尹繼紅，王曉峰，王茹

白山市中心醫(yī)院，吉林白山 134300

支氣管哮喘是多種炎性細胞(肥大細胞、T細胞及嗜酸性粒細胞等)及細胞因子參與的慢性氣道炎癥，遺傳因素、環(huán)境因素等均參與哮喘的發(fā)生發(fā)展[1]。T細胞介導(dǎo)的免疫紊亂在過敏性疾病和哮喘發(fā)病中發(fā)揮重要作用，其中Th1型細胞可產(chǎn)生干擾素γ(IFN-γ)，而Th2型細胞能分泌白細胞介素4(IL-4)，當(dāng)機體處于超敏狀態(tài)時，T細胞功能失調(diào)，主要是Th2細胞功能亢進，導(dǎo)致患兒發(fā)生IgE型速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，IgE誘導(dǎo)肥大細胞及嗜酸性粒細胞脫顆粒，進而釋放炎性介質(zhì)，導(dǎo)致氣道高反應(yīng)[2]。近年來越來越多的證據(jù)表明，共刺激分子在調(diào)節(jié)性T細胞增殖、活化及免疫等方面發(fā)揮重要調(diào)控作用，T淋巴細胞表面的細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)蛋白4(CTLA-4)能與樹突狀細胞等抗原呈遞細胞表面上的B7分子結(jié)合，在調(diào)控Th1與Th2細胞分化及免疫反應(yīng)程度等方面發(fā)揮重要作用[3,4]。CTLA-4又稱CD152，該基因是免疫球蛋白超家族成員，包含一個可變區(qū)結(jié)構(gòu)域、一個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個細胞質(zhì)尾，研究表明，該基因的突變或單核苷酸多態(tài)性與糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病易感性有關(guān)[5,6]。2017年2月～2018年2月，我們通過檢測兒童血漿中CTLA-4基因 rs4553808基因單核苷酸多態(tài)性及IFN-γ、IL-4、IgE水平，分析CTLA-4基因多態(tài)性與兒童哮喘易感性及血漿IFN-γ、IL-4、IgE的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年2月～2018年2月于我院診治的112例哮喘患兒作為病例組，其中男65例、女47例，年齡2～12(6.1±2.3)歲。納入標準：①患兒哮喘的診斷均符合《兒童哮喘診斷標準》[7]；②患兒近期無呼吸系統(tǒng)感染、泌尿系統(tǒng)感染等感染性疾??；③患兒既往無嚴重心肝肺等疾病病史。排除標準：①近期無應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等藥物治療史；②合并其他免疫性疾??；③患兒家屬拒絕本研究。以同期于小兒外科擬行擇期手術(shù)的169例患兒作為對照組，其中男88例、女81例，年齡3～13(6.3±2.4)歲，患兒近期均無感染病史及過敏性疾病病史。兩組性別、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準通過。所有研究對象及監(jiān)護人知情同意。

1.2 CTLA-4基因 rs4553808單核苷酸多態(tài)性及血漿IFN-γ、IL-4、IgE水平檢測 取兩組晨起空腹靜脈血約4 mL，EDTA抗凝，2 mL全血用于提取DNA，2 mL 4 ℃ 2 000 r/min離心10 min分離血漿，離心半徑10 cm，檢測血漿IFN-γ、IL-4、IgE。采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)-限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)方法檢測CTLA-4基因 rs4553808單核苷酸多態(tài)性。應(yīng)用小劑量基因組DNA提取試劑盒(日本TaKaRa公司)提取外周血中DNA，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。應(yīng)用NaroDrop檢測DNA的濃度及純度，核酸電泳鑒定其完整性，置于-20 ℃冰箱保存。CTLA-4基因 rs4553808位點基因多態(tài)性檢測，正向引物5′-GGGCTATAATCACTGCTCACAGGA-3′：反向引物5′-CAGAAGAGAAAACAGTTTGGCAGC-3′?？偡磻?yīng)體系20 μL。擴增條件：94 ℃ 5 min、94 ℃ 30 s、62 ℃ 45 s、72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)。限制性內(nèi)切酶的酶切反應(yīng)：反應(yīng)體系包括PCR產(chǎn)物8 μL，核酸限制性內(nèi)切酶(EcoRⅠ)2 U，反應(yīng)緩沖液補足體系至10 μL。反應(yīng)條件:37 ℃ 水浴，共4 h。產(chǎn)物進行凝膠電泳，鑒定CTLA-4 rs4553808基因型。應(yīng)用ELISA法檢測兩組血漿IFN-γ、IL-4、IgE，實驗步驟嚴格按照ELISA試劑盒(英國abcam公司，貨號ab46025，ab215089， ab108650)說明書進行。

