米瀾，賀曉花，牟永平

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特)

0 引言

胃癌是一種在我國的發(fā)病率和死亡率均處于前十的惡性腫瘤。胃癌的早期診斷對胃癌的診治以及預(yù)后起著至關(guān)重要的作用[1]。早期的胃癌診斷以影像學(xué)及病理活檢為主，影像學(xué)的成像技術(shù)存在不能用于實時監(jiān)測腫瘤以及處于輻射暴漏的環(huán)境等問題，病理活檢則是一種“侵入性”的診斷方法。相比之下，液體活檢越來越被認(rèn)為是胃癌診斷、治療及實時監(jiān)測的一種檢查手段，其“非侵入式”的檢測手段在一定程度上可以替代“侵入性”的傳統(tǒng)實體活檢。盡管有多的優(yōu)點，但也存在著一定的局限性或分析困難等問題。本文就液體活檢在胃癌診斷中應(yīng)用的優(yōu)勢以及某些局限性進行簡單闡述。

1 實體活檢對胃癌的診斷的分析

1.1 “實體活檢”概括

相關(guān)研究，[2-3]“實體活檢”是指利用腔鏡或者手術(shù)等方法從患者的病變處采取病變組織，最常使用的則是胃鏡取材。首先將胃鏡插入患者的胃內(nèi)，通過胃鏡觀察到病變后，用活檢鉗從病變處夾取小塊組織，然后將病變組織被送到病理科，經(jīng)過固定、脫水、?蠟、包埋、切片、染色等一系列步驟后制成了可以觀察的切片，由病理醫(yī)生在顯微鏡下進行診斷。判斷病變性質(zhì)。

1.2 “實體活檢”的優(yōu)勢

目前病理檢查在所有檢查方法中準(zhǔn)確率最高，被譽為診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”[4]。因此，胃活檢，作為一種依靠病理檢查的診斷手段，對于胃病的診斷具有很高的準(zhǔn)確性和權(quán)威性[5]。對其病變組織進行進一步的分析，有利于胃癌及時、準(zhǔn)確的診斷。胃癌的分型種類繁多，絕大多數(shù)都可以通過“實體活檢”的方法檢測并區(qū)分。

1.3 “實體活檢”局限性

“實體活檢”是一種創(chuàng)傷性的檢查，雖然現(xiàn)在普及了無痛的腔鏡技術(shù)，但仍然會對患者消化系統(tǒng)粘膜造成一些創(chuàng)傷，在一些重癥和老年患者中，腔鏡取樣仍是一種有創(chuàng)傷的檢測手段。

2 “液體活檢”與“精準(zhǔn)醫(yī)療”

1914 年，德國病理學(xué)家西奧多·博韋里 (Theodor Boveri)提出癌癥發(fā)生與遺傳有關(guān)，認(rèn)為染色體異常是癌癥發(fā)生重要原因[6]。2015 年，美國總統(tǒng)奧巴馬 “精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)”的計劃，他把癌癥列為“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)”中的重中之重，希望通過“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)”計劃來使我們接近治愈癌癥。精準(zhǔn)醫(yī)療和個性化醫(yī)療是基于生物標(biāo)志物的發(fā)展[7]。

3 “液體活檢”在胃癌中的診斷分析

3.1 “液體活檢”概括

19 世紀(jì)60 年代，托馬斯·阿什沃思在用顯微鏡進行研究時發(fā)現(xiàn)了CTCs 存在于我們的外周血中。自此，腫瘤細胞可以穿透血管壁進入血液的理論進入了大眾的視野[8]?！耙后w活檢”指通過分析體液成分，來判斷腫瘤的特性，包括基因突變情況，是一種能夠檢測出攜帶腫瘤的發(fā)展和進展信息的生物標(biāo)志物[9]。液體活檢包括循環(huán)腫瘤細胞(Circulating tumor cell，CTC)、 游 離DNA (Cell-free DNA， cfDNA)，、循 環(huán) 腫 瘤DNA(circulating tumor DNA， ctDNA)、外 泌 體(exosome)，、腫瘤血小板(tumor educated platelets， TEPs)等。他可以為腫瘤的早期診斷，病情發(fā)展以及治療療效提供一個信息，采用一個非侵入式的方法對腫瘤提供一個實時監(jiān)測。除了完整的腫瘤細胞外，這些細胞的遺傳物質(zhì)也存在于血液循環(huán)，以下將針對上文提到的“液體活檢”對胃癌診斷的研究進展進行簡要地闡述。

