路遠(yuǎn)，韋花媚，譚川，吳賢建，邵澤生，伍毅，許佐明，李文川，浦澗

1右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院·廣西肝膽疾病臨床研究中心,廣西百色533000;2右江民族醫(yī)學(xué)院

肝細(xì)胞癌(HCC)是世界上最常見的癌癥之一，是癌癥相關(guān)死亡的常見原因[1]。大部分HCC患者在就診時已處于晚期[2]。HCC主要與乙型肝炎或丙型肝炎病毒感染、飲酒或代謝綜合征有關(guān)[3]。當(dāng)機(jī)體對氧氣的需求超過其供應(yīng)時，全身或局部組織中的氧含量降低，稱為低氧。如果機(jī)體不能適應(yīng)低氧環(huán)境，會引起一系列病理生理反應(yīng)。低氧時，組織的代謝、功能、形態(tài)結(jié)構(gòu)都會發(fā)生變化，過度低氧將導(dǎo)致機(jī)體功能出現(xiàn)衰竭，神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等均會遭受不同程度的損傷，甚至導(dǎo)致腦、心、肺等重要器官死亡。同時，低氧與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)[4]。腫瘤細(xì)胞新陳代謝旺盛，正常的組織供氧能力滿足不了細(xì)胞的需求，且腫瘤內(nèi)部新生血管紊亂，絕大部分實(shí)體瘤處于低氧環(huán)境[5]。低氧會誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞增殖、抑制凋亡、血管生成進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，對治療產(chǎn)生耐受性，進(jìn)而直接降低治療效果。據(jù)報道，腫瘤轉(zhuǎn)移導(dǎo)致了90%的腫瘤患者死亡[6]。人肝癌細(xì)胞株Huh-7、Hep3B對低氧尤為敏感，是研究低氧對腫瘤影響的理想細(xì)胞系。2018年4月～2019年4月，本研究建立低氧誘導(dǎo)的Huh-7、Hep3B細(xì)胞模型，采用基因芯片技術(shù)檢測細(xì)胞中差異表達(dá)的基因，并分析其功能。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細(xì)胞系Huh-7、Hep3B購于中國科學(xué)院干細(xì)胞庫。DMEM、胎牛血清購于Gibco；青霉素、鏈霉素購于諾維贊公司；TRIzol購于Invitrogen公司；氯仿、異丙醇、無水乙醇購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。Thermo NanoDrop 2000和Agilent 2100 Bioanalyzer購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司，Gene Chip Clariom S Array芯片購自上海吉凱基因科技有限公司，RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，掃描儀(GeneChip Scanner 3000)購自美國昂飛公司。

1.2 細(xì)胞低氧誘導(dǎo) 將Huh-7、Hep3B細(xì)胞用DMEM添加10%胎牛血清置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)至細(xì)胞融合度為70%時，隨機(jī)取部分細(xì)胞置于常氧條件(空氣、5% CO2)下培養(yǎng)，取部分細(xì)胞置于低氧條件(1% O2、5% CO2、94% N2)下培養(yǎng)，均培養(yǎng)20 h后收樣。

