趙芳，馬德勇，王婷婷，張巖，董穎，趙健

宮頸癌是嚴重危害婦女健康的第二大惡性腫瘤，病死率僅次于乳腺癌，已經成為全球性的公共衛(wèi)生問題[1]。若要達到2030年全世界范圍內消除宮頸癌的目標，宮頸癌篩查仍然是目前我國宮頸癌診治工作的基礎。非典型鱗狀細胞(atypical squamous cells，ASC)在巴氏(TBS)診斷系統(tǒng)判讀結果中比例占第二，常規(guī)的分流方法對高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)檢測存在特異度、陽性預測值偏低的局限性。因此臨床亟待尋找新的技術手段或新的生物學標志物實現(xiàn)ASC風險分層管理。p16抑癌基因蛋白表達作為早期宮頸癌的生物學標志物，因其具有較高的敏感度和特異度而備受關注[2]。但研究多集中在對活檢組織學標本進行p16檢測，盡管標本常規(guī)病理診斷是“金標準”，但需完成篩查轉診陰道鏡下有創(chuàng)操作才能取到標本，不能作為宮頸癌篩查手段。本研究對ASC宮頸癌篩查液基薄層細胞學檢查剩余標本進行p16免疫組化染色檢測，并與陰道鏡活檢組織病理p16免疫組化結果對比，探討液基薄層細胞學p16對ASC人群分流的應用價值，以有效分流管理ASC，提高子宮頸癌前病變檢出率，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月—2019年10月于北京大學第一醫(yī)院婦產科就診的ASC患者109例，均經宮頸細胞學檢查確診，年齡21～68(38.57±9.74)歲。排除早孕、哺乳期、HPV治療史、宮頸病變或宮頸癌手術史、放化療史患者。所有患者進行標本刷宮頸脫落細胞采樣、液基薄層細胞學p16檢測和HR-HPV檢測。全部患者72 h內無性生活、陰道上藥、陰道檢查和手術操作史。脫落細胞學采用2014年新修訂的TBS報告方式進行判讀獲得ASC有效分析[3]。ASC又分為不明確意義的不典型鱗狀細胞(ASC-US)74例，不能除外上皮內高度病變(ASC-H)35例。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準,患者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 HR-HPV檢查 采用HC-Ⅱ檢測系統(tǒng)(美國DIGENE公司生產)對宮頸脫落細胞進行HR-HPV DNA檢測，高危型別包括18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68型，嚴格按試劑盒要求步驟依次完成。以檢測結果HR-HPV≥1.0 pg/ml判讀為HR-HPV陽性。

1.3 液基薄層細胞p16檢測 收集109例ASC患者液基薄層細胞檢測剩余標本，采用廣州江元醫(yī)療科技有限公司生產提供的全自動免疫細胞獨立溫控單獨滴染染色機(JY-6000)和配套的p16抗體檢測試劑盒(免疫細胞化學法),嚴格按試劑盒要求步驟依次完成。普通光學顯微鏡下，以上皮細胞胞漿(或伴胞核)染為黃色為陽性,上皮細胞胞漿及胞核未見黃色為陰性，見圖1。所有標本均由同一名經驗豐富的細胞學診斷醫(yī)師閱片診斷。

p16陽性 p16陰性

1.4 陰道鏡取材與組織學檢查 液基薄層細胞學結果為ASC-US且HR-HPV陽性，或液基薄層細胞學結果為ASC-H及以上的患者轉診陰道鏡，由陰道鏡專職醫(yī)師依據陰道鏡操作規(guī)范進行檢查。陰道鏡檢查發(fā)現(xiàn)宮頸可疑病變部位取活檢，未發(fā)現(xiàn)病變需在血液循環(huán)豐富的區(qū)域取活檢包括頸管內膜診刮(ECC)，并進行組織病理學檢測。病理組織學閱片由2位專門的病理專家完成。分為慢性宮頸炎、低級別鱗狀上皮內病變(LSIL，包括HPV相關改變和CIN Ⅰ級)、高級別鱗狀上皮內病變(HSIL，包括CINⅡ和CINⅢ級和宮頸癌)。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學處理。計數資料用頻數或率(%)表示，比較采用χ2檢驗。采用受試者工作特征(ROC)曲線分析法，繪制ROC曲線并計算曲線下面積(AUC)檢驗2種方法對高級別病變的檢驗效能，分析兩者臨床診斷價值。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 ASC-US和ASC-H中p16在組織病理結果中分布情況 在液基薄層細胞學判讀為ASC-US的74例標本中，p16染色陽性37例(50.00%)。組織病理診斷結果為炎性反應或正常組中p16染色陽性率為38.18%，LSIL組為57.14%，而HSIL組陽性率100%。ASC-US患者中，組織病理結果HSIL組p16染色陽性率>LSIL組>炎性反應或正常組，p16陰性和陽性的病理結果分布差異有統(tǒng)計學意義(χ2=15.216，P=0.001)，見表1。

