牟宇，陳治軍，謝騰，向旭

(湖北民族大學(xué)荊門臨床醫(yī)學(xué)院，湖北 荊門)

1 CRL7Fbxw8 復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和功能

CRL7Fbxw8 復(fù)合物是cullining E3 泛素連接酶(CRL)家族的成員[1]。CRL7Fbxw8 包括cullin 7，WD40 重復(fù)序列，包含F(xiàn)-box 蛋白Fbxw8，適配器蛋白Skp1，以及環(huán)finger 蛋白R(shí)OC1[2]。

CRL7Fbxw8 具有兩個(gè)獨(dú)特的生化特性。首先，CUL7 是一種非典型的cullin 家族蛋白。CUL7 的主要功能是提供組織E3 CRL 復(fù)合物的分子支架。然而，人類CUL7 包含1698個(gè)氨基酸，其大小是規(guī)范的cullin 分子的兩倍多。如下所述，CUL7 似乎包含多個(gè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用域，從而為蛋白水解和非蛋白水解活性提供了一系列生化功能。其次，雖然CUL7 組裝了SCF/CRL1 類復(fù)合物，但它主要通過(guò)與Skp1-Fbxw8 相互作用而顯示出顯著的選擇性。自從對(duì)CRL7Fbxw8復(fù)合物的首次報(bào)道以來(lái)[2]，許多獨(dú)立的報(bào)告證實(shí)了CUL7-Fbxw8 的關(guān)聯(lián)[3-8]。但是當(dāng)前沒(méi)有高分辨率CUL7-Fbxw8 相互作用的結(jié)構(gòu)模型，以幫助理解選擇性的分子基礎(chǔ)。

3-M 是一種人類常染色體隱性生長(zhǎng)遲緩綜合征[9]。2005年，首次將cul7 生殖系突變與3-M 綜合征聯(lián)系起來(lái)[10]。自那時(shí)起，就證實(shí)并擴(kuò)展了這種聯(lián)系[11-12]。迄今為止，已有64個(gè)3-M 連鎖的cul7 突變被報(bào)道。這些突變跨越了整個(gè)CUL7編碼序列。許多突變可能通過(guò)mRNA 衰變或顯著的蛋白質(zhì)截短機(jī)制而使CUL7 活性喪失。然而，還是存在可以幫助CUL7結(jié)構(gòu)活性關(guān)系分析的取代突變。例如，源自3-M 的錯(cuò)義突變H1464P 駐留在CUL7cullin 結(jié)構(gòu)域中，并且被證明引起E3 連接酶活性的降低[10]。此外，CUL7 突變可能與3-M 矮小綜合征有關(guān)。

隨后的研究發(fā)現(xiàn)，obscurin-like 1(OBSL1)[13]和包含8 的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(CCDC8)[14]的突變也會(huì)導(dǎo)致3-M 綜合征。CUL7 似乎是導(dǎo)致3-M 綜合征的主要基因。3-M 突變的發(fā)生率在CUL7 中約為70%。在OBSL1 中為20%，而在CCDC8中為10%以下[15]。

CUL7，OBSL1 和CCDC8 似乎也相關(guān)聯(lián)。證據(jù)表明，CUL7，OBSL1 和CCDC8 在指定為3-M 的復(fù)合體中，其中還包括Fbxw8[8]。OBSL1 是一種細(xì)胞骨架銜接蛋白，將細(xì)胞的內(nèi)部細(xì)胞骨架連接到細(xì)胞膜。CCDC8 包含多個(gè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用域，能夠與OBSL1、CRL7Fbxw8 相互作用，以及通過(guò)其C 末端定位的PxLPxL 基序相互作用的其他蛋白質(zhì)[16]。

在最近的一項(xiàng)研究中表明CCDC8 僅位于質(zhì)膜上。CK2和GSK3 將CCDC8 磷酸化，使其與OBSL1 和CUL7 結(jié)合，從而導(dǎo)致膜相關(guān)的3-M 復(fù)合物組裝。這些作者進(jìn)一步確定了質(zhì)膜蛋白LL5β 是3-M 復(fù)合物的底物[17]。Wnt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制CCDC8 磷酸化會(huì)破壞3-M 復(fù)合物的膜定位和LL5β 的積累。在表達(dá)帶有3 個(gè)衍生突變的CUL7 或OBSL1 的細(xì)胞中也觀察到了此類缺陷。小鼠中Ccdc8 的缺失導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞遷移和胎盤(pán)發(fā)育缺陷，并表現(xiàn)出子宮內(nèi)生長(zhǎng)受限和圍產(chǎn)期致死性。