3.2 循環(huán)腫瘤細胞(Circulating tumor cell,CTC)對胃癌的診斷分析

3.2.1 循環(huán)腫瘤細胞(Circulating tumor cell,CTC)概述

1869 年，澳大利亞的Ashworth 首次發(fā)現(xiàn)CTC 存在于血液循環(huán)中，CTC 中極少數(shù)的細胞能夠在循環(huán)系統(tǒng)中存活下來并相互聚集，這就形成了循環(huán)腫瘤微栓子(circulating tumor microemboli，CTM)，其可以發(fā)展成轉(zhuǎn)移灶，這就造成了一些原發(fā)病還未有明顯侵襲的情況下就發(fā)生了遠處轉(zhuǎn)移[10]。部分CTC 可以發(fā)生上皮- 間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesen- chymal transition，EMT)，這是腫瘤轉(zhuǎn)移的一個重要驅(qū)動因素[11]。

CTC 在血液中的含量極微，因此很難估計在幾百萬個正常細胞中存在單獨的腫瘤細胞，人們現(xiàn)在尋找一種技術(shù)，以實現(xiàn)最大限度的CTC 富集，然后通過相應(yīng)技術(shù)來檢測血中的CTC 含量[12-13]。其中富集CTC 的方法包括陰性捕獲法和陽性捕獲法，檢測方法包括流式細胞檢測技術(shù)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (reverse transcription -polymerase chain reaction，RTPCR)等[14]，單一的檢測方法仍缺乏一致性，因此現(xiàn)在推崇幾種方法的聯(lián)合檢測。CTC 芯片檢測技術(shù)是一種高效且精密度和靈敏度均高于傳統(tǒng)方法的檢測方式，通過基因測序的技術(shù)，胃腫瘤的診治提供了精確的信息。

3.2.2 循環(huán)腫瘤細胞(Circulating tumor cell,CTC)在胃癌中的臨床研究

喬維洲等人[15]利用CellSearch 系統(tǒng)通過檢測胃癌患者外周血中的CTC 含量，研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌患者術(shù)后的24h 內(nèi)CTC 含量呈下降的趨勢；對于Ⅳ期的胃癌患者經(jīng)過一個療程的化療后CTC 含量呈明顯的下降趨勢；在發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的胃癌患者中，CTC 陽性患者相較于CTC 陰性的患者預(yù)后差。研究表明CTC 的含量與胃癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及治療效果均有相關(guān)性。

Cheng 和Abdallah Emne A 等[16-17]使 用CanPatrol 進 行了CTC 的分離、分類和臨床分析，研究發(fā)現(xiàn)，上皮細胞CTC 亞群的計數(shù)及其在總CTC 庫中的相對豐度與臨床療效高度相關(guān)。CTC 程序性細胞死亡配體1 (PD-L1)可以成功用于免疫治療。研究表明與傳統(tǒng)方法相比，監(jiān)測CTC 亞型對疾病狀態(tài)具有較高的敏感性，它在監(jiān)測預(yù)后和指導(dǎo)未來的個體化免疫治療方面具有潛在的臨床應(yīng)用價值。

房玉霞等[18]將胃癌患者分為對照組(利用腫瘤標(biāo)志物對胃癌進行診斷)和研究組(利用CTC 含量對胃癌患者進行診斷)，來比較兩種方法對胃癌的診斷率。研究表明，研究組診斷的靈敏性和特異性均高于對照組，這就提示了通過CTC 檢測胃癌發(fā)病具有較高的準(zhǔn)確率，縮短檢測時間，對胃癌的診斷具有重要意義。

3.2.3 循環(huán)腫瘤細胞(Circulating tumor cell,CTC)對胃癌檢測的優(yōu)勢和局限性

循環(huán)腫瘤細胞的我們通?？梢栽谘褐袡z測，是一種無創(chuàng)的檢測方式，能夠免除胃鏡活檢對患者造成的痛苦和傷害，有助于對胃癌腫瘤發(fā)展的實時監(jiān)測，有助于于胃癌腫瘤轉(zhuǎn)移患者的診斷、監(jiān)測術(shù)后患者以及腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移、評估抗胃癌藥物的敏感性與患者預(yù)后以及選擇個體化治療的策略[19]。在動物模型中，原位癌階段就已經(jīng)檢測出了CTC 的存在，因此CTC 可能成為一個早期癌癥診斷的有用工具[20]。

循環(huán)腫瘤細胞的檢測和分析比較困難，在幾百個白細胞中只存在單個數(shù)量的循環(huán)腫瘤細胞，目前的研究主要集中在尋找循環(huán)腫瘤細胞的特異性標(biāo)志物并提高檢測手段的敏感性和特異性[21]。