在液基薄層細胞學判讀為ASC-H的35例標本中，p16染色陽性結果33例(94.29%)。組織病理診斷結果為炎性反應或正常組p16染色陽性率為85.71%，LSIL組為75.00%，HSIL組為100%。ASC-H患者中，組織病理結果p16染色陽性率HSIL組>炎性反應或正常組>LSIL組，p16陰性和陽性的病理結果分布差異無統(tǒng)計學意義(χ2=5.171，P>0.05)，見表1。

表1 組織病理學結果不同類型患者的p16陽性分布 [例(%)]

2.2 ASC-US和ASC-H中HPV在組織病理結果中分布情況 在液基薄層細胞學判讀為ASC-US的74例標本中，HPV陽性44例(59.46%)；組織病理診斷結果為炎性反應或正常組HPV陽性率50.91%，LSIL組為57.14%，HSIL組為100%。ASC-US患者中，HPV陽性和陰性的病理結果分布差異有統(tǒng)計學意義(χ2=9.866，P=0.007)。ASC-H患者中，HPV陽性和陰性的病理結果分布差異無統(tǒng)計學意義(χ2=5.367，P=0.068)，見表2。

表2 組織病理結果不同類型患者的HPV陽性分布比較 [例(%)]

2.3 p16、HPV在 ASC-US中的診斷價值 在液基薄層細胞學判讀為ASC-US的74例標本中，p16、HPV的敏感度和陽性預測值均為100%，p16的特異度為59.68%，稍高于HPV的48.39%，p16的陰性預測值為59.68%，稍高于HPV的48.39%。p16的AUC為0.884，高于HPV的0.798，見圖2，說明p16檢驗準確性高于HPV，見表3。

圖2 p16、HPV識別高級別以上病變的ROC曲線

3 討 論

3.1 液基薄層細胞學p16檢測 大量的流行病學調查和研究證實，持續(xù)性HR-HPV感染是宮頸癌和癌前病變的必要因素[4]，腫瘤抑制基因p16與HPV等多因素導致的宮頸癌發(fā)生、發(fā)展及預后密切相關[5]。p16 基因為多腫瘤抑制基因，其表達的蛋白可直接參與調控細胞周期，通過抑制細胞增殖和分裂達到抑癌作用。正常細胞周期中表達的p16表現(xiàn)為抗增殖效應，因此在終末分化的上皮細胞中，正常水平下不能用免疫組化方法檢測到。但在HPV相關的癌前病變和癌變中，代表確立和維持惡性表型的必要因素E7癌蛋白整合到宿主基因組內，結合Rb蛋白使其失活，細胞持續(xù)增殖聚集形成腫瘤，相應p16出現(xiàn)了強烈的過度表達而被測得。因此p16被認為是HPV感染轉化的一個替代性標志物，用于在宮頸癌篩查中分流管理HR-HPV陽性的女性[6-7]。

p16檢測CINⅡ級和更嚴重病變的敏感度與HPV檢測相似，但特異度更高，可以顯著增加高級別病變的診斷準確率，并作為組織病理學醫(yī)生識別難以鑒別的LSIL和HISL的依據。p16陽性表達表示病毒存在，伴隨著宮頸組織由正常發(fā)展到低級別病變、高級別病變、直至浸潤癌的全過程，其陽性率逐漸增強，與CIN疾病具有顯著的一致性[8]，并且p16蛋白的高表達代表了病毒活動整合能力，檢測p16可以反映細胞惡變增殖能力，預示惡性腫瘤的侵襲性，初步推測宮頸癌的惡性程度[9]。

表3 p16、HPV在ASC-US中的診斷價值

3.2 液基薄層細胞p16、HR-HPV在ASC-US的應用價值 宮頸癌和癌前病變從組織類型分為鱗癌和腺癌，鱗癌來源于鱗狀上皮，占宮頸癌的80%～85%，識別鱗狀上皮病變有助于做到大部分宮頸癌的早期識別。ASC-US在子宮頸細胞學篩查結果中占5.2%～28%[10]，僅次于未見上皮內病變或惡性病變(NILM),在細胞學異常中占59.3%[11]。由于TCT的TBS系統(tǒng)分類法將標本質量作為報告的一部分，ASC-US的判讀多數是由于炎性反應刺激、制片技術差異、細胞數量少或細胞異常程度不足以診斷上皮病變等，干擾臨床病理學醫(yī)生而導致的排除性診斷。因此ASC-US的最終組織病理報告跨度很大，由正常的宮頸到早期浸潤癌都有可能，其中僅有約9.7%ASC-US患者組織學病理確診為高級別病變[12]。本研究中ASC-US 74例，病理組織證實HSIL者12例，占比16.22%。ASC-US處理不當，可以導致漏診或診療過度，為后續(xù)的不規(guī)范宮頸病變治療帶來隱患，因此更需要引起臨床高度關注[13-14]。