2 CRL7Fbxw8 在生長(zhǎng)控制中的作用

cul7 突變與人類遺傳綜合征3-M 和雅庫(kù)特綜合征的關(guān)聯(lián)，證明了CRL7Fbxw8 在生長(zhǎng)控制中的作用[10]。與人類遺傳學(xué)證據(jù)一致，小鼠cul7 基因的定向破壞導(dǎo)致嚴(yán)重的子宮內(nèi)發(fā)育遲緩(IUGR)，在妊娠后期和胎盤(pán)異常時(shí)胎兒明顯較小[2]。CUL7 基因在IUGR 中被上調(diào)多達(dá)10 倍，在與IUGR 相關(guān)的子癇前期中被上調(diào)15 倍[18]。生長(zhǎng)激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的失調(diào)似乎是3-M 綜合征的特征。例如，攜帶cul7 或ccdc8 突變的3-M患者的成纖維細(xì)胞分別顯示IGF1 或生長(zhǎng)激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受損。包含obsl1 突變的3-M 成纖維細(xì)胞在兩種途徑中均表現(xiàn)出損傷[15]。

fbxw8 基因的破壞導(dǎo)致表型較輕，異常主要局限于胎盤(pán)和生長(zhǎng)[19]。大約30%的純合子fbxw8-/-后代成年，即使在整個(gè)產(chǎn)后發(fā)育期間它們的體型都小于野生型同窩仔。因此，CUL7 和Fbxw8 在生長(zhǎng)控制中具有重疊的功能，這與CUL7 使用Fbxw8 介導(dǎo)增殖活性的假設(shè)相一致。另一方面，cul7 -/-小鼠的更嚴(yán)重的表型暗示Fbxw8 獨(dú)立功能。

有人提出了一些蛋白質(zhì)水解機(jī)制解釋CRL7Fbxw8 在生長(zhǎng)中的作用，控制總結(jié)如下。

IRS1 和mTORC1 負(fù)反饋回路：胰島素或胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)通過(guò)與受體結(jié)合來(lái)刺激生長(zhǎng)。配體結(jié)合受體酪氨酸激酶然后在多個(gè)酪氨酸殘基處磷酸化胰島素受體底物(IRS1)。由此產(chǎn)生的磷酸酪氨酸提供了能夠招募含有SH2(Src 同源2)的信號(hào)蛋白的對(duì)接位點(diǎn)，這些信號(hào)蛋白包括PI3-K(磷酸肌醇3-激酶)和Grb2(生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2)，從而分別激活下游Akt(蛋白激酶B；通過(guò)PI3-K)和RAS(通過(guò)Grb2)途徑?；罨腁kt 抑制TSC1/2(結(jié)節(jié)性硬化1/2)復(fù)合物，從而釋放小G 蛋白R(shí)heb(Ras 同系物enrichedinbrain)。mTORC1(雷帕霉素復(fù)合物1 的蛋白激酶機(jī)制靶點(diǎn))[20-21]和下游效應(yīng)酶6K1(s6kinase1)，導(dǎo)致核糖體生物生成和細(xì)胞生長(zhǎng)[22-23]。高活性mTORC1/S6K1 催化多位點(diǎn)IRS1 seryl 磷酸化，抑制IRS1與胰島素/IGF-1 受體相互作用的能力，并促進(jìn)蛋白酶體降解[24]。這種mTORC1/IRS1 負(fù)反饋減弱PI3-K 活性的強(qiáng)度或持續(xù)時(shí)間，以確保最佳的mTORC1 信號(hào)[23]。

