冀亞路，雷連成，馮 新，孫長江，韓文瑜,2*，顧敬敏*

（1.吉林大學動物醫(yī)學院，吉林 長春 130062；2.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚州 225000）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種常見的兼性致病菌，能夠引起人和動物多種疾病，包括皮膚膿腫、敗血癥、以及心內(nèi)膜炎、肺炎、乳腺炎和腦膜炎[1]，該菌也是引起奶牛乳腺炎的主要病原體之一[2]。長期以來，抗生素治療（如天然或合成青霉素）是治療乳腺炎的主要策略，但抗生素的殘留物對人類健康造成極大危害。因此，迫切需要尋找新的有效對抗乳腺炎病原體的抗菌藥物。

噬菌體是能夠感染和殺死細菌的病毒，它能夠特異性感染細菌，附著于宿主并通過內(nèi)部復制和裂解細菌將其殺死[3]。與抗生素不同，噬菌體不會破壞宿主的正常微生物菌群，從而防止了細菌的生態(tài)失調(diào)，否則可能導致繼發(fā)感染，因此利用噬菌體抑制細菌生長可能是抗生素的天然、無毒和有效的替代品[4]。有研究表明噬菌體顯示出對S. aureus 感染的局部和全身的殺菌活性，并且大大減輕由S. aureus 引起的炎癥[5]。此外，有研究表明S. aureus噬菌體K 對治療由S. aureus 引起的奶牛乳腺炎具有顯著功效[6]。依靠良好的生物學特性噬菌體有望成為控制S. aureus 感染的有效抗菌劑。

本研究利用牛源S. aureus SA.1545 從污水中分離得到一株烈性噬菌體，命名為VB-SavM-JYL02。該噬菌體表現(xiàn)出高效的裂解活性和寬宿主譜，基因組內(nèi)未發(fā)現(xiàn)與細菌毒力、抗生素抗性以及與溶原性相關的基因，這些特征均有利于該噬菌體被用作S. aureus 感染的治療或預防的候選藥物。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料本實驗所有菌株見表1[菌株名稱右上標“1”表示菌株分離于吉林大學第一醫(yī)院（長春，中國）；右上標“2”表示菌株來自美國典型菌種保藏庫；右上標“3”表示菌株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；右上標“4”表示實驗室保存菌株]。噬菌體宿主菌S. aureus SA.1545 分離于奶牛乳汁。胰蛋白酶大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）購自青島海博公司；0.22 μm 孔徑的Millipore 過濾器購自Millipore 公司（美國）；病毒基因組提取試劑盒購自Doraville 公司（美國）。

1.2 噬菌體的分離與純化收集污水樣本，并通過棉絨過濾。用過濾后的污水配置100 mL TSB 液體培養(yǎng)基，加入1 mL S. aureus SA.1545（OD600nm1），置于37 ℃搖床（165 r/min）過夜培養(yǎng)后通過空斑法[7]檢測噬菌體，利用雙層瓊脂平板法對出現(xiàn)空斑的培養(yǎng)液進行噬菌體的純化[8]，命名為噬菌體VB-SavMJVL02。將純化好的噬菌體擴增與甘油按照3:1 的比例混勻后放-80°C 保存。

1.3 噬菌體VB-SavM-JYL02的一般生物學特性測定

1.3.1 噬菌體VB-SavM-JYL02 電鏡觀察 將純化后的噬菌體利用800 mL TSB 液體培養(yǎng)基進行大量擴增后，4 ℃8 000 r/min 離心10 min 除去細菌和細菌碎片，收集上清液。將DNase I 和RNase A 以終濃度1 μg/L 加入上清液，室溫靜置30 min。隨后將聚乙二醇8 000 以終濃度0.1 μg/mL 加入上清液，冰上孵育2 h 以上，4 ℃以10 000 r/min離心20 min。噬菌體最終附著到離心管管壁上，棄掉上清液，用3 mL SM緩沖液重懸噬菌體，加入等體積的氯仿萃取，充分混合后用4 ℃離心機以4 000 r/min 離心20 min，重復萃取3次。將濃縮的噬菌體VB-SavM-JYL02 樣品采用磷鎢酸負染法染色后使用透射電子顯微鏡觀觀察形態(tài)。

1.3.2 噬菌體VB-SavM-JYL02 最佳感染復數(shù)（MOI）測定 將宿主菌SA.1545在TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD600nm=0.6），調(diào)整菌落數(shù)至1×108cfu/mL，分別按照MOI 0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10、100的比例加入不同量的噬菌體，37 ℃180 r/min 振蕩培養(yǎng)8 h。分別取其培養(yǎng)液，4 ℃10 000 r/min 離心2 min，過濾后10 倍倍比稀釋，通過雙層瓊脂平板法測定噬菌體滴度，以確定噬菌體最佳MOI，試驗重復3 次。