3.3 游離DNA (Cell-free DNA, cfDNA),和循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)對胃癌診斷的分析

3.3.1 游離DNA (Cell-free DNA, cfDNA),和循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)概述

1977 年ctDNA 首次被發(fā)現(xiàn)，近些年由于分子生物學(xué)和基因測序的發(fā)展，使其得到了更為廣泛的關(guān)注[22]。cfDNA 是細胞釋放到血液中的DNA 片段，ctDNA 是腫瘤細胞釋放到血液中的cfDNA。ctDNA 既可以是單鏈，也可以是雙鏈，存在于血清和血漿中，cfDNA 的來源已知的有三種：①腫瘤細胞②循環(huán)腫瘤細胞③調(diào)網(wǎng)或壞死的腫瘤細胞[23]。在健康個體中，凋亡細胞和cfDNA 幾乎完全清除，cfDNA 水平非常低，而在惡性腫瘤、慢性炎癥和細胞過度死亡的情況下，cfDNA 將會大片堆積。通常，我們收集全血之后離心去除細胞，然后使用試劑盒將ctDNA 提取出來，在檢測過程中最具有挑戰(zhàn)性是確定cfDNA 在癌癥中的特異性變異，目前先進的DNA 檢測技術(shù)已經(jīng)發(fā)展起來，變異的ctDNA 檢測主要依靠PCR 和下一代測序(NGS)技術(shù)為主，NGS 提供了個性化癌癥基因特征并有助于發(fā)展個性化醫(yī)療[24-25]。

3.3.2 循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)在胃癌中的臨床研究

Kim 等人[26]采用腫瘤特異性重排的方法監(jiān)測胃癌患者術(shù)后血液中的ctDNA，采用全基因組測序(WGS)的方法分析25 例胃癌的個體化癌癥特異性重組，并在術(shù)后12 個月進行ctDNA 監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)在19 個樣本中出現(xiàn)ctDNA 的存在，在檢測到ctDNA 陽性到胃癌復(fù)發(fā)的時間平均為4.05 個月，研究發(fā)現(xiàn)術(shù)后ctDNA 的存在與術(shù)后12 個月內(nèi)胃癌的復(fù)發(fā)呈顯著相關(guān)，提示術(shù)后ctDNA 監(jiān)測對胃癌患者腫瘤復(fù)發(fā)的臨床意義。

Normando Sávia Raquel Costa 等 人[27]做 了 一 項 分 析關(guān)于ctDNA 在進展期胃癌患者中的潛在作用。以每3 個月為時間單位，從每位患者身上獲取樣本(10 毫升總血液)，并同時進行CT 檢查，直到疾病進展或死亡，測定總游離DNA(cfDNA)，根據(jù)ALU DNA 序列的表達率和總游離DNA 濃度計算ctDNA 水平，結(jié)果表明晚期胃癌患者的cfDNA 濃度明顯高于正常對照組，在胃癌患者接受一個周期(3 個月)的化療后，ctDNA 降低的患者其無病生存期(DFS)的時間遠遠高于高水平ctDNA 的患者，所得出的結(jié)論是ctDNA 可能是一種特異性、非侵入性和經(jīng)濟有效的新生物標(biāo)志物。

Gao 等人[28]評估了30 例晚期胃癌患者的ctDNA 和原發(fā)腫瘤的突變譜，然后通過5 例患者的多次活檢對腫瘤突變進行了綜合分析，最后分析了70 例患者的ctDNA 和腫瘤配對組織中HER2 擴增的一致性。與單個腫瘤樣本相比，ctDNA的突變譜一致性較低，在配對的組織樣本中僅發(fā)現(xiàn)約50%的體細胞突變，但與多個活檢相比，ctDNA 的大多數(shù)突變也出現(xiàn)在配對的腫瘤組織中。ctDNA 與腫瘤組織的HER2 擴增高度一致，可能是一種替代組織擴增的方法。提示基于ctdna 的評估可以部分克服腫瘤異質(zhì)性，可能成為胃癌HER2 分析的潛在替代方法。

3.3.3 循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)對胃癌檢測的優(yōu)勢和局限性

以往研究顯示[29]，ctDNA 是胃癌早期診斷和檢測治療療效的良好指標(biāo)，早起的胃癌癥狀不明顯，影像學(xué)檢查難以發(fā)現(xiàn)病灶，胃鏡是一個有創(chuàng)傷性的檢查，不是應(yīng)用于所有的人群，ctDNA 檢驗克服了兩種檢查的不足之處，對胃癌診斷提到一個輔助的作用，并且可以反映腫瘤組織中的基因突變，闡明異質(zhì)基因的突變特變，提高癌癥診斷的特異性。

ctDNA 的檢測技術(shù)敏感性仍需要提高，這是當(dāng)前檢測的一個困難，并且檢測ctDNA 的方法并沒有達到標(biāo)準(zhǔn)化，檢測的成本比較昂貴等問題[30]。

