張雨陽，金 一

（延邊大學農學院，吉林 延吉 133002）

繁殖性能是雌性動物重要的生產力因素。為了提高動物繁殖率，選取生產性狀優(yōu)良的個體進行卵母細胞體外培養(yǎng)技術是必然選擇。將卵泡內未成熟卵母細胞取出，在體外特殊條件下進行培養(yǎng)，獲得成熟卵子完成體外受精的過程稱為卵母細胞體外成熟。一般來說，為了更好地模擬卵母細胞體內成熟的環(huán)境并處理好各個成分之間的關系，必須要向培養(yǎng)體系中添加激素。激素是卵母細胞核成熟的最重要調節(jié)因子，特別是促性腺激素是哺乳動物體外培養(yǎng)核成熟的主要調節(jié)器。促性腺激素包括促甲狀腺激素（FSH）和促黃體素（LH），其在卵泡成熟過程中起重要作用，在體內調節(jié)卵泡的正常發(fā)育和誘導排卵，但在體外培養(yǎng)過程中仍有些機制尚不明確。本文主要綜述促性腺激素在卵母細胞體外培養(yǎng)中的作用和在減數分裂過程中的影響，為哺乳動物繁殖育種提供理論依據。

1 卵母細胞體外成熟技術

卵母細胞體外成熟技術的生物學定義是將未成熟的GⅤ期卵母細胞從竇卵泡中取出并在適當的培養(yǎng)體系中培養(yǎng), 使其可以在體外成熟到MⅡ期?，F階段關于體外成熟與體內成熟之間的研究成果顯示，體內成熟卵母細胞與體外成熟卵母細胞發(fā)育的胚胎形態(tài)動力學沒有顯著差異，表明體內成熟卵母細胞與體外成熟卵母細胞的胚胎發(fā)育潛能可能沒有差異[1]。體內和體外成熟卵母細胞的透明帶雙折射和減數分裂紡錘體差異不顯著[2]。此外，體內和體外成熟的卵母細胞顯示正常的卵漿，細胞器分布均勻[3]。線粒體形態(tài)在成熟條件之間表現出相似性。在體內和體外成熟的卵母細胞中，皮質顆粒通常分層成一排，大部分連續(xù)排列在卵漿下方。有人提出預先培養(yǎng)未成熟卵母細胞，使其保持在減數分裂停滯狀態(tài)，可以改善細胞質成熟，從而提高體外成熟卵母細胞的最終發(fā)育能力[4]。因此，研究促性腺激素在卵母細胞減數分裂過程中的作用，能為卵母細胞體外培養(yǎng)改善細胞質提高卵母發(fā)育能力提供理論依據。

2 促性腺激素在卵母細胞體外成熟過程中作用

2.1 促卵泡素

促卵泡素（FSH）是決定卵泡在培養(yǎng)中存活和生長的主要激素。FSH有利于促進卵母細胞的成熟和質量，導致更高的胚胎卵裂率和更低的妊娠損失率[5]。理論上，在卵泡或黃體階段開始時使用卵泡刺激素引發(fā)可以增強體內未成熟卵母細胞的卵泡發(fā)育和成熟能力[6]。卵母細胞存活率與激素添加量之間存在時間依賴性，培養(yǎng)后期向培養(yǎng)基中添加FSH 會導致活卵泡數量的減少。在體外培養(yǎng)過程中，卵泡存活率對培養(yǎng)基中FSH 濃度的依賴不明顯，但有實驗數據表明，卵泡生長在激素含量高的培養(yǎng)基中更強烈[7]。Kreeger 等在試驗結果表明，含FSH 10 和25 mU·mL-1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的卵泡直徑明顯大于含FSH 0 或5 mU·mL-1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的卵泡直徑，FSH 劑量的增加也增加了乳酸的積累，這表明激活了顆粒細胞代謝。然而，非常高劑量的FSH（50 mU·mL-1）導致卵泡存活率下降，因為代謝產物積累得太快[8]。研究證實，無論卵母細胞數量多少，隨著FSH 劑量的增加，活產率都顯著降低[9]。

2.2 促黃體生成素

促黃體生成素（LH）在卵泡成熟過程中起重要作用。LH 總是存在于體內通過獲得足以使卵泡成熟的濃度來刺激體內的卵泡生成[10]。LH 刺激卵泡細胞的雄激素合成[11]。LH 并沒有被認為是培養(yǎng)基的必要成分，但目前正在積極討論其對體外卵泡生長的影響的問題[12]。

LH 峰激活負責卵丘細胞外基質形成和穩(wěn)定的基因，即激活卵母細胞的竇狀卵泡壁區(qū)域。LH 峰導致卵丘細胞中表皮生長因子（EGF）家族基因（Areg、Ereg 和BTC）表達迅速增加。這些配體是完整的膜蛋白，通過胞外裂解從細胞表面釋放出來。然后這些配體與EGF 受體（EGFR）結合并激活受體。此外，這種結合導致絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）3 和MAPK1 的激活，也被分別稱為細胞外信號調節(jié)激酶1和2（ERK1/2）。ERK1/2可刺激卵母細胞成熟。然而，EGF網絡和ERK1/2在排卵調節(jié)、卵母細胞成熟和進一步卵泡黃素化中的具體作用還不夠清楚[13-14]。

