曹 寧， 周新麗

上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093

食品安全在現(xiàn)代社會(huì)引發(fā)越來(lái)越廣泛的關(guān)注，出現(xiàn)許多由食源致病菌的污染食品造成頻發(fā)的食品安全事件，而早期對(duì)致病菌進(jìn)行分子診斷可有效防止后期產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p害。在致病菌檢測(cè)早期，標(biāo)志物的檢測(cè)水平通常非常低[1]，需要采用核酸擴(kuò)增技術(shù)來(lái)擴(kuò)增脫氧核糖核酸(Deoxyribo Nucleic Acid，DNA)和核糖核酸(Ribonucleic Acid，RNA)，拷貝大量目標(biāo)核酸，顯著提高反應(yīng)靈敏度[2]。核酸擴(kuò)增技術(shù)包含常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[3](Polymerase Chain Reaction，PCR)、核酸等溫?cái)U(kuò)增等技術(shù)。其中，核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)操作簡(jiǎn)單，僅需要一個(gè)恒溫平臺(tái)，便能使樣品進(jìn)行高效、快速的核酸擴(kuò)增反應(yīng)，但仍需要專(zhuān)業(yè)的檢測(cè)人員操作，不宜在現(xiàn)場(chǎng)及基層推廣[4]。

微流控技術(shù)是將傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室的基本功能整合到一個(gè)只有幾平方厘米的芯片上，僅通過(guò)皮升或微升體積的微量流體，便能實(shí)現(xiàn)生化分析的各個(gè)步驟。此方法具有微型化、集成化、高通量、自動(dòng)化的優(yōu)勢(shì)，為實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、低成本的生化分析提供了一條經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便的檢測(cè)技術(shù)途徑。目前微流控檢測(cè)芯片已廣泛應(yīng)用于血液檢測(cè)[5, 6]、藥物篩選[7,8]、核酸分析[9,10]、水質(zhì)分析[11,12]及食品檢測(cè)[13,14]等方面。微流控芯片的驅(qū)動(dòng)方式分為機(jī)械驅(qū)動(dòng)及非機(jī)械驅(qū)動(dòng)。機(jī)械驅(qū)動(dòng)主要是利用自身部件的運(yùn)動(dòng)來(lái)達(dá)到驅(qū)動(dòng)的目的，包括各種微泵驅(qū)動(dòng)[15]、磁珠驅(qū)動(dòng)[16]和離心力驅(qū)動(dòng)[17]等，非機(jī)械驅(qū)動(dòng)方式包括毛細(xì)管作用力驅(qū)動(dòng)[18]，電動(dòng)驅(qū)動(dòng)[19]等。離心力驅(qū)動(dòng)芯片是機(jī)械驅(qū)動(dòng)中的一種，與微泵驅(qū)動(dòng)、磁珠驅(qū)動(dòng)等機(jī)械驅(qū)動(dòng)的不同在于，其不需要連接外部任何其他接口，可實(shí)現(xiàn)分析系統(tǒng)的集成性及簡(jiǎn)便性。由于離心重力場(chǎng)的作用，離心式芯片可以簡(jiǎn)便去除可能干擾測(cè)定的任何氣泡，并且通過(guò)調(diào)節(jié)通道的長(zhǎng)度及旋轉(zhuǎn)速度，實(shí)現(xiàn)不同大小的離心力，僅通過(guò)簡(jiǎn)單主軸電機(jī)即可驅(qū)動(dòng)數(shù)十或者數(shù)百個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)單元，可在芯片上對(duì)樣品進(jìn)行分子診斷及檢測(cè)分析[20]。

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明將離心微流控芯片技術(shù)與核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)結(jié)合，具有微量化、集成化、自動(dòng)化等特點(diǎn)，在食品安全、環(huán)境保護(hù)、醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域展現(xiàn)巨大的發(fā)展?jié)摿Α１菊撐慕榻B了離心微流控芯片技術(shù)用于核酸等溫?cái)U(kuò)增的研究進(jìn)展，包括離心微流控芯片技術(shù)用于核酸提取、試劑的預(yù)存儲(chǔ)，重組酶聚合酶擴(kuò)增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP)、依賴(lài)核酸序列擴(kuò)增(Nucleic Acid Sequence-dependent Amplification,NASBA)三種核酸等溫?cái)U(kuò)增方法中的應(yīng)用。最后，對(duì)離心微流控技術(shù)用于核酸等溫?cái)U(kuò)增存在的問(wèn)題和可能的發(fā)展方向進(jìn)行了分析。