1.3 差異表達(dá)基因篩選 當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至密度為80%時，使用TRIzol法按照細(xì)胞總RNA提取試劑盒操作說明，提取細(xì)胞總RNA。用Thermo NanoDrop ND 2000紫外分光光度計檢測A260/A280值分別為2.04、2.01、2.07、1.97；用Agilent 2100 Bioanalyzer檢測RNA的質(zhì)量，RNA質(zhì)量符合芯片質(zhì)量要求。吸取First-Strand Master Mix 5 μL加入5 μL Total RNA/Poly-A Control Mixture 中，混勻，按照cDNA第一鏈程序孵育第一鏈，以第一鏈為模板進(jìn)行cDNA第二鏈的合成。將IVT master mix 30 μL加入二鏈合成產(chǎn)物中，混勻，合成標(biāo)記cRNA。同時完成cRNA生物素標(biāo)記。再將純化并定量的體外轉(zhuǎn)錄后的cRNA產(chǎn)物經(jīng)高溫高鹽處理化成35～200 bp片段。片段化的cDNA通過末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶使用Affymetrix公司專有的DNA標(biāo)記試劑共價連接至生物素。將片段化的cDNA與其他對照試劑混合，制備成雜交液，將雜交液注入芯片中，將芯片放入雜交爐，45 ℃ 60 r/s旋轉(zhuǎn)孵育16 h后取出芯片，加入洗脫液和染色液，在全自動的洗脫染色工作站(Fluidics station 400)中完成洗脫和染色。用掃描儀(GeneChip Scanner 3000)進(jìn)行芯片掃描，收取基因表達(dá)的熒光信號值，用內(nèi)參基因?qū)Λ@得的原始信號進(jìn)行均衡和校正。用Microarray suite software信號處理軟件對掃描的圖像進(jìn)行數(shù)字化處理，計算熒光信號的強(qiáng)度和比值。

1.4 差異表達(dá)基因的功能分析 樣品間差異統(tǒng)計使用錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)與log2Fold Change(log2FC)，篩選條件為錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05且|log2FC|>1。獲得差異表達(dá)基因后，分別使用Kolmogorov-Smirnov和KOBAS version 2.0對差異表達(dá)基因進(jìn)行基因本體論(GO)功能分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路分析。以Q-value≤0.05為閾值，滿足此條件的功能聚類分享(GO term)和信號通路(Pathway)定義為在差異基因中顯著富集的GO term和Pathway。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因的篩選結(jié)果 與常氧處理的細(xì)胞相比，急性低氧誘導(dǎo)的Huh-7細(xì)胞中差異表達(dá)≥1.5倍且FDR<0.05的基因共計392個，其中表達(dá)上調(diào)基因266個，表達(dá)下調(diào)基因126個；急性低氧誘導(dǎo)的Hep3B細(xì)胞中，低氧誘導(dǎo)差異表達(dá)≥1.5倍且FDR<0.05的基因共計2 260個，其中表達(dá)上調(diào)基因847個，表達(dá)下調(diào)基因1 413個。急性低氧誘導(dǎo)的Huh-7細(xì)胞與Hep3B細(xì)胞共同的差異表達(dá)基因共177個，表達(dá)上調(diào)的127個，表達(dá)下調(diào)的50個。

2.2 差異表達(dá)基因的GO功能 低氧誘導(dǎo)Huh-7細(xì)胞的差異表達(dá)基因GO功能分析：在生物學(xué)過程(BP)層面上主要介導(dǎo)小分子代謝、生物合成過程、細(xì)胞氧化應(yīng)激過程；在分子功能(MF)層面上主要富集于酶結(jié)合、金屬離子結(jié)合、激酶結(jié)合；在細(xì)胞組分層面上主要參與胞外間隙、細(xì)胞質(zhì)膜組成、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的調(diào)控。低氧誘導(dǎo)Hep3B細(xì)胞的差異表達(dá)基因GO功能分析：在BP層面上主要介導(dǎo)小分子代謝、含磷復(fù)合物代謝、細(xì)胞周期過程；在MF層面上主要富集于核糖核酸結(jié)合、酶結(jié)合、核苷酸結(jié)合；在細(xì)胞組分層面上主要參與線粒體組分、細(xì)胞骨架、微管構(gòu)成。

2.3 差異表達(dá)基因的KEGG功能 低氧誘導(dǎo)的人肝癌Huh-7細(xì)胞中共有2 052條差異表達(dá)基因比對到31條通路中。選取Q-Value從小到大排序前10的通路，分別為糖酵解途徑、MAPK通路、細(xì)胞周期、癌癥、類固醇合成、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、戊糖磷酸途徑、過氧化物增殖途徑、Toll樣受體通路。