1.3 CTLA-4 rs4553808各基因型與哮喘并發(fā)癥的關(guān)系 觀察病例組哮喘急性期出現(xiàn)消化道反應(yīng)(如消化道出血、大便潛血陽性)、呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥(如縱隔或皮下氣腫、呼吸衰竭)、心血管系統(tǒng)并發(fā)癥(如心率失常)、泌尿系統(tǒng)并發(fā)癥(如腎炎)等發(fā)生情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗。采用比值比(OR)表示CTLA-4基因 rs4553808位點各基因型的哮喘易感性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組CTLA-4基因 rs4553808多態(tài)性分布比較及與哮喘易感性關(guān)系 病例組與對照組GG基因型比例分別為8.04%(9/112)、21.3%(36/169)，GA基因型比例分別為27.7%(31/112)、37.2%(63/169)，AA基因型比例分別為64.2%(72/112)、41.4%(70/169)，與對照組相比，病例組CTLA-4基因 rs4553808 AA基因型比例較高(χ2=14.089，P=0.000)，而GG基因型比例較低(χ2=8.814，P=0.003)，CTLA-4基因 rs4553808 AA基因型兒童支氣管哮喘的易感性增加(OR=4.114，95%CI3.339～4.452，P=0.000)，CTLA-4基因 rs4553808 GA基因型兒童支氣管哮喘的易感性增加(OR=1.472，95%CI：0.277～2.713，P=0.001)。病例組與對照組G等位基因頻率分別為21.9%(49/224)、39.9%(135/338)，A等位基因頻率分別為78.1%(175/224)、60.0%(203/338)與對照組相比，病例組CTLA-4基因 rs4553808 A等位基因頻率較高(χ2=19.155，P=0.000)，CTLA-4基因 rs4553808 A等位基因型兒童支氣管哮喘的易感性增加(OR=2.375，95%CI：1.796～2.993，P=0.000)。

2.2 病例組CTLA-4基因rs4553808位點各基因型與血漿IFN-γ、IL-4、IgE水平的關(guān)系 病例組GG基因型9例，血漿IFN-γ、IL-4、IgE水平分別為(22.33±4.99)ng/L、(27.45±6.91)ng/L、(34.65±7.26)×103U/L；GA基因型31例，血漿IFN-γ、IL-4、IgE水平分別為(27.67±5.23)ng/L、(35.82±7.11)ng/L、(41.44±7.89)×103U/L；AA基因型72例，血漿IFN-γ、IL-4、IgE水平分別為(35.76±6.51)ng/L、(44.20±8.21)ng/L、(49.27±8.25)×103U/L。CTLA-4基因 rs4553808 AA基因型哮喘患兒血漿IFN-γ、IL-4、IgE水平分別高于GG、GA基因型(t分別為5.961、6.116，5.858、4.938，5.071、4.475，P均為0.000)，GA基因型患兒血漿IFN-γ、IL-4、IgE水平高于GG基因型(t分別為2.722、3.127、2.310，P分別為0.010、0.003、0.026)。

2.3 CTLA-4基因 rs4553808各基因型與哮喘并發(fā)癥的關(guān)系 AA基因型、AG基因型及GG基因型消化道反應(yīng)發(fā)生例數(shù)分別為33、2、1例，與GG基因型相比，哮喘患兒CTLA-4基因 rs4553808 AA基因型并發(fā)消化道反應(yīng)發(fā)生率較高(χ2=3.960，P=0.046)；AA基因型、AG基因型及GG基因型出現(xiàn)縱隔或皮下氣腫分別為4、1、1例，出現(xiàn)呼吸衰竭分別為6、4、2例，出現(xiàn)心律失常分別為3、3、1例，出現(xiàn)腎炎分別為6、4、2例，出現(xiàn)心律失常分別為8、8、1例，各基因型在縱隔或皮下氣腫、呼吸衰竭、心率失常、腎炎等并發(fā)癥間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2分別為0.426、1.734、0.861、0.316，P分別為0.513、0.188、0.324、0.573)。