幾項(xiàng)證據(jù)表明CRL7Fbxw8 在mTORC1/IRS1 負(fù)反饋控制中的作用是通過(guò)靶向IRS1 實(shí)現(xiàn)泛素非依賴性降解。Fbxw8與IRS1 結(jié)合并促進(jìn)其泛素化和蛋白酶體降解；Fbxw8 和CUL7 的失活/ 缺失分別累積IRS1。重要的是，fbxw8 誘導(dǎo)的IRS1 降解依賴于mTORC1 活性[25]。為了支持這些觀察，發(fā)現(xiàn)cul7 -/-小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞積累了IRS1，并表現(xiàn)出IRS1 下游途徑Akt 和MEK/ERK 的激活增加。有學(xué)者提出，過(guò)度激活的mTORC1/S6K1 引發(fā)IRS1 的多位絲氨酸磷酸化，觸發(fā)IRS1 與CRL7Fbxw8 的結(jié)合，導(dǎo)致IRS1 泛素化和降解，進(jìn)而導(dǎo)致PI3-K/Akt 活性減弱。

大量的生化[26]和生理學(xué)[27]證據(jù)證實(shí)，IRS1 降解信號(hào)序列被映射到其N 端574 個(gè)氨基酸殘基上。在該片段中，Ser-307/Ser-312 和Ser-527 構(gòu)成S6K1 磷酸化共有位點(diǎn)，這些位點(diǎn)被認(rèn)為是支持Crl7FBxW8 介導(dǎo)降解所必需的[26]。利用體外重建系統(tǒng)，用S6K1 刺激CRL7Fbxw8 對(duì)IRS1 N 末端片段的泛素化作用，但作用水平較低。相反，CRL7Fbxw8 支持從感染昆蟲(chóng)細(xì)胞中分離的高磷酸化IRS1 N 末端片段的高效泛素化。這些數(shù)據(jù)表明激酶需要額外的磷酸化還沒(méi)有確定。有人提出，IRS1 的N 末端需要多磷酸化才能確保只有當(dāng)mTORC1和S6K1 達(dá)到極高水平時(shí)，IRS1 才會(huì)完全降解。此外，在cul7小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中觀察到胰島素刺激增強(qiáng)的AKT 和MAP 激酶磷酸化[27]。與此一致，C2C12 肌管中的RNA 干擾導(dǎo)致CUL7 基因敲除，從而導(dǎo)致胰島素消化途徑和細(xì)胞葡萄糖攝取水平升高。CUL7 的缺失降低了這些細(xì)胞介導(dǎo)胰島素誘導(dǎo)的irs1 降解的能力。在小鼠模型中，與野生型對(duì)照組相比，雜合子CUL7 或fbxw8 在胰島素刺激下提高了骨骼肌組織中PI3-K/AKT 的激活。最后，在cul7 + /或fbxw8 + /小鼠中觀察到增強(qiáng)了胰島素敏感性和血漿葡萄糖清除率另一項(xiàng)研究表明，通過(guò)直接磷酸化Fbxw8，IRS1 的mTORC2 依賴性反饋抑制作用，導(dǎo)致該F-box 蛋白的穩(wěn)定性增強(qiáng)，從而促進(jìn)IRS1降解[28]?？傊?，這些研究表明CRL7Fbxw8 在影響mTORC1和mTORC2 信號(hào)傳導(dǎo)中起著重要作用。然而，有些研究與上述觀點(diǎn)不一致，他們認(rèn)為盡管未檢查IRS1 的磷酸化狀態(tài)，但未能觀察到CRS7 耗盡的細(xì)胞中IRS1 的積累[29]。最近，已確定人類IRS1 S422 是mTORC1 磷酸化的關(guān)鍵殘基，其似乎觸發(fā)了與SCF/CRL1βTrCP 的相互作用以進(jìn)行降解[30]。然而，需要進(jìn)一步的工作來(lái)為βTrCP 與IRS1 S422 degron 肽的直接結(jié)合提供證據(jù)，這與充分定義的βTrCP 底物結(jié)合共有基序顯著不同。

TBC1D3 和生長(zhǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)：人源特異性TBC1D3 腫瘤蛋白增強(qiáng)生長(zhǎng)因子受體信號(hào)傳導(dǎo)，隨后促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活。TBC1D3 響應(yīng)于生長(zhǎng)因子信號(hào)而降解，從而構(gòu)成生長(zhǎng)因子驅(qū)動(dòng)的負(fù)反饋回路[5]。多種證據(jù)表明，CRL7Fbxw8 靶向TBC1D3，在血清和生長(zhǎng)因子刺激下泛素化和降解。

