肖世昌 趙仲麟 張富麗 蘭璞 陳澤一 王雨 徐石勇 趙清寰 宋君 劉征輝 王永 蘭青闊

摘? ? 要：金銀花為常用大宗中藥材，具有清熱解毒功效，有些不法商家將價格便宜近十倍的山銀花當(dāng)金銀花銷售和使用，嚴(yán)重危害市場。為鑒別中藥材金銀花真?zhèn)?，本研究基于高分辨率熔解曲線技術(shù)（High Resolution Melting，HRM），建立了金銀花真?zhèn)畏肿予b定方法。提取樣品總DNA，對金銀花及其偽品山銀花的葉綠體基因組標(biāo)志性核酸位點進(jìn)行PCR擴增及HRM分析，并與標(biāo)準(zhǔn)樣品的曲線作對比，判斷供試金銀花真?zhèn)?。?biāo)志性核酸位點分型包括G/G、A/A兩種，其中G/G型為金銀花真品，A/A型為金銀花偽品。本研究建立的基于HRM技術(shù)的金銀花真?zhèn)舞b別方法具有快速、高通量的優(yōu)點，為中草藥監(jiān)管和應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：金銀花;真?zhèn)舞b別;高分辨率熔解度曲線技術(shù)

中圖分類號：R282.5? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.10.003

Study on Authenticity Method of Lonicera Japonica Based on High Resolution Melting Curve Technology

XIAO Shichang1，2，ZHAO Zhonglin2， ZHANG Fuli3，LAN Pu1，CHEN Zeyi2，WANG Yu2，XU Shiyong1，

ZHAO Qinghuan2， SONG Jun3， LIU Zhenghui1， WANG Yong1，LAN Qingkuo1

（1.Tianjin Academy of Agricultural Sciences， Tianjin 300381， China;2.College of Science， Henan Agricultural University， Zhengzhou， Henan 450002， China;3.Analysis and Testing Center of Sichuan Academy of Agricultural Sciences， Chengdu， Sichuan 610066， China）

Abstract： Lonicera japonica is one of the most important herbal medicinal plants with applications in traditional Chinese medicine， which has antiseptic and antiviral curative effects.Some illegal venders replace Lonicera japonica with Lonicera Flos， which is nearly ten times cheaper.This mess has seriously disturbed the market. In order to identify the authenticity of Lonicera japonica Thunb.， a method based on the High Resolution Melting（HRM）technology was established in this study. Taking the flag nucleic acid site on chloroplast genome as target， total DNA extraction， PCR amplification and HRM analysis were performed by comparing with the curve of the standard sample，we can determine the authenticity of test samples. The genotyping of flag site includes G/G and A/A，of which the G/G stands for Lonicera japonica and the A/A stands for Lonicerae Flos.This study provided technical support for the identification of traditional Chinese medicine resources based on HRM technology to identify the Lonicera japonica， which had the advantages of rapid and high-throughput.

Key words： Lonicera japonica; authenticity identification; High-Resolution Melting Curve

金銀花為忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或初開的花[1]，又名忍冬，是常用大宗中藥材。金銀花具有清熱解毒功效，常用于治療溫病發(fā)熱，熱毒血痢，癰瘍等癥，亦可用于風(fēng)熱感冒，支氣管炎等病癥[1]。一些常用藥如銀翹解毒丸、連翹敗毒丸[2]、雙黃連口服液、清開靈注射液及口服液、銀黃片、復(fù)方大青葉合劑等均以金銀花為主要原料[3]，目前已經(jīng)上市的80%的清熱解毒殺菌類的中藥處方中都含有金銀花。

近年來，鑒于非典、禽流感、甲型流感、手足口病、新型冠狀病毒等病毒性疾病的全球大爆發(fā)，清熱解毒[4]藥材金銀花市場缺口比較大;隨著我國對金銀花開發(fā)利用取得突破性進(jìn)展，不僅藥用量連年增加，而且在茶葉、飲料、日化、化妝品和保健食品等領(lǐng)域的需求急劇增大。隨著市場需求量不斷增大及價格上漲，有些不法商家將價格便宜近十倍的灰氈毛忍冬（Lonicera macranthoides Hand-Mazz.）、紅腺忍冬（Lonicera Hypoglauca Miq.）、黃褐毛忍冬（Loniceraful

votomentosa Hsu et S.C.Cheng）等山銀花[1]（Lonicerae

Flos）當(dāng)做金銀花銷售和使用，對市場造成了嚴(yán)重危害，也嚴(yán)重?fù)p害了人民的健康和利益。因此，操作簡單、步驟少、穩(wěn)定性高的金銀花真?zhèn)舞b別方法迫切需要得到應(yīng)用與推廣?；赑CR技術(shù)的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)在中藥鑒定中被廣泛應(yīng)用[5-6]，DNA 條形碼標(biāo)記技術(shù)多態(tài)性強、精準(zhǔn)度高，是目前多態(tài)性最強和最精準(zhǔn)的標(biāo)記技術(shù)。蔣超等[7-8]建立了基于雙向位點特異性PCR技術(shù)的金銀花真?zhèn)渭盎祀s品鑒別方法，但是在檢測速度、通量和自動化分析方面還難以滿足需求。

