李仲玄 程 強(qiáng) 姚蒙蒙 胡 聰 買爾哈巴·艾合買提 王曉冰 張日俊 斯大勇

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)飼料生物技術(shù)實驗室 動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京100193)

1 Nisin的概述

乳酸鏈球菌素——Nisin 從1980 年起被FDA 允許用作食品添加劑[1]。Nisin 最早發(fā)現(xiàn)于1928 年[2]，1947 年被命名為Nisin[3]，第一次商業(yè)化應(yīng)用是在1957 年，由Aplin & Barrett 出品，其產(chǎn)品被命名為Nisaplin。目前，已經(jīng)有超過60 個國家和地區(qū)批準(zhǔn)Nisin 作為一種純天然食品防腐劑和保鮮劑使用，被廣泛用于乳制品、肉制品、罐裝食品、酒精飲料、醬菜和巧克力中。Nisin 在1971 年由Gross 和Morrell 確定為含有34 個氨基酸的小分子肽，存在翻譯后修飾，一般帶有一個羊毛硫氨基酸，四個β-甲基羊毛硫氨基酸和一些不常見的氨基酸殘基如脫氫丙氨酸和脫氫酪氨酸。Nisin 通常帶有硫醚鍵形成的分子內(nèi)環(huán)，這種環(huán)狀結(jié)構(gòu)，是其破壞細(xì)胞膜完整性的一個重要的性質(zhì)，這種環(huán)狀結(jié)構(gòu)維持了肽的剛性，并保護(hù)它不受蛋白酶和熱降解的影響[4-5]。Nisin 對部分革蘭氏陽性菌如單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)和藤黃微球菌(Micrococcus luteus)等具有較強(qiáng)的抑制作用，其本身是一種無臭無色無味的低毒物質(zhì)[6-9]。一般認(rèn)為Nisin 對芽孢的殺滅作用大于對營養(yǎng)型微生物的殺滅作用，這是由于它具有抑菌作用而非殺菌作用[10]。

Nisin有多種不同的類型，A、Z、F、Q和U型等，Nisin Z 和A 的區(qū)別在于第27 位的氨基酸由組氨酸變?yōu)樘於０罚℉is 27 Asn），Nisin P 由Streptococcus suis 和Streptococcus gallolyticus subsp. pasteurianus產(chǎn)生[11-12]。Nisin F，由南非淡水鯰魚腸道分離的L. lactis F10 菌株的質(zhì)粒編碼，與Nisin A的不同在于第27和第30位氨基酸（His 27 Asn、Ile 30 Val）[13]。Nisin Q，從日本發(fā)現(xiàn)的L. lactis 61～14 中分離，與Nisin A 存在4 個氨基酸的差異，分別為His 27 Asn、Ile 30 Val、Ala 15 Val和Met 21 Leu[14]。Nisin U 和U2 從S. uberis 中分離得到。Nisin U 有9 個氨基酸與Nisin A 不同：Ile 4 Lys、Ala 15 Ile、Gly 18 Thr、Asn 20 Pro、Met 21 Leu、His 27 Gly、Ser 29 His、Ile 30 Phe 和His 31 Gly，并且缺少Nisin A C 端的三個氨基酸，除此之外Nisin U2 中還缺少了第一位的Ile[15]。Nisin D 是從人分離株唾液鏈球菌5M6c 中分離并鑒定的，與Nisin A 相比，Nisin D 的25 位氨基酸由甘氨酸取代（Thr 25 Gly）、28 位半胱氨酸被纈氨酸取代（Cys 28 Val）、29 位絲氨酸被組氨酸取代（Ser 29 His）[16]。上述不同類型的Nisin 中，Nisin A 是抑菌活性最高的一種，市面上常用的商品化Nisin—NisaplinTM是由2.5%的Nisin A、77.5%的NaCl 和脫脂奶粉(12%的蛋白質(zhì)和6%的碳水化合物)組成[17]。

