嚴(yán)茜茜，黃羅儀，王朝杰，向錚

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.溫州市第七人民醫(yī)院 藥劑科，浙江 溫州 325000）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種起病潛隱，病癥呈進(jìn)程性漸進(jìn)的神經(jīng)退行性疾病，具有記憶衰退，認(rèn)知惡化，執(zhí)行能力喪失以及行為改變等特性。在高齡人群中易生成癡呆，占全部癡呆類型的近60%[1]，嚴(yán)重降低當(dāng)代老年人生活質(zhì)量。AD病理復(fù)雜并伴多種代謝途徑共同參與[2]，其發(fā)病機(jī)制假說眾多，主要有膽堿能神經(jīng)元損傷機(jī)制[3]，β-淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)機(jī)制[4]、τ蛋白過度磷酸化機(jī)制。2020年4月，美國(guó)南加州大學(xué)凱克醫(yī)學(xué)院的研究團(tuán)隊(duì)又提出了新的血腦屏障破壞機(jī)制[5]。各機(jī)制之間相互聯(lián)系，互為影響，錯(cuò)綜復(fù)雜，尚無統(tǒng)一認(rèn)識(shí)。目前臨床用藥品種少，主要有美金剛、多奈哌齊、石杉?jí)A甲、卡巴拉汀、加蘭他敏五種藥物，且療效有限，對(duì)治療AD新藥的研制有迫切需求。結(jié)構(gòu)決定性質(zhì)，對(duì)于已上市藥物的結(jié)構(gòu)研究可以更好地幫助我們了解藥物的本質(zhì)。理論方法是銜接分子結(jié)構(gòu)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果的橋梁，理論計(jì)算幫助我們從分子水平理解宏觀性質(zhì)。這五種抗AD藥物在油性狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，系統(tǒng)的整體和局部反應(yīng)性描述未見報(bào)道，在模擬大腦環(huán)境下的計(jì)算研究將更助于本課題組從分子水平上理解抗AD藥物的作用機(jī)制。

1 材料和方法

采用密度泛函理論（density functional theory，DFT）中雜化泛函B3LYP[6]方法，在TZVP基組水平上對(duì)五種藥物進(jìn)行幾何結(jié)構(gòu)優(yōu)化和電子結(jié)構(gòu)計(jì)算，在此基礎(chǔ)上獲得分子表面靜電勢(shì)（molecular electrostatic potential，MEP）、紫外-可見光譜（UV-Vis）和概念密度泛函系列指數(shù)?？紤]到藥物作用大腦環(huán)境，采用環(huán)己烷為溶劑進(jìn)行模擬，運(yùn)用導(dǎo)體極化連續(xù)模型（conductor-like polarizable continuum model，CPCM）進(jìn)行模擬計(jì)算，計(jì)算工作通過G16[7]程序包完成，圖像借助Gaussian View 6.0和Multiwfn3.6[8]軟件進(jìn)行分析和繪制。