Hippo 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與心肌細(xì)胞增殖：利用心肌細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞增殖抑制，可能與Hippo 激酶Mst1 和Lats1/2 的積累有關(guān)，提示Hippo-YAP 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在心臟發(fā)育中的作用。CUL7 參與控制Mst1 的豐度，因此參與Hippo-Yap 信號(hào)傳導(dǎo)和心肌細(xì)胞增殖[31]。

3 CRL7Fbxw8 在癌癥中的作用

P53: 已有研究報(bào)告了映射到CUL7 CPH 域和p53 的四聚化域的CUL7-p53 相互作用[32]。根據(jù)現(xiàn)有證據(jù)顯示，CUL7-p53 相互作用的結(jié)果似乎拮抗p53 的腫瘤抑制活性。細(xì)胞培養(yǎng)研究表明，CUL7 表達(dá)導(dǎo)致p53 轉(zhuǎn)錄活性降低[32]。細(xì)胞增殖速率的增加需要完整的p53[32]和抑制p53 對(duì)DNA損傷的激活[33]。其他證據(jù)包括CUL7 在抑制Myc 誘導(dǎo)的凋亡中的作用，盡管這種作用是否依賴于CUL7-p53 的相互作用還沒(méi)有被闡明[34]。到目前為止，還沒(méi)有證據(jù)表明crl7fbxw8通過(guò)泛素調(diào)節(jié)p53 而導(dǎo)致p53 穩(wěn)定性的改變[33]。

SV40 T 抗原及其轉(zhuǎn)化：CUL7 最初通過(guò)免疫沉淀研究證明為宿主細(xì)胞蛋白p185[35]或p193[36]，其在1990 年代初與猿猴病毒40 大T 抗原相關(guān)，很久以后才被識(shí)別為成分E3 泛素連接酶復(fù)合物的合成[2]。現(xiàn)有研究已將CUL7 結(jié)合位點(diǎn)定位于T 抗原69-83 位氨基酸[37]。與CUL7 結(jié)合缺陷的T 抗原突變體，雖然仍能與p53 和pRb 相互作用，但不能誘導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞增殖。這些數(shù)據(jù)表明T 抗原的轉(zhuǎn)化能力不僅需要p53 和pRB，還需要CUL7 活性的失活。這些結(jié)果證明了CUL7 作為腫瘤抑制因子的作用，至少需要存在有效的腫瘤蛋白T 抗原的情況下。

為了驗(yàn)證上述觀點(diǎn)，已有研究表明，野生型T 抗原，抑制了26S 蛋白酶體對(duì)CRL7Fbxw8 底物IRS1 的降解。在表達(dá)T抗原的細(xì)胞中觀察到IRS1 的積累和延長(zhǎng)的半衰期。與此一致，純化的T 抗原抑制了CRL7Fbxw8 依賴的IRS1 泛素化[38]。此外，表達(dá)T 抗原的細(xì)胞，或通過(guò)RNA 干擾耗盡CUL7，顯示IRS1 下游信號(hào)通路PI3-K/AKT 和Erk 絲裂原激活通路激酶的激活增強(qiáng)，以及下游靶基因c-fos 的上調(diào)。最后，在T 抗原陽(yáng)性的癌胚抗原424/SV40 LT 轉(zhuǎn)基因小鼠中檢測(cè)到IRS1 蛋白水平的升高和下游信號(hào)的激活?？傊?，這些結(jié)果提示T 抗原在保護(hù)IRS1 不被crl7fbxw8 降解中的作用。這種病毒活性可能在維持高水平的有絲分裂前IRS1 下游信號(hào)通路中發(fā)揮作用。

總體而言，這些研究可以調(diào)和CUL7 癌基因/腫瘤抑制因子悖論[39]。在正常細(xì)胞中，mTORC1/IRS1 反饋功能可確保正確的mTOR 信號(hào)傳遞[23]。CUL7 的缺失導(dǎo)致持續(xù)的mTOR 信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致衰老[25]。這與CRL7Fbxw8 生長(zhǎng)控制的作用保持一致。但是潛在的腫瘤蛋白T 抗原控制著細(xì)胞的高水平增殖。通過(guò)T 抗原介導(dǎo)的IRS1 降解抑制，打破mTORC1/IRS1 負(fù)反饋環(huán)，可能是維持有絲分裂前信號(hào)傳導(dǎo)，從而滿足增殖需要的必要條件。

