魯衛(wèi)紅/甘肅省臨夏州動物疫病預(yù)防控制中心 731100

1 實驗操作準(zhǔn)備要點

1.1 標(biāo)本處理和保存血凝和血凝抑制試驗主要以靜脈血為主。要使實驗室診斷得出正確結(jié)果，采集靜脈血后需要及時做血清分離，保證血清清透無溶血。通常是分離后及時檢測，如果不能及時檢測，待檢血清在4℃冷藏環(huán)境中保存不超過5d，如果待檢時間超過一周，需要保存在-20℃冷凍環(huán)境中，檢測時取出自然融化，避免血清反復(fù)凍融影響效價。

1.2 稀釋液配置血凝和血凝抑制試驗中所用的PBS稀釋液必須遵循“現(xiàn)配現(xiàn)用”的原則，嚴(yán)格控制PBS液的PH值確保PH7.0～7.2。

1.3 1%紅細(xì)胞懸液制備需要選取3～5只常規(guī)實驗證明體內(nèi)無禽流感病毒抗體的健康公雞，最大限度的避免公雞紅細(xì)胞發(fā)生自凝現(xiàn)象。翅下靜脈血采集到加有抗凝劑的試管中并上下顛倒混勻，待采集樣本在離心操做中緩慢加入PBS液混合，按2000r/min的離心5min，反復(fù)三次離心即可，每次離心結(jié)束后都吸出上層溶液和白細(xì)胞膜棄去，制成紅細(xì)胞泥加入阿氏保護(hù)液，4℃冷藏保存?zhèn)溆?，不超過5d。整個制備過程中避免用力太大引發(fā)紅細(xì)胞破裂出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，臨用時用PBS液制成1%紅細(xì)胞懸液，每次實驗結(jié)束后剩余的1%紅細(xì)胞懸液應(yīng)棄去，切勿保留至下次再用。注意：最終配置好的懸液靜放后出現(xiàn)了紅色上清液，是出現(xiàn)了溶血現(xiàn)象，此時的紅細(xì)胞懸液不可用。

2 試驗操作要點

2.1 HA試驗HA試驗主要是測定抗原的效價，通常做3個重復(fù)就可以精準(zhǔn)得出抗原效價。加入1%紅細(xì)胞懸液后在室溫（18～20℃）靜置40min后觀察試驗結(jié)果。傾斜反應(yīng)板，觀察試驗后紅細(xì)胞是否存在淚滴狀流淌。能夠完全讓紅細(xì)胞凝集的抗原最高稀釋度是該種抗原的血凝效價，該效價為1個血凝單位。HA試驗主要是對血凝效果進(jìn)行初步判斷，結(jié)合判定結(jié)果開展4HAU抗原檢測，校正最終檢驗結(jié)果。配制好4個HAU的病毒抗原后，需做血凝回歸實驗4孔4個重復(fù)，其結(jié)果判定如下：

如果HA效價判定精準(zhǔn)，4HAU抗原檢測時回滴到第一二孔時將發(fā)生凝集，在后面兩孔將出現(xiàn)流淌現(xiàn)象；如果HA效價判定出現(xiàn)偏差，4HAU抗原檢測時濃度將出現(xiàn)偏高或者偏低。當(dāng)4HAU抗原濃度偏低時候需要添加抗原，當(dāng)4HAU抗原濃度偏高時需要補充一定的PBS

2.2 HI試驗在HI試驗時需要設(shè)立陰性和陽性對照組。操作過程中為了減少誤差，不論是在HA或HI實驗中倍比稀釋時保持每次稀釋次數(shù)盡量一致（5～8次），稀釋時吸頭插入液面以下但不可過深，避免孔中液體產(chǎn)生氣沫，倍比稀釋后再加任何液體全部采用先加對照孔，其次按低濃度孔向高濃度孔順序添加，需要遵循“從后往前”加原則。加入抗原后在室溫（18～20℃）條件下靜置30min，再添加1%紅細(xì)胞懸液，在加抗原和紅細(xì)胞懸液時吸頭不要深入液面，盡量懸空垂直加樣。加入紅細(xì)胞后需要混勻（反應(yīng)板四邊輕輕手拍20次，嚴(yán)禁使用震蕩器混勻），避免紅細(xì)胞下沉。每次靜置時反應(yīng)板需封口，以免水分蒸發(fā)影響結(jié)果，孵育時間要嚴(yán)格控制。紅細(xì)胞對照完全沉淀時迅速判定，可將反應(yīng)板傾斜45°。判定最高稀釋度時需要結(jié)合紅細(xì)胞對照孔，與對照孔的流淌速度一致，淚滴大小一致的稀釋倍數(shù)孔為檢測樣品的最終效價。整個實驗過程中要避免雜菌污染，因為污染所造成的非流感性的凝集素也可與所有抗原血清發(fā)生非特異性反應(yīng)。

2.3 結(jié)果判定試驗結(jié)果將出現(xiàn)病毒對照孔完全凝集和稀釋液對照孔無凝集。

2.3.1 如果出現(xiàn)整板無紅細(xì)胞凝集（流淌）現(xiàn)象，首先考慮：a未加4單位抗原或4單位抗原配制過低。b 環(huán)境溫度過高或讀數(shù)時間拖延。

2.3.2 出現(xiàn)整板紅細(xì)胞凝集（不流淌）現(xiàn)象，原因有：a紅細(xì)胞、PBS液受污染或保存時間過長。b 4HAU抗原配制失敗或滴加失誤。只有陰性對照孔血清滴度≦2log2，并且陽性對照孔血清誤差±1個滴度的時候該項試驗結(jié)果才具有可參考性。測定孔血凝抑制試驗效價以完全血凝抑制4HAU抗原血清的最高稀釋倍數(shù)為基數(shù)，將基數(shù)作為HI的滴讀。即紅細(xì)胞沉于孔底中心，呈紐扣狀，將板傾斜呈淚滴狀流淌。禽流感HI價≦2log2判定試驗陰性，HI價等于3log2為可疑，需重復(fù)實驗，HI價≥4log2為陽性。

3 結(jié)束語

總之，為了確保禽流感血凝和血凝抑制試驗的精準(zhǔn)性，必須注重每個實驗細(xì)節(jié)，嚴(yán)格按照實驗標(biāo)準(zhǔn)流程開展，做好試驗環(huán)節(jié)質(zhì)量把控。最大限度降低試驗誤差，為預(yù)防和控制禽流感得出精準(zhǔn)的意見。