2 結(jié)果

2.1 幾何結(jié)構(gòu)分析 將五種藥物在B3LYP/TZVP水平下優(yōu)化，得到最穩(wěn)定構(gòu)象及部分鍵長(zhǎng)見圖1。五種藥物均具有環(huán)狀疏水結(jié)構(gòu)，如芐基、吡啶、苯環(huán)等，這與抗AD藥物需要通過血腦屏障，具有一定的親油性相吻合，可見抗AD藥物有一定的結(jié)構(gòu)共性，而分子本身結(jié)構(gòu)的差異，又導(dǎo)致了其作用機(jī)制的不同。觀察五種藥物分子極性鍵的情況，以美金剛C4-N13為基準(zhǔn)，當(dāng)C原子上連有苯環(huán)時(shí)，C-N鍵長(zhǎng)稍有縮短，加蘭他敏C14-N15與多奈哌齊C17-N14鍵長(zhǎng)均為1.459?。當(dāng)C原子雙鍵連接O原子時(shí)，C-N鍵長(zhǎng)縮短更加明顯，石杉?jí)A甲C12-N13為1.400?，而卡巴拉汀C4-N3為1.354?，相較之下鍵長(zhǎng)更短，鍵能更高。由于N原子上的孤對(duì)電子與苯環(huán)的π電子形成了共軛效應(yīng)，使得兩個(gè)原子結(jié)合得更牢固，這種類似于肽鍵的結(jié)構(gòu)印證了在N3-C4-O16之間存在共軛。朱維良等[9]等運(yùn)用量子化學(xué)計(jì)算石杉?jí)A甲單分子狀態(tài)的鍵長(zhǎng)數(shù)據(jù)顯示C12-O14為1.217?，C2-N18為1.538?，N13-H29為0.997?，而形成石杉?jí)A甲-乙酰膽堿酯酶（acetylcholine esterase，AChE）復(fù)合物后C12-O14為1.256?，C2-N18為1.477?，N13-H29為1.030?。我們?cè)贐3LYP/TZVP水平計(jì)算得到的數(shù)據(jù)與石杉?jí)A甲單分子狀態(tài)進(jìn)行比較，最大鍵長(zhǎng)差為0.066?，與形成石杉?jí)A甲-AChE復(fù)合物后比較，最大鍵長(zhǎng)差為0.024?。計(jì)算數(shù)據(jù)與形成復(fù)合物后的數(shù)據(jù)更相近。陳衛(wèi)民等[10]通過單晶X-射線測(cè)定了卡巴拉汀晶體結(jié)構(gòu)，測(cè)得N13-C18為1.490?，N13-C12為1.525?，C6-O5為1.405?，C4-O5為1.360?，C4-O16為1.203?，與理論計(jì)算值相比，最大鍵長(zhǎng)差為0.049?。RAVIKUMAR等[11]測(cè)得多奈哌齊晶體結(jié)構(gòu)中C1-O25為1.364?，C2-O26為1.354?，C9-O24為1.220?，C8-C10為1.519?，C7-C8為1.537?，C10-C11為1.538?，C17-C18為1.500?，C17-N14為1.504?，與理論計(jì)算值相比，最大鍵長(zhǎng)差為0.045?。理論數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)相近。

2.2 MEP分析 MEP是量子化學(xué)用于研究分子反應(yīng)性、分子與受體相互作用及其他現(xiàn)象的重要工具。通過MEP能直觀感受到電子云分布狀態(tài)，預(yù)測(cè)分子親核親電反應(yīng)活性位點(diǎn)。五種藥物在B3LYP/TZVP水平下的MEP見圖2，美金剛整體含一處負(fù)的靜電勢(shì)，分布在氮原子周圍，最小極值點(diǎn)亦在N13附近，其他部分呈正的靜電勢(shì)。加蘭他敏整體有3處含負(fù)的靜電勢(shì)，主要分布在氧原子和氮原子周圍。最小極值點(diǎn)在醚氧鍵和羥基附近，最大極值點(diǎn)在羥基附近。石杉?jí)A甲整體有兩處含有負(fù)的靜電勢(shì)，分別在氧原子和氮原子上，最大極值點(diǎn)在N13附近而最小極值點(diǎn)在O14附近。多奈哌齊整體有三處含有負(fù)的靜電勢(shì)，為茚酮部分、芐基部分和甲氧基部分。最小極值點(diǎn)在O24附近，最大極值點(diǎn)在C3附近。卡巴拉汀整體有兩處含有負(fù)的靜電勢(shì)，分別在氮原子及氨基甲酸酯部分，最大極值點(diǎn)在N3附近，最小極值點(diǎn)在O16附近。擁有不同電性部位導(dǎo)致了五種藥物分子理化性質(zhì)的差異。