植物葉綠體基因組包含豐富的變異位點，可以作為超級條形碼用于中藥材鑒定，具有巨大的物種識別潛力[9]。本研究基于葉綠體基因組對貝母屬植物進(jìn)行分析，對SNP位點[10]在精準(zhǔn)鑒定、精確定量應(yīng)用方面進(jìn)行了討論，為川貝母中藥資源鑒定提供了技術(shù)支撐[11]。董博然等[12]對龍膽科葉綠體基因組結(jié)構(gòu)特征分析，顯示出龍膽科植物獨特的序列結(jié)構(gòu)及其豐富多樣的遺傳信息，對物種資源保護(hù)及中藏藥生藥學(xué)研究等提供了科學(xué)依據(jù)。張中聯(lián)等[13]通過分析傳統(tǒng)藥物龍血的完整葉綠體基因組顯示，整個CP基因組可以用作識別這些龍血樹屬植物的超級條形碼。本研究以金銀花及其偽品灰氈毛忍冬為材料，基于高分辨率熔解度曲線技術(shù)（High Resolution Melting，HRM），對金銀花葉綠體的標(biāo)志性核酸位點進(jìn)行分析，建立了快速、高通量、自動化的金銀花摻偽鑒別方法，為規(guī)范、監(jiān)管藥材市場提供了技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

金銀花及其偽品灰氈毛忍冬標(biāo)準(zhǔn)樣品，由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心提供;市售金銀花樣品23#和90#由本實驗室保存。

1.2 實驗儀器

Neslab恒溫水浴鍋，Retsch MM400生物粉碎儀，Biorad CFX96 real-time PCR儀。

1.3 試驗方法

1.3.1 總DNA提取 稱取冷凍研磨后樣品粉末200 mg，加入CTAB緩沖液（20 g·L-1 CTAB，1.4 M NaCl，0.1 M Tris-HCl，20 mM Na2EDTA）500 μL，65 ℃恒溫水浴裂解30 min，后續(xù)DNA提取純化按樹脂型基因組DNA提純試劑盒（賽百盛）操作進(jìn)行。提取后的DNA統(tǒng)一稀釋濃度至50±1 ng·μL-1。

1.3.2 PCR擴增及HRM 分析以提取的總DNA為模板，使用Bio-Rad CFX96實時定量熒光擴增儀進(jìn)行PCR擴增和HRM分析試驗。PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL，其中2×premix for probe（TaKaRa）10 μL，20×Eva green 1 μL，上游和下游引物10 μmol·L-1各1 μL，濃度50 ng·μL-1的基因組DNA模板2 μL，雙蒸水5 μL;PCR擴增程序設(shè)置為95 ℃預(yù)變性10 min;40個擴增循環(huán)，其中95 ℃ 15 sec，60 ℃ 30 sec。HRM程序設(shè)置為95 ℃ 15 sec;55 ℃ 15 sec;55～95 ℃逐步升溫，每上升0.2 ℃，15 sec。試驗結(jié)束后，使用Precision Melt Analysis Software軟件，比較HRM的標(biāo)準(zhǔn)視圖（Normailized）和差異視圖（Difference），對基因分型位點進(jìn)行分型判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)志性核酸位點選擇及引物設(shè)計

在NCBI網(wǎng)站（www.ncbi.nlm.nih.gov）搜集忍冬屬葉綠體核酸序列33條，包括忍冬金銀花（Lonicera japonica）、灰氈毛忍冬（Lonicera macranthoides）、剛毛忍冬（Lonicera hispida）等。經(jīng)過mafft序列比對，分析獲得11 533個SNP位點，具有一致性的位點108個，上下游適合設(shè)計HRM引物的位點7個。選擇其中第6號位點（MH028738.1，75 583bp）作為真?zhèn)舞b定標(biāo)志性核酸位點CpnG-Sign（表1）。從表1可以看出，CpnG-Sign位點分型包括G/G、A/A兩種，其中金銀花忍冬（Lonicera japonica）真品為G/G型，灰氈毛忍冬（Lonicera macranthoides）、剛毛忍冬（Lonicera hispida）等山銀花為A/A型。

使用軟件LightScanner Primer Design software 設(shè)計PCR-HRM引物。引物序列如表2所示，引物由金唯智公司合成。

2.2 基于HRM的金銀花真?zhèn)舞b別方法建立

以標(biāo)準(zhǔn)樣品為對象，使用1.3試驗方法進(jìn)行DNA提取、PCR擴增及HRM分析。定義正品忍冬金銀花的位點分型為G/G型，偽品山銀花灰氈毛忍冬的位點分型為A/A型，優(yōu)化、構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)樣品CpnG-Sign位點的HRM分析標(biāo)準(zhǔn)視圖（圖1A）和差異視圖（圖1B）。在兩種視圖下，正品忍冬金銀花和偽品山銀花灰氈毛忍冬的標(biāo)志性核酸位點高分辨率熔解曲線明顯分離，能夠有效區(qū)分兩種分型。