3.4 外泌體(exosome)對胃癌診斷的分析

3.4.1 外泌體(exosome)概述

1983 年，外泌體在綿羊網(wǎng)織紅細胞中被首次發(fā)現(xiàn)[31]，他是一種小的(30-140nm) 膜結(jié)合顆粒，起源于大的多泡體(MVBs)通過融合釋放到細胞外環(huán)境，在多種疾病中它們是一種很有前途的生物標(biāo)志物[32]。在多種疾病中外泌體也可大量釋放生物體液，如血漿、尿液、唾液、腹水和支氣管肺泡灌洗液。許多細胞類型都可以釋放外泌體釋，如上皮細胞、造血細胞、神經(jīng)元細胞、成纖維細胞、脂肪細胞等和腫瘤細胞[33]。循環(huán)的miRNA 在一些惡性疾病中的變化具有信息性，但miRNA 易降解，所以循環(huán)中的miRNA 會被打包成各種囊泡，外泌體就是其中的一種，其對腫瘤具有調(diào)控性。理想的外泌體分離可以分離出大量的純化外泌體，對研究和檢測有重要的意義，如外泌體中的蛋白質(zhì)、DNA 和miRNA 的分析[34]。傳統(tǒng)的外泌體分離方法是基于一系列的離心步驟排除細胞和細胞碎片，這種方法是目前最經(jīng)濟的方法，但比較耗時。Urbanelli 等人[35]總結(jié)了其他一些外泌體的分離方法.是利用超濾和層析的方法進行分離，然后用聚合物沉淀的方法進行純化。每種方法都有優(yōu)缺點。與CTCs 和cfDNA 相比，使用腫瘤外泌體作為預(yù)后、治療指導(dǎo)的生物標(biāo)志物主要依賴于它的蛋白質(zhì)和miRNA 的表達譜。外泌體介導(dǎo)的生物活性長鏈非編碼RNA 作為一種新型的非侵襲性的腫瘤診斷生物標(biāo)志物，正受到越來越多的關(guān)注。

3.4.2 外泌體(exosome)在胃癌中的臨床研究

Ohzawa Hideyuki 等人[36]提取了胃癌腹膜轉(zhuǎn)移患者的腹膜液并進行了分離，分別從宏觀和微觀的角度進行了miRNA的表達分析。實驗發(fā)現(xiàn)，12 胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的樣本中有4 個miRNA(miR-21-5p、miR-92a-3p、miR-223-3p、miR-342-3p)顯著上調(diào)，其表達水平與腹膜癌指數(shù)呈正相關(guān)。而miR-29 家族均下調(diào)。，在24 例胃癌腹膜轉(zhuǎn)移患者，在胃切除術(shù)miR-29 表達量往往低于腹膜轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)患者的miR-29b-3p表達量(P=.012)。實驗表明，在腹膜液miRNA 的表達模式反映了腹腔腫瘤負荷，可能是一個有用的生物標(biāo)志物的治療點。

Cai 等人[37]對29 例健康人與63 例胃癌患者血清外泌體中Lnc RNA PCSK2-2:1 的表達進行了分析，利用受體工作特性曲線評價Exo-Lnc RNA PCSK2-2:1 作為胃癌輔助診斷標(biāo)記物的臨床價值。結(jié)果表示，與健康對照組相比，胃癌患者血清外泌體中Lnc RNA PCSK2-2:1 表達水平顯著下調(diào)(P=0.006)。Exo-Lnc RNA PCSK2-2:1 的表達水平與腫瘤大小(P=0.0441)、腫瘤分期(P=0.0061)、靜脈侵犯(P=0.0367)相關(guān)。Exo-Lnc RNA PCSK2-2:1 曲線下面積為0.896。其診斷的敏感性和特異性分別為84%和86.5%。數(shù)據(jù)表明，Exo-Lnc RNA PCSK2-2:1 可能在胃癌的發(fā)展中起著極其重要的作用，可以作為一個潛在的標(biāo)記用于胃癌的診斷。