1 離心微流控芯片技術(shù)用于核酸擴(kuò)增前處理

1.1 核酸提取

在進(jìn)行核酸擴(kuò)增檢測(cè)之前，首先要進(jìn)行樣品中的核酸提取。提取樣品中的核酸，真核細(xì)胞或細(xì)菌需要進(jìn)行裂解，使核酸易于純化或濃縮，提取高質(zhì)量的DNA、RNA是檢測(cè)成功的關(guān)鍵[21-24]。離心式芯片上DNA的提取及純化常采用磁珠或二氧化硅珠機(jī)械裂解法。該方法需要三個(gè)主要步驟：樣品DNA與珠子相的結(jié)合、珠子洗滌以及DNA純化、DNA的洗脫。

STUMPF F等[25]使用磁珠在芯片上進(jìn)行核酸提取，磁珠為固定相。如圖1A所示，將磁珠預(yù)存儲(chǔ)于芯片腔室(c)中，并將結(jié)合液、裂解液、洗滌液1、洗滌液2、洗脫液通過(guò)鋁復(fù)合箔棒狀包裝預(yù)存儲(chǔ)于(b)從右至左的五個(gè)不同腔室內(nèi)。樣品從進(jìn)樣腔(a)加入，在電機(jī)頻率為55 Hz的條件下將裂解液、洗滌液1、洗滌液2、洗脫液RNA提取緩沖液從棒狀包裝中釋放出并分別轉(zhuǎn)移至裂解結(jié)合腔(c)、洗滌腔1(d)和洗滌腔2(e)和洗脫腔(f)。調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為80 Hz將結(jié)合液包裝破裂并添加至裂解結(jié)合腔(c)裂解樣品中，使RNA與磁珠結(jié)合。通過(guò)使用外部移動(dòng)磁鐵的方法依次通過(guò)核酸提取腔室(c-f)得到純化后的RNA。最后提取出純化后的RNA驅(qū)動(dòng)到微流體通道區(qū)域(g)中，使用10 Hz的頻率使洗脫液泵送到等分結(jié)構(gòu)(h)中，然后轉(zhuǎn)移至反應(yīng)腔(i)中進(jìn)行后續(xù)擴(kuò)增檢測(cè)。

另一方法，使用二氧化硅珠以提取核酸，硅珠為固定相。JUNG J H等[26]研究出將硅珠以低凹結(jié)構(gòu)填充在微通道中，不論旋轉(zhuǎn)速度和方向如何，這種珠床都是固定的。如圖1B所示，將樣品加入進(jìn)樣腔(a)中，由于芯片的親水性，樣品自動(dòng)流入含有硅珠的微通道(b)中，硅珠將RNA樣品及一些雜質(zhì)捕獲。洗滌液、洗脫液和RT-LAMP反應(yīng)混合液分別裝入洗滌腔(c)、洗脫腔(d)及RT-LAMP存儲(chǔ)腔(e)，以5 000 r/min的速度離心10 s，先釋放洗滌液，去除殘留在硅珠上的鹽、蛋白質(zhì)，通過(guò)虹吸閥的設(shè)計(jì)再釋放洗脫液，洗脫硅珠上純化后的RNA，然后以5 000 r/min的速度逆時(shí)針離心290 s完全干燥微珠中的任何殘留乙醇，核酸提取的廢棄液體由驅(qū)動(dòng)力移動(dòng)至廢液腔(g)。將驅(qū)動(dòng)設(shè)備停止30 s，在進(jìn)樣腔(a)中加入無(wú)核酸酶水，RT-LAMP存儲(chǔ)腔(e)中的反應(yīng)混合液釋放至虹吸閥，以5 000 r/min的速度順時(shí)針旋轉(zhuǎn)90 s，純化后的RNA與RT-LAMP混合液轉(zhuǎn)移至反應(yīng)腔(f)并進(jìn)行后續(xù)擴(kuò)增檢測(cè)。離心式芯片需要精密設(shè)計(jì)的微通道和腔室才能夠僅通過(guò)主軸電機(jī)進(jìn)行核酸的提取及純化。