1.3.3 噬菌體VB-SavM-JYL02 的一步生長曲線測定

將S. aureus SA.1545 在TSB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD600nm=0.6），取1 mL 菌液離心后棄去上清液，用等體積新鮮的TSB 培養(yǎng)基重懸沉淀。以上述篩選的最佳MOI 加入噬菌體，使其在37°C 吸附10 min。將混合物4 ℃10 000 r/min離心15 min，隨后將沉淀物重新懸浮于5 mL 新鮮TSB 培養(yǎng)基中37 ℃180 r/min 振蕩培養(yǎng)70 min，每10 min 取100 μL 培養(yǎng)液，10 倍倍比稀釋后，通過雙層瓊脂平板法測定噬菌體滴度，繪制噬菌體生長曲線，試驗重復3 次。

1.3.4 噬菌體VB-SavM-JYL02 的宿主譜測定 通過空斑法和雙層瓊脂平板法測定噬菌體的宿主譜。觀察噬菌體在涂有菌液的固體培養(yǎng)基上是否產(chǎn)生空斑或噬菌斑，以確定該噬菌體對所測菌株是否有裂解活性。共選取50 株菌（包括4 株表皮葡萄球菌和46 株S.aureus）用于噬菌體VB-SavM-JYL02 的宿主譜測定。

1.4 噬菌體VB-SavM-JYL02 基因組測序及其同源性比對分析利用IlluminaHiSeq 2500 測序平臺對噬菌體VB-SavM-JYL02 進行全基因組測序；利用SOAPdenovo 軟件拼接噬菌體VB-SavM-JYL02 基因組序列對并其進行生物信息學分析；利用BLAST 和GeneMarkS 預測和分析噬菌體VB-SavM-JYL02 潛在的開放閱讀框（ORF）；利用CLC Main Workbench ver?sion 7.7.3 軟件制作噬菌體VB-SavM-JYL02 基因功能模塊圖譜；利用BLAST 比對與噬菌體VB-SavMJYL02 全基因組序列同源性較高的噬菌體，并利用Mauve 2.3.1 軟件對其比較分析。

2 結 果

2.1 噬菌體的分離和純化利用牛源S. aureus?SA.1545 從污水中分離出一株噬菌體，利用雙層平板法純化3 代后，獲得直徑大小為1 mm～2 mm，邊緣整齊透亮，無暈環(huán)透明圓斑樣噬菌斑（圖1）。表明該噬菌體具有較強的裂解活性，命名為噬菌體VB-SavM-JYL02。

圖1 噬菌體VB-SavM-JYL02 純化后在雙層板上產(chǎn)生的噬斑，直徑約1 mm～2 mmFig.1 The plaques produced by the phage VB-SavM-JYL02 on the double-layer plate after purification, about 1 mm-2 mm in diameter

2.2 噬菌體VB-SavM-JYL02 的生物學特性測定結果噬菌體VB-SavM-JYL02 濃縮后經(jīng)電鏡觀察可見該噬菌體頭部呈正二十面體，頭部直徑為85 nm～90 nm，尾部長約180 nm～190 nm，且尾部可收縮。噬菌體VB-SavM-JYL02 從形態(tài)學上分析屬于有尾病毒目，肌尾病毒科（圖2）。當MOI 為0.01 時，噬菌體VB-SavM-JYL02 的效價最高，約達到5.2×109pfu/mL（圖3）。一步生長曲線結果顯示噬菌體VB-SavMJYL02 具有較短的潛伏期，約為20 min，爆發(fā)期約為20 min，一個裂解周期約為40 min（圖4），表明噬菌體有很強的殺菌效率。

利用空斑法和雙層瓊脂平板法測定噬菌體VBSavM-JYL02 的宿主譜?？瞻叻ńY果顯示噬菌體VBSavM-JYL02 在所有50 株測試菌株的平板上均能產(chǎn)生空斑，雙層瓊脂平板法檢測結果顯示噬菌體VBSavM-JYL02 能在其中32 株菌（包括2 株表皮葡萄球菌和30 株S. aureus）的雙層瓊脂平板上產(chǎn)生噬菌斑，表明噬菌體能夠裂解其中32 株葡萄球菌，具有很寬的宿主譜，裂解率為64%（32/50）（表1）。

圖2 噬菌體VB-SavM-JYL02 的透射電鏡圖，比例尺代表100 nmFig.2 Transmission electron microscope image of phage VB-SavM-JYL02, scale bar represents 100 nm

圖3 噬菌體VB-SavM-JYL02 的最佳MOI 的測定Fig.3 Optimal multiplicity of infection (MOI) determination of phage VB-SavM-JYL02

圖4 噬菌體VB-SavM-JYL02 的一步生長曲線測定Fig.4 One-step growth curve determination of phage VB-SavM-JYL02