2 Nisin的作用機(jī)理

Nisin 與細(xì)菌細(xì)胞膜上的陰離子脂質(zhì)相互作用，從而引起細(xì)胞膜的擾動達(dá)到抑制細(xì)菌的作用。由Nisin-陰離子脂質(zhì)相互作用形成的孔道會導(dǎo)致三磷酸腺苷(ATP)、氨基酸或重要離子梯度的崩潰而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[18-19]。通常認(rèn)為Nisin 與細(xì)胞膜的相互作用是通過兩種不同的機(jī)制發(fā)生的。第一種機(jī)制：在微摩爾濃度范圍內(nèi),Nisin 與膜上陰離子脂質(zhì)結(jié)合表現(xiàn)出低親和力滲透(性)；第二種機(jī)制：在納摩爾濃度范圍內(nèi),Nisin 與細(xì)胞膜上lipid II 相互作用，形成由4 個lipid II 分子和8 個Nisin 分子組成的孔道[20-21]，造成細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏。研究表明，lipid II 介導(dǎo)的孔隙復(fù)合物比沒有l(wèi)ipid II 時形成的復(fù)合物更加穩(wěn)定[21]。在抑制孢子的機(jī)制中，Nisin 與蛋白殘基中的巰基結(jié)合，這與抑制細(xì)菌營養(yǎng)體作用機(jī)制不同,在加熱時結(jié)合使用Nisin，能增強(qiáng)其抑制孢子的活性。因此，Nisin 可用于酸性食品和熱處理食品的添加劑[22]。

3 Nisin的應(yīng)用及研究進(jìn)展

Nisin在食品行業(yè)中的應(yīng)用歷史悠久，早期主要應(yīng)用于奶酪生產(chǎn)中，對Listeria monocytogenes 具有較強(qiáng)的抑制作用，與NaCl 混合使用或者在低pH值時均可增強(qiáng)其抑菌效果[23]。最近的研究表明Nisin A 能夠延長Galotyri奶酪的保質(zhì)期，在添加100 IU/g和200 IU/g的Nisin A時，奶酪的保質(zhì)期為18～19 d，而對照組（不添加Nisin）的保質(zhì)期則為14～15 d[24]。Nisin A 可有效抑制對高脂牛奶布丁中腐敗產(chǎn)孢細(xì)菌、Bacillus 和Paenibacillus，延長高脂牛奶布丁的保質(zhì)期[25]。在可生物降解聚合物羥丙基甲基纖維素、殼聚糖、酪蛋白酸鈉和聚乳酸中加入Nisin，使材料緩慢釋放Ni?sin，可長期維持材料的抗菌效果，可延長食品的貨架期[26]。