1.2 試劑的預(yù)存儲(chǔ)

試劑的預(yù)存儲(chǔ)能夠有效避免來(lái)自不同生產(chǎn)批次的試劑的混合，有助于減少交叉污染，增強(qiáng)檢測(cè)效果，減少在檢測(cè)過(guò)程中手動(dòng)添加試劑。預(yù)存儲(chǔ)可細(xì)分為干燥試劑和液體試劑的存儲(chǔ)，由于預(yù)存儲(chǔ)試劑(例如緩沖液和溶劑)需要低溫、隔氧、避光保存等性質(zhì)，其長(zhǎng)期預(yù)存儲(chǔ)是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。

使用干燥形式進(jìn)行試劑的預(yù)存儲(chǔ)，通常是在芯片封裝之前將預(yù)存儲(chǔ)試劑添加到聚合物芯片反應(yīng)室內(nèi)，然后將試劑進(jìn)行冷凍干燥，之后再對(duì)芯片進(jìn)行封裝。通過(guò)優(yōu)化合適的冷凍干燥參數(shù)，凍干試劑能夠長(zhǎng)期在室溫下穩(wěn)定存儲(chǔ)。對(duì)于液體試劑，可以預(yù)先存儲(chǔ)在單獨(dú)的容器中，也可以直接注入離心式芯片的腔室中。STUMPF F等[25]提出了由不透氣的鋁復(fù)合箔制成微型包裝，能夠在制造過(guò)程中改變微型包裝的密封參數(shù)，實(shí)現(xiàn)在不同的離心力下分批次破裂釋放緩沖液，可用于PCR試劑補(bǔ)充液或緩沖液的釋放(圖1C)。LUTZ S等[27]證明了用于DNA提取的液體試劑的長(zhǎng)期穩(wěn)定預(yù)存儲(chǔ)。將RPA緩沖液封裝在玻璃包裝中進(jìn)行密封，然后將其放在芯片內(nèi)。當(dāng)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，首先將玻璃瓶手動(dòng)壓碎將試劑釋放到微流體結(jié)構(gòu)中，再進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)(圖1D)。

2 離心微流控芯片技術(shù)用于核酸等溫?cái)U(kuò)增

核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)能夠使用恒定溫度對(duì)DNA、RNA進(jìn)行擴(kuò)增，操作過(guò)程較PCR技術(shù)簡(jiǎn)單很多，在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的研究中展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。下面介紹離心微流控芯片技術(shù)在重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)、依賴(lài)核酸序列擴(kuò)增(NASBA)三種核酸等溫?cái)U(kuò)增方法中的應(yīng)用。

2.1 重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)

重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)僅需要一種能夠結(jié)合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶，單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)與被取代的 DNA 鏈結(jié)合，DNA聚合酶在室溫或37 ℃的最佳溫度下均能進(jìn)行具有活性的鏈置換反應(yīng)[28]。反應(yīng)的第一步是在重組酶和引物之間形成復(fù)合物，該復(fù)合物與雙鏈DNA中同源序列的互補(bǔ)DNA結(jié)合。一旦引物與同源序列結(jié)合，就會(huì)發(fā)生鏈交換反應(yīng)，啟動(dòng)DNA合成，并以指數(shù)方式擴(kuò)增模板上的靶區(qū)域，取代的DNA鏈與SSB結(jié)合以防止進(jìn)一步取代[29]。在該系統(tǒng)中，合成反應(yīng)由兩個(gè)相對(duì)的引物引發(fā)，整個(gè)過(guò)程在10 min內(nèi)獲得可檢出水平的擴(kuò)增產(chǎn)物。這種方法由于反應(yīng)溫度相對(duì)較低，不會(huì)出現(xiàn)液體蒸發(fā)的問(wèn)題。