LH 對卵泡體外成熟影響的研究表明，在添加LH的培養(yǎng)基中，卵泡存活率明顯高于不添加LH的培養(yǎng)基。在低劑量LH 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的卵泡比在高LH 濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的卵泡直徑更大[15]。當LH 濃度＞5 U·L-1時，顆粒細胞增殖受到抑制，卵泡發(fā)生閉鎖或黃素化。此外，由于LHCGR mRNA的加速降解，高水平的LH 導致LHCGR 的產量和敏感性下降[16]。促性腺激素刺激引起孕激素受體發(fā)生變化，加速子宮內膜的成熟；高水平的FSH 或雌激素可能增加顆粒細胞對LH 的敏感性。這種變化使黃體生成素即使在低LH 水平下也能被誘導。黃體化導致子宮內膜的早期成熟[17]。

3 促性腺激素與卵母細胞減數分裂的關系

卵泡生長發(fā)育過程中，FSH 和LH 與顆粒細胞上的受體結合并激活環(huán)腺苷酸系統(tǒng)（cAMP），cAMP通過誘導卵母細胞pKa依賴性磷酸化細胞周期蛋白依賴性激酶1抑制減數分裂促進因子的活性而維持減數分裂停止[18]。FSH 誘導卵丘細胞擴散，暫時性抑制卵母細胞減數分裂，促進細胞質成熟，隨后LH 形成排卵峰，使顆粒細胞中cAMP 的含量上升，卵母細胞中cAMP 含量下降，減數分裂恢復，誘導卵母細胞成熟，卵丘細胞數量增加，卵泡破裂和黃體化[19]。一旦誘導卵母細胞成熟會產生一系列復雜的分子和結構事件，從減數分裂和生發(fā)泡破裂的恢復開始，最終在減數分裂的第2個中期阻止卵母細胞。

LH在體內成熟過程中降低了顆粒細胞中NPPC和NPR2 的含量，繼而導致cGMP 水平下降，引起MPF 活化，恢復了減數分裂[20-21]。顆粒cGMP 濃度的降低促進cGMP 通過縫隙連接從卵母細胞和卵丘細胞向外顆粒細胞層擴散，使cGMP 濃度在卵泡內均勻降低[22-23]。卵內cGMP含量過低從而導致卵母細胞PDE3A活化、cAMP水解、PKA失活和MPF激活使卵母細胞減數分裂恢復[24]。但在體外培養(yǎng)的小鼠壁顆粒細胞中，LH 不能引起NPPCmRNA 和cGMP含量降低[25]。而FSH 在體外培養(yǎng)卵泡時能起到類似于LH在卵母細胞體內成熟中的作用，下調NPPC含量[26]。也有試驗表明，FSH主要通過E2 及其受體間接促進了顆粒細胞中NPPC 的表達發(fā)揮作用[27]。此外，FSH調節(jié)卵母細胞的翻譯是通過EGFR[28]。

FSH 和LH 相應的受體與相匹配的配子結合后通過顆粒細胞中的cAMP 通路轉導產生不一樣的結果。一種假設是FSH 受體、LH 受體與其他信號通路耦聯(lián)，導致產生不同結果，另一種假設是FSH和LH 刺激顆粒細胞時cAMP 的特性和傳播產生不同作用[29]。因此促性腺激素在cAMP 通路中對卵母細胞減數分裂的作用機制還需要深入研究。

4 小 結

卵母細胞體外培養(yǎng)是一項很有前途的技術，但目前還不能滿足當前生產實驗的需要。選擇獲得體外成熟卵母細胞所需的最佳卵泡培養(yǎng)條件需要一個復雜的方法，需要考慮細胞的機械和化學環(huán)境、新陳代謝和旁分泌相互作用[30-31]。為了獲得更多的成熟卵母細胞，需要用對卵泡正常生長和發(fā)育至關重要的因素（包括促性腺激素）進行研究。在大多數研究中，FSH 是在整個培養(yǎng)過程中添加到培養(yǎng)基中的，而具有LH 活性的藥物僅在培養(yǎng)結束時添加。在少數的幾項研究中，為了要保持卵泡的正常生長和發(fā)育，研究人員不僅在培養(yǎng)結束時向培養(yǎng)基中添加LH 以刺激排卵，還在非常早期階段添加了LH。因此，正確應用促性腺激素可以在體外模擬體內條件。研究促性腺激素對卵母細胞減數分裂停滯的維持作用對卵泡生長和發(fā)育的影響仍然是許多研究人員面臨的主要問題。