低氧誘導(dǎo)的人肝癌Hep3B細(xì)胞中共有3 070條差異表達(dá)基因比對到31條通路中。選取Q-Value從小到大排序前10的通路，分別為細(xì)胞周期、亨廷頓舞蹈病、阿爾茨海默病、p53信號通路、氧化磷酸化作用、癌癥、氨基酸降解、MAPK通絡(luò)、帕金森病通路。

從Huh-7細(xì)胞與Hep3B細(xì)胞共同的差異表達(dá)基因中選擇表達(dá)變化最大的5個基因TXNIP、ATF3、SLC6A8、TIPARP、PFKFB4，進(jìn)行信息查詢，結(jié)果顯示TXNIP、ATF3、PFKFB4均與肝癌發(fā)生相關(guān)。TCGA數(shù)據(jù)分析顯示，SLC6A8基因在肝癌組織中表達(dá)升高。

3 討論

目前，關(guān)于癌癥(肝癌、肺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌等)的轉(zhuǎn)錄組測序及其差異基因表達(dá)已有諸多報道[7，8]。通過轉(zhuǎn)錄組測序篩選出的差異表達(dá)基因，可能在癌癥進(jìn)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并可作為癌癥潛在的生物標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)。

健康的組織可通過自我穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)來實(shí)現(xiàn)氧濃度的平衡，使組織內(nèi)氧濃度維持在2.5%～9%[9]。當(dāng)組織發(fā)生病變或炎癥反應(yīng)時，由于細(xì)菌和病原體代謝增強(qiáng)、血管損壞、炎癥細(xì)胞浸潤，大量消耗組織內(nèi)的氧，使得組織含氧量低于1%，產(chǎn)生了低氧狀態(tài)。低氧是重要的腫瘤微環(huán)境，惡性腫瘤組織內(nèi)異常血管生成、血管灌注減少及腫瘤細(xì)胞無限制的生長，導(dǎo)致微環(huán)境中氧含量降低，這一現(xiàn)象在實(shí)體腫瘤中普遍存在。在低氧微環(huán)境中腫瘤會發(fā)生一系列的生物學(xué)變化，引起能量效率與控制細(xì)胞增殖的關(guān)系失調(diào)，從而促進(jìn)腫瘤的快速生長[10]。而目前關(guān)于低氧對癌癥基因表達(dá)的影響鮮有報道。為了揭示低氧對癌細(xì)胞基因表達(dá)的影響，本研究采用對低氧敏感的人肝癌細(xì)胞Huh-7、Hep3B探討低氧誘導(dǎo)對癌細(xì)胞的影響，獲得了不同數(shù)據(jù)庫的測序數(shù)據(jù)，同時篩選相關(guān)差異表達(dá)基因。本研究中Huh-7、Hep3B細(xì)胞經(jīng)低氧處理后，用基因芯片篩選得到多個差異表達(dá)的基因。這些表達(dá)差異的基因可能參與了低氧環(huán)境下肝癌的發(fā)生發(fā)展。

研究表明，低氧微環(huán)境主要受低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)調(diào)控，而HIF-1α在多種癌癥中高表達(dá)，參與癌細(xì)胞的生長、遷移、血管生成和細(xì)胞凋亡。HIF-1α能促進(jìn)也能抑制細(xì)胞增殖[11]，同時有研究發(fā)現(xiàn)，低氧抑制成骨細(xì)胞增殖的同時也促進(jìn)其凋亡[12]，而長期低氧則抑制牙周膜細(xì)胞增殖[13]。低氧脅迫能改變斑馬魚和鰱魚心臟、肝臟等器官中的周期相關(guān)蛋白的表達(dá)；差異表達(dá)基因主要通過降低細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)-周期蛋白依賴性激酶復(fù)合物將細(xì)胞周期阻滯在G1/S和S/G2期[14]。低氧通過上調(diào)影響肝癌細(xì)胞周期的生長因子如CyclinD1、轉(zhuǎn)化生長因子、胰島素樣生長因子2的表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖分化，完成細(xì)胞周期進(jìn)程[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，KEGG通路富集顯示低氧誘導(dǎo)Huh-7、Hep3B細(xì)胞中差異表達(dá)基因參與細(xì)胞周期的調(diào)控，這與以上研究結(jié)論一致。