CHOI G等[30]，研發(fā)出集成性的離心式芯片及配套檢測(cè)儀器。能夠在單個(gè)離心式芯片中進(jìn)行牛奶細(xì)菌的裂解，試劑的精準(zhǔn)分裝，RPA擴(kuò)增以及實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)。單個(gè)離心式芯片包含一式三份相同功能單元，每個(gè)單元含有四個(gè)反應(yīng)腔；每部分芯片由兩層組成，包括RPA試劑注入頂層和含有食源性致病菌的加標(biāo)牛奶樣品裝入底層。芯片的操作流程如圖2A所示：首先將細(xì)菌樣品添加到芯片的樣品入口(a)，RPA試劑添加至試劑入口(b)，通過(guò)800 r/min轉(zhuǎn)速使細(xì)菌樣品進(jìn)入等分腔(c)將樣品等分為四份，再調(diào)節(jié)至3 000 r/min轉(zhuǎn)速，頂層的RPA試劑通過(guò)微通道流入至緩沖液腔(d)。最終以5 000 r/min的速度將等分腔(c) 中的細(xì)菌樣品和緩沖液腔(d)的RPA試劑同時(shí)加載到每個(gè)反應(yīng)腔(e)中混合，再進(jìn)行RPA擴(kuò)增后續(xù)檢測(cè)。此方法可以在39 ℃恒溫30 min，通過(guò)熒光變化同時(shí)檢測(cè)牛奶樣品中三種食源致病菌，并且可直接對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)無(wú)需提取DNA。

CHEN J等[31]，研發(fā)出一種便攜式過(guò)濾移液器，可從尿液樣本中檢測(cè)出五種不同的致病菌。芯片的操作流程如圖2B所示：首先將磁力攪拌子與氧化鋯珠預(yù)封裝于芯片裂解腔(b)內(nèi)，通過(guò)芯片的入口(a)將細(xì)菌懸浮液添加到裂解腔(b)，RPA混合溶液添加至儲(chǔ)存腔(c)中，并將所有的進(jìn)出口都用膠帶密封。隨后把芯片放在定制的磁力攪拌器上，用芯片磁珠裂解法將細(xì)菌裂解。其次RPA混合物以100 r/min的轉(zhuǎn)速流動(dòng)到第一個(gè)虹吸閥(Ⅰ)，再將細(xì)菌裂解物以3 000 r/min流動(dòng)到定量室(d)中。將轉(zhuǎn)速降低至50 r/min， RPA混合溶液流動(dòng)到第二個(gè)虹吸閥(Ⅱ)中，同時(shí)裂解物也流動(dòng)至虹吸閥(Ⅲ)中，同時(shí)進(jìn)入混合腔(e)。調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速500 r/min至4 000 r/min使細(xì)菌裂解物與RPA混合液在混合腔進(jìn)行混合。最終調(diào)節(jié)1 000 r/min的轉(zhuǎn)速使溶液在等分腔(f)中等分，再以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速分配到各反應(yīng)腔室(g)中進(jìn)行實(shí)時(shí)RPA擴(kuò)增及熒光檢測(cè)。此方法能夠在39 ℃下反應(yīng)30 min從尿液樣品中成功檢測(cè)到大腸桿菌，變形桿菌，銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌。

(A) 食源性致病菌的檢測(cè)[30]

(B) 致病菌的檢測(cè)[31]

(C) 單病原菌檢測(cè)[35]

(D) 病原菌的檢測(cè)[36]圖2 離心式芯片與等溫?cái)U(kuò)增相結(jié)合

KIM T H等[32]研發(fā)出一種離心微流控驅(qū)動(dòng)檢測(cè)設(shè)備。在等溫?cái)U(kuò)增步驟中，可以通過(guò)單個(gè)激光二極管用于閥門(mén)驅(qū)動(dòng)、細(xì)胞裂解和非接觸無(wú)線控制的加熱功能，研發(fā)出緊湊而小型的系統(tǒng)。其能夠?qū)NA提取、等溫重組酶聚合酶擴(kuò)增和檢測(cè)的三個(gè)主要步驟一體化，可用于微量沙門(mén)氏菌核酸分析系統(tǒng)。