3 討論

哮喘是一種氣道異質(zhì)性疾病，涉及慢性炎癥、氣道功能下降和組織重塑等病理生理學(xué)過程。全球范圍內(nèi)，哮喘患病率為1%～18%，WHO估計全世界約有3億人受到影響，并預(yù)計到2025年將達到4億[8]。哮喘的發(fā)生發(fā)展取決于遺傳和環(huán)境因素間的復(fù)雜相互作用，環(huán)境因素如過敏原和呼吸道感染的病原微生物等，遺傳因素如遺傳易感性局部黏膜中免疫球蛋白E(IgE)的增加、Th2細胞功能狀態(tài)等[9]。CTLA-4基因位于人類染色體2q33，該位點還包含T淋巴細胞免疫調(diào)節(jié)的兩個重要基因：CD28和誘導(dǎo)型共刺激物(ICOS)。CTLA-4基因編碼的蛋白是一種表達于活化T細胞表面的糖蛋白受體，胞外段以二硫鍵結(jié)合形成同源性二聚體，二聚體表面有B7配體的結(jié)合位點，B7配體包括B7-1、B7-2和B7-3。CTLA-4結(jié)合配體后能通過阻斷CD28分子介導(dǎo)的T細胞激活發(fā)揮抑制T細胞活化的功能，參與正常機體免疫反應(yīng)的負向調(diào)控。研究表明，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病中均存在CTLA-4表達降低或功能失調(diào)的現(xiàn)象，可能是CTLA-4表達降低后自身免疫耐受功能喪失，自身抗體及淋巴細胞過度活化破壞機體正常細胞，導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生[10]。

本研究中，支氣管哮喘患兒CTLA-4基因 rs4553808 AA基因型比例較高，且A等位基因頻率較高，表明CTLA-4基因 rs4553808 A等位基因型與支氣管哮喘的遺傳易感性有關(guān)，CTLA-4基因 rs4553808 A基因型可能增加兒童支氣管哮喘的易感性，與以往研究報道一致[11]。原因可能是CTLA-4基因 rs4553808基因位點位于基因啟動子區(qū)上游約1 500 bp位置，而該區(qū)域含有很多潛在的順式作用元件，特別是增強子元件，這些元件主要位于基因5′端側(cè)翼的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)內(nèi)，能促進CTLA-4基因表達，而基因突變或基因單核苷酸多態(tài)性，如A>G均會導(dǎo)致CTLA-4蛋白功能活性下降或喪失，導(dǎo)致T細胞的過度激活，促進哮喘的發(fā)生[12]，但CTLA-4基因 rs4553808的基因位點功能有待進一步研究確認。此外，本研究中CTLA-4基因 rs4553808 AA基因型哮喘患兒血漿IFN-γ、IL-4、IgE水平分別高于GG、GA基因型，且GA基因型患兒血漿IFN-γ、IL-4、IgE水平高于GG基因型，其機制可能是CTLA-4基因 rs4553808 AA基因型增加了兒童支氣管哮喘的易感性，促進T細胞向Th1和Th2亞型分化，Th1亞型促進IFN-γ的表達，而Th2亞型在促進IL-4表達的同時，招募并活化B細胞產(chǎn)生IgE[13,14]。另一方面，IFN-γ水平升高又進一步促進CTLA-4基因表達。研究表明，IFN-γ能激活下游信號通路中轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)合到CTLA-4基因上游的啟動子區(qū)域，發(fā)揮促進CTLA-4基因表達的作用[15,16]，從而在IFN-γ和CTLA-4之間形成正反饋環(huán)路，促進哮喘的發(fā)展。本研究進一步分析CTLA-4基因 rs4553808各基因型與哮喘兒童并發(fā)癥的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，哮喘患兒CTLA-4基因 rs4553808 AA基因型并發(fā)消化道反應(yīng)的風(fēng)險較高，而與呼吸衰竭、心率失常、腎炎等并發(fā)癥無關(guān)，表明CTLA-4基因 rs4553808 AA基因型可能有助于預(yù)測消化道反應(yīng)的發(fā)生，其原因可能是哮喘發(fā)生時全身處于炎癥反應(yīng)的狀態(tài)，進而引起胃腸道功能紊亂，引起腹痛、嘔吐及腹瀉等臨床癥狀[17,12]。

綜上所述，CTLA-4基因 rs4553808 AA基因型及A等位基因增加哮喘患兒的易感性，CTLA-4基因 rs4553808 AA基因型與患兒血漿IFN-γ、IL-4、IgE水平有關(guān)。但本研究樣本例數(shù)較少，且僅研究單核苷酸多態(tài)中的一種功能性變異，支氣管哮喘發(fā)生發(fā)展的機制有待進一步深入研究。