圖1 五種抗AD藥物在B3LYP/TZVP水平下的幾何結(jié)構(gòu)及部分鍵長(zhǎng)數(shù)據(jù)（?）

有研究表明加蘭他敏的羥基能夠以氫鍵的形式與酶發(fā)生作用[12]，多奈哌齊吡啶環(huán)中的N質(zhì)子化后可以在AChE的通道部分產(chǎn)生陽離子-π作用，同時(shí)與水產(chǎn)生氫鍵。石杉?jí)A甲羰基氧與AChE催化活性位點(diǎn)（catalytic active site，CAS）形成氫鍵，氨基上的氮原子在AChE的通道部分形成氫鍵。氫鍵本質(zhì)是強(qiáng)極性鍵上的氫原子與帶有負(fù)電荷的原子之間的靜電作用力，對(duì)于生物高分子反應(yīng)有著重要的意義。而對(duì)于富含芳香環(huán)氨基酸的AChE來說，這五種藥物也含有豐富的芳香環(huán)，因此發(fā)生在芳環(huán)之間的π-π堆積作用，與氫鍵一樣是重要的非共價(jià)鍵形式。研究表明加蘭他敏環(huán)己烯上的雙鍵與AChE的CAS位點(diǎn)形成π-π疊加[13]，多奈哌齊芐基部分可與AChE的CAS位點(diǎn)產(chǎn)生π-π堆積，茚酮部分與AChE外周陰離子位點(diǎn)（peripheral anionic site，PAS）形成π-π堆積[14]。結(jié)合五種藥物的MEP不難發(fā)現(xiàn)電性差異決定了分子間作用力、作用位點(diǎn)的不同，電性極值點(diǎn)往往對(duì)應(yīng)藥物與酶作用的位點(diǎn)，這對(duì)改變蛋白質(zhì)構(gòu)象具有關(guān)鍵性的作用，是反應(yīng)核心。石杉?jí)A甲的合成研究也驗(yàn)證了這一點(diǎn)，天然提取的石杉?jí)A甲構(gòu)型為左旋的單一對(duì)映體，唐希燦等[15]將其對(duì)映異構(gòu)體、外消旋體對(duì)AChE的抑制活性與之進(jìn)行比較后認(rèn)為右旋異構(gòu)體活性和選擇性都大為降低是由于構(gòu)型不匹配，環(huán)外亞乙基甲基的氫無法與酶形成有效氫鍵。

圖2 五種抗AD藥物在B3LYP/TZVP水平下的MEP圖

2.3 前線分子軌道分析 前線分子軌道（frontier molecular orbital，F(xiàn)MO）理論將分子周圍排布的電子云根據(jù)能量細(xì)分為不同能級(jí)的分子軌道，指出其中的最高占據(jù)軌道（highest occupied molecular orbital，HOMO）簡(jiǎn)稱H，最低空軌道（lowest unoccupied molecular orbital，LUMO）簡(jiǎn)稱L，是決定一個(gè)體系發(fā)生反應(yīng)的關(guān)鍵?！鳓牛↙-H）表示HOMO與LUMO的能差，反應(yīng)了分子形成過渡態(tài)所需的能壘大小，差值越小，則能壘越小，越容易發(fā)生反應(yīng)，化合物活性也就越高。

五種藥物的HOMO、LUMO及能差見表1，由表1可知，四種抗AChE藥物之間略有差異，但活性明顯高于N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR）拮抗劑美金剛。根據(jù)FMO，五種藥物可能的反應(yīng)性順序?yàn)槎嗄芜啐R＞石杉?jí)A甲＞卡巴拉?。炯犹m他敏＞美金剛。