細(xì)胞周期蛋白D1 與細(xì)胞周期：細(xì)胞周期進(jìn)入S 期需要通過(guò)重新定位和降解去除cyclind1。持續(xù)的MAPK 信號(hào)傳導(dǎo)(腫瘤細(xì)胞特有的特征)導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白D1 在T286 磷酸化，從而觸發(fā)與CRL7Fbxw8 的相互作用，導(dǎo)致泛素依賴性蛋白酶體降解[7]。Fbxw8 基因敲除導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白D1 的大量積累，以及CDK1 的胞質(zhì)隔離，導(dǎo)致細(xì)胞增殖的嚴(yán)重減少。細(xì)胞周期蛋白D1-T286A 的組成性核表達(dá)逆轉(zhuǎn)了這些效應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)支持CRL7Fbxw8 通過(guò)細(xì)胞周期蛋白D1 的蛋白水解在癌細(xì)胞增殖中的作用。然而，來(lái)自fbxw8 小鼠或野生型的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs)顯示出相似的細(xì)胞周期蛋白D1 降解率。這些遺傳分析對(duì)Fbxw8 在正常細(xì)胞周期進(jìn)程中細(xì)胞周期蛋白D1 降解中的重要作用提出了疑問(wèn)[40]。

HPK1、MAPK 與胰腺癌：造血祖細(xì)胞激酶1(HPK1) 抑制MEK1/2 介導(dǎo)的ERK 活化，并通過(guò)蛋白酶體介導(dǎo)的降解在＞95%的胰腺癌中丟失。HPK1 可能是一種新型的腫瘤抑制因子，而HPK1 的缺失在胰腺癌的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。敲除Fbxw8 可恢復(fù)內(nèi)源性HPK1 蛋白表達(dá)并抑制胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖。這些發(fā)現(xiàn)表明CRL7Fbxw8 在構(gòu)成負(fù)反饋環(huán)以抑制HPK1 的生長(zhǎng)抑制活性中起作用，并且CRL7Fbxw8促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖。

4 結(jié)束語(yǔ)

自2002 年發(fā)現(xiàn)以來(lái)，CRL7Fbxw8 已被證實(shí)參與了十多種蛋白質(zhì)底物的穩(wěn)定性控制。另外發(fā)現(xiàn)了兩種3-M-連接蛋白OBSL1 和ccdc8 及其與CRL7Fbxw8 的聯(lián)系，突出了E3 復(fù)合物在其生物學(xué)功能和生長(zhǎng)遲緩疾病中的重要亞細(xì)胞位置。

目前尚不清楚在小鼠cul7 基因敲除和/或帶有cul7 突變的人類3-M 綜合征中觀察到的生物學(xué)缺陷是否可歸因于發(fā)現(xiàn)的任何CRL7Fbxw8 底物的異常積累。迄今為止，可能我們還沒(méi)有鑒定出了CRL7Fbxw8 的某種底物，該底物起著主要的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)作用，并且在失調(diào)時(shí)會(huì)導(dǎo)致3-M 生長(zhǎng)遲緩。或者，3-M 可能是由受CRL7Fbxw8 影響的多種蛋白水解途徑失調(diào)引起的疾病。還應(yīng)注意，CUL7 具有非蛋白水解功能，可能在細(xì)胞增殖和3-M 綜合征中起重要作用。

我們認(rèn)為，繼續(xù)使用遺傳和生化方法將有助于更好地了解CRL7FBXW8 的生長(zhǎng)控制和腫瘤中的作用，先進(jìn)的小鼠模型可以用來(lái)模擬人類3-M 綜合征，更精確地闡明CRL7Fbxw8在細(xì)胞增殖信號(hào)通路中的作用。深入研究CRL7Fbxw8 的蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)水解功能可能產(chǎn)生新的機(jī)制。希望這些發(fā)現(xiàn)能為3M 及相關(guān)生長(zhǎng)遲緩綜合征的治療開(kāi)辟新的治療途徑。