2.3 噬菌體VB-SavM-JYL02 基因組學分析經(jīng)測序及拼接后，噬菌體VB-SavM-JYL02 的完整基因組序列上傳至GenBank（MK250904.1）。噬菌體VBSavM-JYL02 的基因組屬于線性雙鏈DNA，全長141 384 bp，G+C 含量30.18%，共編碼218 個ORF。利用軟件制作噬菌體VB-SavM-JYL02 基因功能模塊圖譜（圖5）。每個箭頭代表編碼蛋白質(zhì)的ORF，箭頭的方向代表基因轉(zhuǎn)錄方向。大多數(shù)噬菌體基因是正向轉(zhuǎn)錄的（20～181 個ORF），其余均為逆向轉(zhuǎn)錄。將所有ORF 分為6 大類，包括核苷酸代謝和復制、宿主裂解、形態(tài)發(fā)生、DNA 包裝、病毒代謝相關及假定蛋白質(zhì)，在所有鑒定的ORF 中，該噬菌體與已知功能蛋白質(zhì)具有高度相似性的72 種基因產(chǎn)物暫時被賦予相應的功能，其中宿主裂解相關基因位于ORF13 和ORF14，末端酶大亞基位于ORF23。未發(fā)現(xiàn)與抗藥性、致病性或溶原性相關的基因序列，這有利于該噬菌體用于治療性藥物的研發(fā)。

表1 VB-SavM-JYL02 的宿主譜Table 1 Host rangeof VB-SavM-JYL02

圖5 噬菌體VB-SavM-JYL02 全基因組分析Fig.5 Whole genome analysis of phage VB-SavM-JYL02

經(jīng)BLAST 比對分析，噬菌體VB-SavM-JYL02 在基因組水平上與S. aureus 噬菌體VB-SavM-JYL01（MH159197.1）、vB_SauM_LM12（MG721208.1）、SA3（MF001365.1）、P108（KM216423.1）、phiIPLA-RODI（KP027446.1）、GH15（JQ686190.1）、qdsa002（KY77 9849.1）、JD007（JX878671.1）及S25-4（AB853331.1）具有高度同一性。利用Mauve 2.3.1軟件對其進行比對分析（圖6），序列相似性由不同顏色條柱的高度表示，其對應于基因組序列中該區(qū)域中的平均保守水平。噬菌體VB-SavM-JYL02與同源噬菌體的基因組共線性分析結果顯示，這10個S.aureus噬菌體存在及其相似的基因模塊排布順序，不同噬菌體保有其特異性序列，顯示出S.aureus噬菌體的基因組排布特征，表明噬菌體基因組存在種屬關聯(lián)性與個體特異性。

圖6 噬菌體VB-SavM-JYL02 與同源噬菌體基因組共線性分析Fig.6 Co-linear analysis of phage VB-SavM-JYL02 and homologous phages

3 討 論

噬菌體作為抗菌劑具有很大的潛力成為替代抗生素候選物。噬菌體療法已經(jīng)在動物感染模型的治療試驗中獲得了一定的成功，可能成為治療牛乳腺炎的一種有效的替代療法。因此，篩選安全性高，殺菌活性強的牛源S. aureus 噬菌體尤為重要。

本研究利用牛源S. aureus SA.1545 從污水中分離得到一株新的噬菌體VB-SavM-JYL02，該噬菌體在體外表現(xiàn)出高效的裂解活性。噬菌體形態(tài)與已報道的S. aureus 噬菌體VB-SavM-JYL01、GH15、K 以及MSA6 相似[9-10]。其中噬菌體MSA6 是從患有乳腺炎的奶牛中分離出來，具有較寬的宿主譜，能夠裂解與牛乳腺炎相關的致病葡萄球菌以及與人類感染相關的耐抗生素S. aureus[9]。而噬菌體VB-SavM-JYL02同樣具有寬宿主譜（64%），同樣能夠裂解一些與人類感染相關的臨床致病菌株。全基因組比對結果顯示噬菌體VB-SavM-JYL02 與VB-SavM-JYL01 同源性為100%[11]，但是VB-SavM-JYL02 與VB-SavM-JYL01裂解譜卻有差異，兩者雖然都能在所測試的50 株葡萄球菌產(chǎn)生空斑，但VB-SavM-JYL02 能夠裂解葡萄球菌R066、R002、J2 和SL1，VB-SavM-JYL01 則不能裂解這4 株菌，而VB-SavM-JYL01 能夠裂解葡萄球 菌W074、 R027、 W4552、 R3790、 R3659 和R6199，VB-SavM-JYL02 則不能裂解這6 株葡萄球菌[11]，這可能與噬菌體基因組內(nèi)其他未表征的假定蛋白有關。此外，噬菌體VB-SavM-JYL02 與GH15和K 的同源性分別為99%和96%，但噬菌體VBSavM-JYL02 的宿主譜卻比GH15 和K 要寬很多，而尾絲蛋白氨基酸序列比對結果顯示噬菌體VBSavM-JYL02 與GH15 和K 的同源性都為92%，尾絲蛋白氨基酸序列的差異可能導致宿主譜的差異[12]。

總之，噬菌體VB-SavM-JYL02 具有高效裂解活性和寬宿主譜，以及基因組中不存在與細菌毒力、抗生素抗性以及溶原相關的基因，這些特點都有利于該噬菌體用于S. aureus 感染引起的奶牛乳腺炎及相關疾病的預防和治療。