離心式微流體平臺(tái)與RPA結(jié)合使用時(shí)，RPA具有高靈敏度，故需要對(duì)于不同基因的引物和探針序列進(jìn)一步優(yōu)化防止非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增或檢測(cè)樣品被污染。由于離心式芯片添加樣品及檢測(cè)樣品的量均很小，需要考慮到擴(kuò)增、檢測(cè)方法的可行性及重復(fù)性。

2.2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)使用一對(duì)設(shè)計(jì)的引物(前向和后向內(nèi)引物)來(lái)生成兩端都帶有環(huán)的模板，借助前向和后向外部引物，使該雙端環(huán)狀模板將靶DNA序列置換。通過(guò)使用前向和后向內(nèi)部引物復(fù)制并延長(zhǎng)兩端環(huán)狀模板，將其用于下游擴(kuò)增[33]。由于復(fù)制和延伸可以同時(shí)進(jìn)行，DNA擴(kuò)增的速度增加。反應(yīng)使用四種引物和具有高抑制劑耐受性的Bst DNA聚合酶，僅需在60 min內(nèi)，60 ℃至70 ℃恒定溫度范圍內(nèi)下發(fā)生反應(yīng)[34]，可顯著提高了擴(kuò)增效率和特異性。

LOO J F C等[35]研究出集成的離心式核酸等溫?cái)U(kuò)增芯片，包括DNA提取、LAMP反應(yīng)和實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)。其設(shè)計(jì)創(chuàng)新點(diǎn)在于使用微球油脂被動(dòng)閥來(lái)控制流體的存儲(chǔ)和釋放。芯片的操作流程如圖2C所示：首先將微球、硅膠膜及蛋白酶K預(yù)存儲(chǔ)于芯片中(a)及加熱部分(g)，依次在進(jìn)樣腔(b)、結(jié)合液添加腔(c)、洗滌液添加腔(d)、洗脫液添加腔(e)、LAMP反應(yīng)添加液腔室(f)加入對(duì)應(yīng)溶液，每個(gè)腔室均使用各種具有不同開(kāi)啟壓力的微球油脂閥。其次調(diào)節(jié)300 r/min的轉(zhuǎn)速釋放樣品到(g)，與預(yù)存儲(chǔ)的蛋白酶K混合并加熱到56 ℃，實(shí)現(xiàn)細(xì)菌裂解。轉(zhuǎn)速增加至600 r/min，使結(jié)合液釋放到(g)與裂解樣品混合，并流動(dòng)至硅膠膜，DNA與硅膠膜結(jié)合；轉(zhuǎn)速增加至900 r/min，釋放洗滌液洗滌純化在二氧化硅上的DNA；轉(zhuǎn)速增加至1 200 r/min釋放洗脫液，將DNA從硅膠膜洗脫；最后，轉(zhuǎn)速增加至1 500 r/min，使純化的DNA流動(dòng)到LAMP反應(yīng)位點(diǎn)(f)，同時(shí)將LAMP反應(yīng)物與DNA進(jìn)行混合，在反應(yīng)腔(f)進(jìn)行LAMP擴(kuò)增及后續(xù)檢測(cè)反應(yīng)，其他緩沖液進(jìn)入廢液腔(h)。此芯片能夠在2 h內(nèi)檢測(cè)到痰液和血液中結(jié)核分枝桿菌和鮑曼不動(dòng)桿菌且最小檢測(cè)線為103和102CFU。但此方法的檢測(cè)平臺(tái)在通量方面具有局限性，運(yùn)行一次只能檢測(cè)一種樣品的一種目標(biāo)細(xì)菌，并且微球和油脂被動(dòng)閥的穩(wěn)定性較差，需要在實(shí)驗(yàn)中最大程度地減少油脂對(duì)分子診斷影響。