低氧可激活許多復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)信號通路。在低氧環(huán)境下趨化因子、細(xì)胞因子和依附在G蛋白偶聯(lián)受體、酪氨酸激酶受體、Toll樣受體(TLR)的生長因子可激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B、核因子κB、絲裂原活化蛋白激酶信號通路。TLR是固有免疫中關(guān)鍵的模式識別受體，不僅介導(dǎo)了免疫系統(tǒng)的激活和細(xì)胞凋亡，與腫瘤的生長侵襲也密切相關(guān)[16]。腫瘤細(xì)胞上的部分TLR可通過炎癥反應(yīng)依賴或非依賴地促進(jìn)腫瘤生長，如TLR2和TLR4通過誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生形成腫瘤炎癥微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。TLR的激動劑已被證實(shí)具有強(qiáng)烈的抗腫瘤活性，可以刺激耐藥宿主細(xì)胞的免疫系統(tǒng)，進(jìn)而殺死或損傷腫瘤細(xì)胞[17]。MAPK信號通路調(diào)節(jié)CyclinD1和p27的表達(dá)，從而影響細(xì)胞周期G1至S期的進(jìn)程。MAPK信號通路還對許多轉(zhuǎn)錄因子(CREB、c-Fos、c-Jun、Elk-1)有調(diào)控作用，并通過調(diào)控下游轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化來發(fā)揮功能[1]。本研究發(fā)現(xiàn)，低氧誘導(dǎo)Huh-7細(xì)胞的差異基因富集在TLR信號通路，表明低氧可能在肝癌細(xì)胞中引起炎癥反應(yīng)。低氧誘導(dǎo)的Huh-7和Hep3B差異表達(dá)基因均涉及MAPK通路，這與低氧可引起細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)改變的結(jié)果相符。

60%的慢性和急性實(shí)體腫瘤中存在低氧現(xiàn)象[18]，因此低氧已經(jīng)成為侵襲性腫瘤的一種病理現(xiàn)象。癌細(xì)胞的平均含氧量低于4.4%，在某些聚焦區(qū)域可能為0[19]。這主要是由于供需之間的不平衡，腫瘤細(xì)胞異常快速增殖需要消耗大量氧氣，超過正常的組織供氧。低氧微環(huán)境的形成也可能是由于腫瘤細(xì)胞中血管網(wǎng)絡(luò)運(yùn)輸效率低或者血紅蛋白含氧量低造成的。持續(xù)的低氧會改變腫瘤的幾何形狀，獲得上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的表型，從而增強(qiáng)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力，助其擴(kuò)散至身體的其他部位，促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展。此外，氧氣供應(yīng)不足會改變癌細(xì)胞的新陳代謝，并導(dǎo)致腫瘤的表型多樣性。低氧還可以限制治療藥物灌注，從而導(dǎo)致腫瘤化學(xué)、生物、放射和熱治療的耐受性[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，低氧誘導(dǎo)Huh-7和Hep3B細(xì)胞表達(dá)變化顯著的基因TXNIP、ATF3、PFKFB4均與肝癌發(fā)生相關(guān)。證實(shí)低氧與癌癥的發(fā)展密切相關(guān)。

本研究僅選擇兩株肝癌細(xì)胞進(jìn)行低氧誘導(dǎo)，篩選差異表達(dá)基因，將來應(yīng)采用更多的肝癌細(xì)胞對該結(jié)論進(jìn)行驗(yàn)證。另外本研究僅從細(xì)胞層面探討低氧對腫瘤發(fā)生的作用，研究比較局限，應(yīng)進(jìn)一步從動物實(shí)驗(yàn)及臨床進(jìn)行探討。