宮頸細胞學檢查為初篩手段，在宮頸癌早期篩查中發(fā)揮了十分重要的作用。但一致性差，漏診和誤診率高，尤其漏診容易發(fā)生在細胞學診斷為HSIL以下的標本和腺癌。而HR-HPV陽性僅證明處于感染狀態(tài)，對于大部分年輕女性可以在感染后的6～9個月通過表層宮頸細胞的自然脫落而清除掉HPV，成為暫時性的一過性感染。但目前HR-HPV檢測手段不能區(qū)分屬于一過性感染還是持續(xù)性感染，即使持續(xù)性感染也不一定就是宮頸癌前病變或宮頸癌，也不能明確宮頸癌的發(fā)展階段[12]。因此盡管HPV檢測具有較高的敏感度和陰性預測值，但特異度和陽性預測值較低[15]，而導致過度的治療和干預造成醫(yī)療資源浪費。

本研究中細胞學ASC-US的74例患者中，炎性反應性疾病或正常高危型HPV陽性率可達50.91%(28/55)，因此單純依靠HPV分流，會增加更多的陰道鏡轉診次數。迫切需要引入有效簡便用于分流的生物學標志物。本研究顯示，p16在正常宮頸鱗狀細胞中或炎性反應中僅有38.18%(21/55)表達，但在HSIL中100%表達。p16在一定程度上可以評估HR-HPV感染者發(fā)生高級別病變的可能性，以p16分流，雙陽性轉診陰道鏡檢查，必要時取活檢；單陽性可隨訪；雙陰性可常規(guī)篩查，且適當延長隨訪時間[16-17]。

3.3 液基薄層細胞p16、HR-HPV在ASC-H中的應用價值 細胞學ASC-H為細胞學形態(tài)的異常改變，具有HSIL某些細胞學的一些特征，但缺乏明確診斷HSIL的證據，被認為是特殊的可疑或不確定的HSIL。ASC-H的診斷特異度和一致性差，具有較高的誤診和漏診率，且發(fā)生CINⅡ級以上的風險高。本研究發(fā)現(xiàn)，細胞學ASC-H的35例標本中，24例組織學證實為CINⅡ級以上，占比68.57%，與相關文獻報道接近[10]。研究發(fā)現(xiàn)，細胞學表現(xiàn)為ASC-H，漏診為CINⅡ級以上的幾率高達63.4%，這一診斷本身也是對CINⅡ級以上漏診的獨立高危因素[18]，因此對細胞學ASC-H的病例需更加關注，應直接轉診陰道鏡，根據陰道鏡檢查結果選擇不同的隨訪方式。ASC-H的HR-HPV感染陽性率更高，因此采用HR-HPV分流沒有更好的證據支持。本研究發(fā)現(xiàn)，在ASC-H患者中p16在正常宮頸鱗狀細胞中或炎性反應中有85.71%(6/7)表達，在HSIL中仍是100%表達，考慮是因為ASC-H中炎性反應和正常的人數較少僅7例，導致差異無統(tǒng)計學意義，但HSIL中p16表達比率100%，可見p16作為ASC-H的分流同樣有較高的特異度?？梢宰鳛锳SC-H的輔助檢查手段，能減少漏診高級別子宮頸病變的風險并指導后續(xù)的隨訪監(jiān)測。

3.4 液基薄層細胞學p16彌補TCT的不足 TCT和p16由同一病理醫(yī)師閱片，對于p16陽性，即使細胞學未見異常，病理醫(yī)師會有較高的警覺性進行重復仔細閱片以免漏診，尤其對于HSIL和腺上皮病變。此外陰道鏡檢查時，對細胞學HSIL、ASC-H、AGC且p16陽性者，應增加血管豐富的部位活檢率和頸管診刮率。由于p16結果判讀基于顏色的區(qū)別，相比TCT對細胞形態(tài)學的判讀更為簡單，易于實現(xiàn)數字化自動閱片，節(jié)省細胞學篩查的時間，增加結果的重復性和準確性。因此敏感度高的p16檢測可一定程度彌補TCT的不足。

總之，液基薄層細胞學p16對CINⅡ級以上病變具有良好的敏感度和特異度，敏感度與HR-HPV相似且特異度更好，其表達與宮頸病變級別顯著一致，有望成為ASC-US和ASC-H的有效分流方法，避免不必要過度的陰道鏡轉診活檢而破壞宮頸完整性。待今后擴大樣本量進一步探討液基薄層細胞p16在宮頸病變診斷和疾病治療檢測的價值。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

趙芳、馬德勇：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；王婷婷:進行統(tǒng)計學分析；張巖、董穎、趙健:提出研究思路，分析試驗數據，論文審核