Soeda Naruyoshi 等人[38]探討了外泌體包裹的miRNAs(ex-miRNAs)作為微創(chuàng)性生物標(biāo)志物在接受治療性手術(shù)的胃癌患者中的有效性。通過比較TNM II 期胃癌患者中腹膜復(fù)發(fā)(n=3)和術(shù)后未復(fù)發(fā)(n=3)的患者以及3 名健康志愿者的miRNA 芯片數(shù)據(jù)，選擇了具有復(fù)發(fā)特異性的ex-miRNA，為外泌體包裹miRNA-21 (ex-miR-21)和外泌體miR-92a (exmiR-92a)。利用另外129 例II 期和III 期GC 患者的血漿外泌體樣本，研究了ex-miR-21 和ex-miR-92a 作為生物標(biāo)志物的潛在價值。實驗結(jié)果表明，與健康對照組相比，GC 患者樣本中的Ex-miR-21 水平顯著升高，而ex-miR-92a 水平顯著降低。高miR-21 水平的II 期和III 期患者的總生存(OS)和腹膜無復(fù)發(fā)生存(PRFS)較低miR-21 水平的患者更差。低ex- 92a 水平的II 期和III 期患者的OS 和PRFS 明顯差于高ex- 92a 水平的患者。Cox 多因素分析顯示，ex-miR-21和ex-miR-92a 是II 期和III 期胃癌OS 和PRFS 的獨立預(yù)后因素。miR-21 和程序性細胞死亡蛋白4 mRNA 表達水平與miR-92a 和前列腺素E 受體4 mRNA 表達水平呈負相關(guān)。因此，ex-miR-21 和ex-miR-92a 可能作為預(yù)測II/III 期胃癌患者腹膜復(fù)發(fā)和預(yù)后的有效的微創(chuàng)性生物標(biāo)志物。

3.4.3 外泌體(exosome)對胃癌檢測的優(yōu)勢及局限性

外泌體通過協(xié)助篩選特異性基因來對胃癌患者起到一個早期診斷，早期治療以及疾病進程的檢測有很重要的意義，其結(jié)構(gòu)因為有囊泡的存在，所以能夠使遺傳物質(zhì)穩(wěn)定的存在其研究前景十分可觀。對于發(fā)現(xiàn)腫瘤治療的新靶點，可能具有重要的意義，有待于進一步的研究[39]。

當(dāng)今的技術(shù)對于外泌體的分離和提取仍需要進一步的標(biāo)準(zhǔn)化，這也是外泌體研究的瓶頸所在。

3.5 腫瘤血小板(tumor educated platelets, TEPs)對胃癌診斷的分析

3.5.1 腫瘤血小板(tumor educated platelets, TEPs)概述

2015 年，TEPs 由Best 新提出的一個概念[40]。血小板中含有豐富的RNA，在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤細胞可以通過不同的途徑影響血小板，從而影響到血小板中的RNA 和蛋白質(zhì)，使其形成腫瘤相關(guān)血小板，腫瘤細胞能夠使血小板中的RNA 發(fā)生特異性的剪接，從而形成的獨特的miRNA 表達譜，有利于胃癌的診斷，在未來有可能會成為胃癌的檢測標(biāo)志物[41]。提取方式首先要從全血中利用差速離心分離血小板，提取RNA，然后進行RNA 的擴增和測序。

3.5.2 腫瘤血小板(tumor educated platelets, TEPs)對胃癌檢測的優(yōu)勢和局限性

TEPs 較替他液體活檢相比，血小板的數(shù)量多，利于提取，在未來胃癌的診治以及治療檢測中可能起著重要的作用[41]。TEPs 是近幾年新興的一種研究方向，靈床關(guān)于此類的報道較少，在臨床的應(yīng)用也甚少，其技術(shù)有待發(fā)展。

4 小結(jié)

液體活檢在精準(zhǔn)醫(yī)療領(lǐng)域中扮演著十分重要的角色，因為它代表了一種無創(chuàng)性的癌癥治療策略，可以根據(jù)個人的特點實現(xiàn)個性化的診斷和治療。與常規(guī)影像學(xué)檢查及實體活檢相比，液體活檢更敏感和準(zhǔn)確，并提供了大量更多關(guān)于預(yù)后和治療方向的信息。這篇綜述了四種液體活檢方法的優(yōu)缺點以及最新臨床研究進展，其主要的問題是缺乏標(biāo)準(zhǔn)和方便的技術(shù)，這也是當(dāng)今液體活檢用于胃癌發(fā)展領(lǐng)域的一項挑戰(zhàn)。最后，雖然很多研究已被實施液體活檢具有臨床效用，但大多數(shù)是回顧性的研究，因此，需要更嚴(yán)格的研究來驗證液體活檢的巨大潛力。