SAYAD A等[36]開(kāi)發(fā)了適用于單病原體檢測(cè)的離心式芯片，此芯片將LAMP與自動(dòng)無(wú)線終點(diǎn)檢測(cè)系統(tǒng)相結(jié)合。該離心式芯片設(shè)計(jì)包含一式六份的相同的功能單元，每個(gè)單元含有五個(gè)反應(yīng)腔對(duì)三種不同食源性病原體檢測(cè)。芯片的操作流程如圖2D所示：首先將蠟及密封材料(如石蠟油)分別注入蠟閥及密封材料腔(e)，并將DNA樣品及引物分別加入(a)的進(jìn)樣腔和緩沖液腔；以400 r/min的轉(zhuǎn)速將樣品與緩沖液通過(guò)微通道至混合腔中(b)進(jìn)行混合，再以600 r/min的轉(zhuǎn)速將混合好的試劑進(jìn)入等分腔(c)等分，過(guò)量的液體進(jìn)入廢液腔(d)。最終調(diào)節(jié)1 200 r/min轉(zhuǎn)速將液體轉(zhuǎn)移至反應(yīng)腔進(jìn)行LAMP反應(yīng)。由于LAMP反應(yīng)可能產(chǎn)生氣溶膠污染，因此采用融化蠟閥使密封材料腔(e)中液體流出，密封LAMP反應(yīng)環(huán)境。此芯片使用鈣黃綠素比色法檢測(cè)，僅需60 ℃下反應(yīng)60 min便能通過(guò)藍(lán)牙無(wú)線技術(shù)將檢測(cè)結(jié)果傳輸至智能手機(jī)，該檢測(cè)方法的最低檢測(cè)限為3×10-5ng/μL。

ZHANG L等[37]報(bào)告了一種手動(dòng)離心操控的離心式芯片，通過(guò)手工拉動(dòng)一組嚙合齒輪實(shí)現(xiàn)芯片的離心旋轉(zhuǎn)。此芯片將核酸純化與LAMP方法整合在一起，該芯片分為四層，包含一式八份的相同的檢測(cè)單元，每個(gè)檢測(cè)單元由四個(gè)檢測(cè)腔組成。此芯片采用將沸石預(yù)存儲(chǔ)于芯片內(nèi)方便核酸純化，再設(shè)計(jì)毛細(xì)管閥控制樣品與各腔室的連接，最終通過(guò)離心速度的調(diào)節(jié)逐級(jí)流動(dòng)。手動(dòng)離心機(jī)可將樣品通過(guò)不同離心力旋轉(zhuǎn)進(jìn)入檢測(cè)腔，使用無(wú)電方式同時(shí)檢測(cè)六種病原體。

離心式芯片與LAMP結(jié)合可有效實(shí)現(xiàn)集成化，小型化檢測(cè)，LAMP方法可在一個(gè)離心式芯片上實(shí)現(xiàn)多目標(biāo)檢測(cè)，此設(shè)計(jì)將具有重大價(jià)值，擁有很高的應(yīng)用前景。但LAMP引物多且設(shè)計(jì)復(fù)雜，需要進(jìn)一步的研究來(lái)改善引物特異性，并且其擴(kuò)增產(chǎn)物是一條長(zhǎng)DNA鏈，不適合鑒定目標(biāo)核酸的其他分子，且通用性較PCR低。

2.3 依賴(lài)核酸序列擴(kuò)增(NASBA)

依賴(lài)核酸序列擴(kuò)增(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)是一種以單鏈 RNA為模板，在恒溫條件下，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶、RNase H、T7 RNA聚合酶、正向引物和反向引物來(lái)模擬體內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制機(jī)制，對(duì)目標(biāo)RNA進(jìn)行擴(kuò)增，90 min內(nèi)可以將靶標(biāo)擴(kuò)增至1012，其產(chǎn)物長(zhǎng)度為100 bp～250 bp，靈敏度可達(dá)檢測(cè)單個(gè)拷貝的靶標(biāo)分子[38]，通過(guò)調(diào)整NASBA擴(kuò)增程序可以用于DNA的檢測(cè)，但需要反復(fù)開(kāi)管加入不同階段所需要的組分[39]。

