的生成。由于揮發(fā)性有機(jī)化合物的特性，有關(guān)其降解AFB1的研究逐漸增多，可揮發(fā)性有機(jī)化合物將成為生物法降解AFB1的一大熱點(diǎn)。

a-鏈霉菌RL-1-178;b-單獨(dú)接種黃曲霉PSRDC-4；c-單獨(dú)接種寄生 曲霉TISTR 3276;d-共同接種黃曲霉PSRDC-4和鏈霉菌RL-1-178圖2 鏈霉菌RL-1-178對寄生曲霉TISTR 3276 黃曲霉PSRDC-4的抑制作用Fig.2 Inhibition of Streptomyces TL-1-178 on Aspergillus parasiticus TISTR 3276 and Aspergillus flavus PSRDC-4

3.3 AFB1生物合成基因的表達(dá)

生物法降解AFB1的研究深入到基因?qū)用?。ROOHOLLA等[29]將乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)與寄生霉菌共培養(yǎng)，采用實(shí)時PCR方法分析了乳酸克魯維酵母孵育48 h后β-actin和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子aflR mRNA的表達(dá)水平，β-actin結(jié)果表示寄生曲霉在乳酸克魯維酵母存在下表現(xiàn)出穩(wěn)定性，同時發(fā)現(xiàn)用1.5×105CFU/mL的乳酸克魯維酵母處理后，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子aflR基因表達(dá)明顯下降(P<0.05)，表明乳酸克魯維酵母能夠抑制黃曲霉菌生物合成基因的表達(dá)。YANG等[54]通過實(shí)時熒光定量PCR測定在揮發(fā)性有機(jī)化合物的影響下，AF生物合成的基因表達(dá)變化，結(jié)果顯示在鏈霉菌TD-1(StreptomycesalboflavusTD-1)的可揮發(fā)性有機(jī)化合物處理下，LaeA和vea表達(dá)較對照組下降5.46倍和29.50倍，2個關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子aflR和aflS分別下調(diào)了6.98倍和19.27倍，并且其他4個結(jié)構(gòu)基因aflD、aflM、aflP和aflQ在7.35～35.59倍下調(diào)，表明可揮發(fā)性有機(jī)化合物通過影響AF生物合成的相關(guān)基因表達(dá)，直接降低AF的產(chǎn)生。通過研究黃曲霉菌內(nèi)一系列合成AF基因的表達(dá)，揭示生物法降解AF的機(jī)理，為生物法的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)，為基因改造降解AF的菌株提供了新的思路。

4 展望

生物法由于其無污染、具有特異性高、溫和、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)成為近年來AF降解研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。微生物降解AF成為研究的主要方向，但是目前報(bào)道的絕大多數(shù)微生物脫毒菌種在實(shí)際應(yīng)用中存在如下兩方面的共性問題：(1)有部分微生物對AFB1起吸附作用，通過食物鏈循環(huán)進(jìn)入動物或人體，在體內(nèi)發(fā)生解吸附作用，從而使AFB1進(jìn)入動物或人體，造成傷害，此類微生物并沒有實(shí)現(xiàn)生物降解，無脫毒意義；(2)已報(bào)道的菌種對AF的脫毒時間一般都在72 h，脫毒時間較長，而且降解效率普遍較低，實(shí)踐意義和應(yīng)用價值不大。因此，需要尋找能夠高效降解AF的菌種，真正應(yīng)用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和食品安全領(lǐng)域。

目前，關(guān)于AF降解酶報(bào)道相對較少，大多數(shù)酶的降解率不高且用時長，導(dǎo)致毒素不能被完全降解[43-44]。因此，利用基因工程的手段對微生物菌種進(jìn)行篩選及改造，獲得降解酶在體外的高效表達(dá)，開發(fā)出能夠高效降解AF的生物菌種，進(jìn)而為實(shí)現(xiàn)農(nóng)作物資源的無毒化和高值化利用提供技術(shù)支持，為進(jìn)一步推進(jìn)我國食品與飼料安全奠定基礎(chǔ)。