表1 五種抗AD藥物分子的最高占據(jù)軌道和最低空軌道能及其能差

2.4 紫外-可見吸收光譜分析 五種藥物UV-Vis數(shù)據(jù)見表2，美金剛的UV-Vis存在兩個(gè)吸收峰，141.0 nm 處吸收強(qiáng)度大，躍遷類型屬于σ→σ*躍遷。美金剛化學(xué)結(jié)構(gòu)獨(dú)特，分子結(jié)構(gòu)中無共軛雙鍵，一般紫外-可見分光光度計(jì)只能提供190～850 nm范圍的單色光，因此在紫外區(qū)實(shí)驗(yàn)無法觀測(cè)到，但是我們的理論計(jì)算能夠提供UV-Vis數(shù)據(jù)。其余四種抗AChE藥物的最大吸收峰落在179～208 nm之間，躍遷形式均為π→π*躍遷。李霞等[16]測(cè)得甲醇溶液中加蘭他敏在289nm處有最大吸收。王曉燕[17]對(duì)氫溴酸加蘭他敏標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行紫外掃描結(jié)果顯示，在322、254及289 nm處有較強(qiáng)吸收。LIU等[18]測(cè)得乙醇溶液中石杉?jí)A甲在231和313 nm處有最大吸收。胡征[19]測(cè)得多奈哌齊在甲醇溶液中206.6 nm處有最大吸收，強(qiáng)度為0.921，在0.1 mol/L的HCl溶液中207.4 nm處有最大吸收，強(qiáng)度為1.212。王晗寧[20]測(cè)得溶劑為乙酸乙酯時(shí)，多奈哌齊在264和315 nm處分別有吸收，其中264 nm處有最強(qiáng)吸收峰。郭淼[21]測(cè)得甲醇溶液中卡巴拉汀最大吸收波長(zhǎng)210 nm，且在262 nm處有一個(gè)特征吸收峰。比較可知隨溶液極性增加化合物吸收強(qiáng)度增大，整體發(fā)生紅移現(xiàn)象。

表2 五種藥物紫外吸收光譜數(shù)據(jù)

2.5 概念密度泛函分析 概念密度泛函理論適用于多電子體系結(jié)構(gòu)的量子力學(xué)分析，是DFT的重要的分支，它把與化學(xué)相關(guān)的概念和原理從密度泛函中抽取出來，通過理論推導(dǎo)獲得計(jì)算參數(shù)，賦予了從前已知意義但是相對(duì)模糊的化學(xué)概念一個(gè)相對(duì)精確的描述。提出了全局反應(yīng)性指數(shù)，包括：電離勢(shì)（IP）、電子親和勢(shì)（EA）、化學(xué)勢(shì)（μ）、電負(fù)性（χ）、整體硬度（η）、整體柔軟度（S）和整體親電指數(shù)（ω）。

五種藥物的全局反應(yīng)性指數(shù)見表3。μ和η能體現(xiàn)分子的穩(wěn)定狀態(tài)，五種藥物的η相差不大且皆為正值，表明對(duì)微干擾下化學(xué)體系電子云畸變的抵抗能力較強(qiáng)。多奈哌齊μ最低而加蘭他敏μ最高，表明多奈哌齊更穩(wěn)定。多奈哌齊的χ和ω較大，說明其得電子能力強(qiáng)。S反映了分子周圍電子云分布情況，能體現(xiàn)化合物的反應(yīng)活性，由S判斷藥物活性順序?yàn)槎嗄芜啐R＞石杉?jí)A甲＞加蘭他敏＞卡巴拉?。久澜饎偂｀嵡宕ǖ萚22]運(yùn)用人類乙酰膽堿酯酶與抑制劑小分子對(duì)接后發(fā)現(xiàn)與AChE相互作用的強(qiáng)弱順序?yàn)槎嗄芜啐R＞石杉?jí)A甲＞卡巴拉汀，與我們由S判斷的活性順序相一致。在多奈哌齊、卡巴拉汀和加蘭他敏治療AD的安全性和耐受性比較研究中發(fā)現(xiàn)，多奈哌齊相較于其他兩種藥物胃腸道不良反應(yīng)發(fā)生率更低，三種藥物中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)不良反應(yīng)均較少發(fā)生，臨床應(yīng)用多奈哌齊的依從性更好[23]。