DEIMAN B等[40]提出了使用非接觸加熱和熒光檢測(cè)技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)核酸體外擴(kuò)增的離心式芯片。通過(guò)實(shí)施基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)反應(yīng)，對(duì)流感嗜血桿菌的tmRNA轉(zhuǎn)錄，證明了離心式芯片功能。該系統(tǒng)實(shí)施非接觸式紅外加熱，在變性和擴(kuò)增步驟中將NASBA反應(yīng)加熱至所需的目標(biāo)溫度。該控制系統(tǒng)使用磁場(chǎng)進(jìn)行腔室定位，在所需位置進(jìn)行加熱和熒光檢測(cè)。流感嗜血桿菌tmRNA在系統(tǒng)上執(zhí)行的NASBA測(cè)定范圍為102～104個(gè)。

由于NASBA反應(yīng)需要兩個(gè)不同的溫度，RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的變性需要65 ℃，反應(yīng)孵育需要41 ℃，因此RPA反應(yīng)(37 ℃～42 ℃)和LAMP反應(yīng)(60 ℃～65 ℃)更常應(yīng)用于離心式芯片。且此方法擴(kuò)增步驟多，反應(yīng)體系較復(fù)雜，需要多次添加緩沖不易開(kāi)發(fā)集成性離心式檢測(cè)芯片。

3 總結(jié)及展望

離心微流控芯片不需要其它外部連接，能夠降低了樣品檢測(cè)過(guò)程中出現(xiàn)交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)，有效避免了處理生物危害性樣品的危險(xiǎn)，避免了擴(kuò)增后產(chǎn)物釋放有毒有害物質(zhì)等情況。因?yàn)殡x心微流控檢測(cè)儀體積小，方便攜帶，檢測(cè)時(shí)間短，測(cè)量精準(zhǔn)等優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)研究出在食品、醫(yī)療、環(huán)境等方面的離心式芯片。將離心微流控技術(shù)與核酸等溫?cái)U(kuò)增相結(jié)合，為現(xiàn)場(chǎng)短時(shí)間核酸檢測(cè)提供可能。

為了實(shí)現(xiàn)離心微流控技術(shù)在核酸等溫?cái)U(kuò)增一體化系統(tǒng)集成應(yīng)用，還需要一些改進(jìn)研究。第一， 在離心式芯片樣品制備中，最新技術(shù)僅允許從少量、簡(jiǎn)單的樣品中提取核酸，但不能處理更復(fù)雜的樣品(組織等)，因此，在芯片上處理復(fù)雜的樣品仍是一個(gè)緊迫的問(wèn)題；第二，在檢測(cè)過(guò)程中，許多步驟仍需手動(dòng)進(jìn)行樣品及緩沖液的添加，且對(duì)于部分液體試劑，缺乏芯片上長(zhǎng)期穩(wěn)定有效的預(yù)存儲(chǔ)方法；第三，目前離心式芯片制作需要微通道，預(yù)存儲(chǔ)，閥門(mén)設(shè)計(jì)，珠粒填充等步驟，需要高緊密度和準(zhǔn)確性，難以確保產(chǎn)業(yè)化的可重復(fù)性；第四，離心式芯片的自動(dòng)化程度還不高，應(yīng)開(kāi)發(fā)相應(yīng)檢測(cè)程序軟件幫助進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)更便捷、快速、準(zhǔn)確的測(cè)試結(jié)果。

未來(lái)微流控技術(shù)用于核酸檢測(cè)的發(fā)展趨勢(shì)在于：核酸檢測(cè)人員不需要經(jīng)過(guò)仔細(xì)的樣品收集和專(zhuān)門(mén)操作基本儀器的培訓(xùn)，便能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出結(jié)果；規(guī)?；圃炀哂械统杀?、高質(zhì)量的商業(yè)離心式芯片檢測(cè)產(chǎn)品，自動(dòng)化完成一系列測(cè)試反應(yīng)，后期能夠輕松進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，報(bào)告，保存和導(dǎo)出的集成性產(chǎn)品。