當(dāng)Nisin 在食品中使用時，它的活性受到許多因素的影響。Nisin 與食物基質(zhì)成分結(jié)合或相互作用會降低Nisin 的作用效率，如Nisin 與牛奶成分的相互作用將導(dǎo)致其功效大量喪失[27]。此外，游離形式的Nisin易被酶降解而失效[28-29]。細(xì)菌細(xì)胞壁上的正電荷通過影響Nisin 與細(xì)菌表面的靜電作用力從而影響Nisin的抑菌活性[30]。納米材料的使用，可以有效控制Nisin的釋放和傳遞，在一定程度上克服Nisin 應(yīng)用中這些問題[31]?？寡趸瘎?、抗菌素和防腐劑等具有不同分子和物理結(jié)構(gòu)的功能成分，通常被用作涂料或加入到某種形式的輸送系統(tǒng)中?；谶@一目的的納米技術(shù)的傳遞系統(tǒng)已有報道，包括納米脂質(zhì)體、納米乳液、納米顆粒和納米纖維等[32]。脂質(zhì)體是一種很有前途的給藥系統(tǒng)，因為它們體積小，具有疏水性、親水性和生物相容性[33]，并且用于脂囊泡形成的磷脂是天然雙分子層的主要成分[34]，脂質(zhì)體的缺點包括儲存時的不穩(wěn)定性和對外界因素如pH值、溫度和滲透壓變化的高度敏感性。將Nisin 摻入脂質(zhì)體的限制性因素是Nisin 會與脂質(zhì)體膜相互作用，從而導(dǎo)致脂質(zhì)體膜破裂[35]。另一個影響納米脂質(zhì)體應(yīng)用的因素之一是制備工藝：加熱法制備的納米脂質(zhì)體對細(xì)胞完全無毒，而傳統(tǒng)的揮發(fā)性溶劑法制備的納米脂質(zhì)體則具有明顯的細(xì)胞毒性[36]。使用超臨界二氧化碳反溶劑沉淀技術(shù)制備的緩釋Nisin和聚L-乳酸(L-lactide)的納米膠囊，可在長達(dá)45 d 的時間中抑制乳酸菌Lactobacillus.delbrueckii的生長，而未被包被的Nisin，其效果則只能持續(xù)大約4 d[37]。盡管包被Nisin 具有較長的應(yīng)用時長，但由于此法需要運(yùn)用超臨界二氧化碳，因此成本非常昂貴，如何在低成本的過程中建立Nisin 緩釋和供應(yīng)系統(tǒng)有待進(jìn)一步的研究。用吐溫20包被Nisin后在牛奶中有更好的抗李斯特菌活性，但由于蛋白質(zhì)和聚合物的溶解度不同，在脂質(zhì)體中使用有機(jī)溶劑系統(tǒng)進(jìn)行Nisin 包被受到限制，這可能會影響蛋白質(zhì)的親水/疏水性從而引起蛋白質(zhì)的改性[38]。Benech 等將氫化卵磷脂脂質(zhì)體中包被Nisin Z 用于Cheddar cheese 中，在奶酪6個月的成熟期內(nèi)，采用篩選平板檢測法未檢出L. innocua。檢測不同前體脂質(zhì)體，包括氫化磷脂酰膽堿、大豆磷脂酰膽堿、非特異性帶電磷脂，大豆基不飽和磷脂等對Nisin Z 的包被效果，主要考察指標(biāo)有脂肪酸組成、膽固醇含量和Nisin Z 的含量，結(jié)果表明氫化磷脂酰膽堿脂質(zhì)體的包被效率最高，培養(yǎng)基pH 值和Nisin 濃度對Nisin 的包被效率均有較大影響[39]。pH 值從3.6升高到6.6會降低氫化脂質(zhì)體的包被效率。此外，在奶酪中使用包被的Nisin 膠囊并未對發(fā)酵產(chǎn)生不利影響，并且包被膠囊在不同的溫度循環(huán)下是穩(wěn)定的[40]。Nisin Z 從脂質(zhì)體中穩(wěn)定釋放的能力在牛奶中最高，其次是磷酸鹽緩沖液、生理鹽水和乳清[41]。將Nisini 脂質(zhì)體作為添加劑的商業(yè)化使用，還需要進(jìn)一步的研究來優(yōu)化系統(tǒng)中的包被體系和被包被的Nisin的抗菌活性，以獲得更有效的傳遞系統(tǒng)。

此外，Nisin 在口腔醫(yī)學(xué)方面也具有較大的應(yīng)用前景，以Nisin 為基礎(chǔ)的漱口水在比格犬模型中進(jìn)行了評估，結(jié)果顯示該漱口水可以預(yù)防牙菌斑的形成和牙齦炎癥[42]，其在預(yù)防齲齒和根管治療方面也具有較好的效果，但在口腔醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用仍需要體內(nèi)研究的支持[43]。

在畜牧方面，Nisin被用作預(yù)防牛乳腺炎的藥物，通常在擠奶前和擠奶后的乳頭浸漬產(chǎn)品中使用[44]。

4 總結(jié)

Nisin 在全球市場上有較大的商業(yè)機(jī)會，與納米技術(shù)的結(jié)合有助于提高Nisin的使用效率。不同形式的納米系統(tǒng)，如納米脂質(zhì)體、納米顆粒、納米纖維和納米乳等與目標(biāo)細(xì)胞都具有較強(qiáng)的相互作用，提高了效率，降低了使用Nisin的成本和數(shù)量，具有較大的應(yīng)用前景。然而納米技術(shù)在添加劑使用中的安全性有待進(jìn)行進(jìn)一步的研究。