2.3 樣品驗證

用同樣的方法對供試樣品23#和90#進(jìn)行DNA提取、PCR擴增及標(biāo)志性核酸位點分型分析。經(jīng)過HRM分析，與標(biāo)準(zhǔn)金銀花樣品的標(biāo)準(zhǔn)視圖和差異視圖的曲線進(jìn)行比較分類，從而辨別供試金銀花樣品真?zhèn)?。結(jié)果表明，樣品23#的CpnG-Sign位點的HRM分析標(biāo)準(zhǔn)視圖（圖2A）和差異視圖（圖2B）與金銀花真品的標(biāo)準(zhǔn)視圖和差異視圖一致，聚類判定為G/G分型，表明該樣品為金銀花真品。樣品90#的CpnG-Sign位點的HRM分析標(biāo)準(zhǔn)視圖（圖2C）和差異視圖（圖2D）與灰氈毛忍冬的標(biāo)準(zhǔn)視圖和差異視圖一致，聚類判定該樣品為A/A分型，表明該樣品為金銀花偽品。

3 結(jié)論與討論

現(xiàn)代藥理研究表明，金銀花具有抑菌、抗病毒、抗炎、解熱、調(diào)節(jié)免疫等作用，曾在抗擊流感中發(fā)揮了巨大作用。最近，新型冠狀病毒的爆發(fā)，嚴(yán)重危害人民生命健康安全。有最新研究顯示，金銀花的抗病毒性對新型冠狀病毒有一定的效果。新疆醫(yī)科大學(xué)吉米麗汗·司馬依等對金花清感顆粒輔助治療新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的活性成分研究探索表明金花清感顆粒的活性成分可能發(fā)揮對COVID-19的治療作用[14]，金花清感顆粒的有效成分之一便是金銀花。國醫(yī)大師防治新型冠狀病毒肺炎處方分析[15]，使用藥物最多的是黃芪、藿香、金銀花。

我國藥用植物種類繁多、基源復(fù)雜，現(xiàn)在常用的檢測技術(shù)，有傳統(tǒng)的基于形態(tài)學(xué)標(biāo)記鑒定和顯微鑒定技術(shù)、基于藥效成分的現(xiàn)代理化鑒定技術(shù)以及近年發(fā)展較快的分子標(biāo)記鑒定技術(shù)。傳統(tǒng)的經(jīng)驗鑒別對鑒定者要求較高，需要掌握足夠的知識和經(jīng)驗，且鑒別結(jié)果取決于鑒別者的經(jīng)驗和知識;基于形態(tài)學(xué)標(biāo)記的性狀鑒定和顯微鑒定難滿足快速、精準(zhǔn)的需要，鑒定結(jié)果可靠性較差而且費時費力;理化鑒定以中藥有效成分為對象，能辨明中藥材的真?zhèn)蝺?yōu)劣，但對于摻雜現(xiàn)象鑒定效果不佳。相比于經(jīng)驗鑒別、顯微鑒別和理化鑒別來說，分子鑒別技術(shù)準(zhǔn)確度更高，且不受取樣部位、環(huán)境因素等的影響，具有更高的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。RFLP[16]、RAPD、AFLP等第一、二代標(biāo)記技術(shù)位點開發(fā)難度大、重復(fù)性較差，不易大規(guī)模應(yīng)用;SSR 技術(shù)開發(fā)成本低且多態(tài)性、重復(fù)性好，但單個SSR位點的多態(tài)性不足，需要篩選大量引物，且需要聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），工作量大[17]。這些鑒定方法在檢測速度、通量、檢測準(zhǔn)確度等方面各有一定的限制。本研究在分子生物學(xué)的基礎(chǔ)上，利用HRM法，從分子水平上檢測金銀花葉綠體[18]的特異核酸序列，對金銀花與山銀花葉綠體的標(biāo)志性核酸位點進(jìn)行分析。在不計算DNA提取過程耗時的情況下，PCR耗時40-90 min，HRM分析10-30 min，在1-2 h之內(nèi)即可完成鑒定工作，具有快速、低成本、操作方便和閉管檢測防止污染等優(yōu)勢，能高效準(zhǔn)確的辨別金銀花真?zhèn)巍?/p>

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收稿日期：2020-05-26

基金項目：四川省創(chuàng)新能力提升工程公益深化項目（2016GYSH-032）;京津冀三地協(xié)同創(chuàng)新研發(fā)項目（18YFSDZC00020）

作者簡介：肖世昌（1998—），男，河南鄭州人，在讀本科生，主要從事生物技術(shù)相關(guān)的研究。

通訊作者簡介：蘭青闊（1980—），男，河南南陽人，碩士，研究員，主要從事種質(zhì)資源分子識別技術(shù)研究。