在概念密度泛函中引入福井函數(shù)，以衡量當(dāng)總電子數(shù)或外部化學(xué)勢(shì)發(fā)生變化時(shí)的電子密度差異。為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)藥物分子活性情況對(duì)五種藥物進(jìn)行了福井函數(shù)計(jì)算。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，美金剛的親核部位具有偏向性，主要在N原子上連接氫原子的一側(cè)以及底部下方的位置，親電部位則不具偏向性，均勻分布在整個(gè)分子表面。加蘭他敏的親核部位同樣具有偏向性，主要分布于右下側(cè)苯環(huán)上，親電部位則偏向于右側(cè)苯環(huán)以及上方N原子部位。石杉?jí)A甲的親核部位偏向于左邊的吡啶環(huán)上，親電部位則均勻分布于整體分子。多奈哌齊的親核部位主要位于左側(cè)茚酮結(jié)構(gòu)上，親電部位主要在右邊吡啶環(huán)一側(cè)?？ò屠∮H核部位主要在中間苯環(huán)上，親電部位主要在右邊氨基甲酸酯結(jié)構(gòu)，見圖3。

圖3 五種抗AD藥物的福井函數(shù)圖

五種藥物分子親電位置的差異與他們結(jié)構(gòu)中是否帶有富余的電子密切相關(guān)。相對(duì)親電指數(shù)最大值分別為美金剛H14位4.730，加蘭他敏C5位6.391，石杉?jí)A甲C10位2.923，多奈哌齊C9位23.071，卡巴拉汀C8位25.006。結(jié)合相對(duì)親電指數(shù)來看，多奈哌齊和卡巴拉汀親電能力強(qiáng)，美金剛、加蘭他敏和石杉?jí)A甲親電能力較弱。親核位置的差異不僅與分子所帶電荷量相關(guān)，而且與分子結(jié)構(gòu)的空間位置阻力也有著密切的聯(lián)系，相對(duì)親核指數(shù)最大值分別為美金剛N13位12.514，加蘭他敏N15位203.804，石杉?jí)A甲C8位2.602，多奈哌齊N14位152.297，卡巴拉汀N13位86.031。結(jié)合相對(duì)親核指數(shù)來看，加蘭他敏、多奈哌齊、卡巴拉汀的親核能力強(qiáng)，美金剛和石杉?jí)A甲親核能力較弱。

表3 五種抗AD藥物在B3LYP/TZVP水平下的全局反應(yīng)性指數(shù)

3 討論

本研究在B3LYP/TZVP水平對(duì)美金剛、加蘭他敏、石杉?jí)A甲、多奈哌齊和卡巴拉汀的分子結(jié)構(gòu)、電子結(jié)構(gòu)、UV-Vis以及概念密度泛函進(jìn)行分析，結(jié)構(gòu)分析比較出形成電子共軛效應(yīng)使得極性鍵鍵長(zhǎng)縮短。同時(shí)顯示計(jì)算數(shù)值與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)吻合較好，表明借助DFT在B3LYP/TZVP水平可較好的研究抗AD藥物。電子結(jié)構(gòu)分析顯示電性差異決定了分子間作用位點(diǎn)不同，特別是電性極值點(diǎn)，往往對(duì)應(yīng)著與蛋白質(zhì)形成非共價(jià)鍵的位置，是藥物作用的關(guān)鍵，這對(duì)今后抗AD藥物作用位點(diǎn)研究可以提供一定的指導(dǎo)作用。前線軌道分析顯示五種藥物中四種抗AChE藥物活性略有差異但明顯高于NMDAR拮抗劑，UV-Vis分析結(jié)果顯示溶劑效應(yīng)使分子的吸收波長(zhǎng)發(fā)生紅移且吸收強(qiáng)度增強(qiáng)。全局反應(yīng)性指數(shù)表明多奈哌齊為五種抗AD藥物中軟度最大、電負(fù)性最大、親電指數(shù)最大、化學(xué)勢(shì)最低的藥物，藥理作用最強(qiáng)。由福井函數(shù)結(jié)合相對(duì)親電指數(shù)與相對(duì)親核指數(shù)得出多奈哌齊和卡巴拉汀親電、親核能力都很強(qiáng)，加蘭他敏親核能力強(qiáng)，美金剛和石杉?jí)A甲親電、親核能力均比較弱。本研究結(jié)果為深入探索抗AD藥物作用機(jī)制以及藥物活性比較提供一定的計(jì)算支持。