蔡碧蓮，文亦磊，羅偉生△

1.廣西中醫(yī)藥大學（南寧530001）；2.廣西中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院（南寧530023）

肝纖維化是指肝臟在受到各種因素，如生物、化學、物理等因素的損傷作用下，細胞外基質(zhì)異常合成增多與降解不足所引起的病理過程。當這一病理過程持續(xù)發(fā)展，肝小葉的結(jié)構(gòu)會發(fā)現(xiàn)改變，隨之而來的是結(jié)節(jié)及假小葉的形成，最終會發(fā)展為肝硬化甚至肝癌。因此，在“肝炎-肝硬化-肝癌”這三個環(huán)節(jié)中，肝纖維化起著非常關(guān)鍵的作用。據(jù)文獻報道［1］，治療肝纖維化的有效方法為清除病毒、減少致病因素對肝細胞的損傷，從而恢復肝臟正常結(jié)構(gòu)和功能。研究表明［2］，在肝臟受到輕度損傷的情況下，若積極治療和調(diào)護，肝纖維化是可逆的。大鼠肝纖維模型的建立，是研究肝纖維化的發(fā)病機制、發(fā)生發(fā)展病理過程的首要前提，也是為臨床研究中醫(yī)藥防治肝纖維化的基礎。

1 四氯化碳對肝損傷的作用機制

四氯化碳（Carbon tetrachloride，CCl4），別名四氯甲烷，是一種極易揮發(fā)且會使人產(chǎn)生愉悅感的無色透明液體。與水互不相溶，但在某些有機溶劑中有較好的溶解性，如脂肪、油類等?？捎煽诒?、咽喉、食道和皮膚吸收。正是因為它可對肝臟產(chǎn)生毒性作用，使肝細胞結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生改變，甚至引起肝細胞凋亡壞死。因此作為誘導大鼠肝損傷模型，它是最為常用的化學溶劑［3］。據(jù)文獻報道［4］，CCl4屬于自由基毒理學-肝毒物作用機制中的直接肝毒物，其作用原理:①CCl4直接作用于細胞膜、細胞器膜，引起膜脂質(zhì)發(fā)生過度氧化、膜蛋白發(fā)生變性、膜結(jié)構(gòu)遭到損傷，從而使肝細胞壞死。②CCl4穿透過線粒體膜，隨后線粒體膜發(fā)生腫脹變形后導致脂肪酸β一氧化碳降低，由于脂肪酸得不到氧化作用，則會轉(zhuǎn)化為甘油三酯，脂類物質(zhì)沉積在細胞質(zhì)之中，從而引起細胞發(fā)生脂肪變性。③在細胞色素酶P4502E1（CYP2E1）的誘導作用下的CCl4降解為CCl3—，引起肝小葉中央?yún)^(qū)的肝細胞發(fā)生凋亡壞死，與此同時吞噬細胞和炎性細胞清除壞死區(qū)域，肝星形細胞轉(zhuǎn)化為成肌纖維細胞，促進纖維化的發(fā)生。

2 構(gòu)建肝纖維化大鼠模型與皮下注射四氯化碳的時間和劑量

根據(jù)藥理學和代謝學的研究［5］，CCl4進入大鼠體內(nèi)2 h后，肝功能指標會明顯升高直至24 h 后達到最大值，而后降低，至72 h后恢復正常?；谶@一代謝原理，2次／周進行肝纖維化模型構(gòu)建被許多實驗者所采納。根據(jù)CCl4的毒性藥理學研究發(fā)現(xiàn)［6］，在一次皮下注射建模過程中，肝臟受到損傷的過程是發(fā)生在第6、24小時，而肝臟修復的階段是在第48小時至2周，在12周內(nèi)則會引起肝纖維化形成。因此，8～10周是常規(guī)構(gòu)建肝纖維化大鼠模型的周期。大多數(shù)實驗者都選用橄欖油、花生油等油脂溶液溶解CCl4?？诜?、吸入、皮下注射、腹腔注射［7］是目前實驗者經(jīng)常選擇的造模方式。有實驗研究表明［8］，考慮給藥途徑、時間和劑量的不同，肝細胞損傷和炎癥反應也不同，模型建成的周期亦不同，但在第6～9周時，基本可見纖維化形成。王曉紅等［9］采用劑量為0.3 ml／100 g的50%CCl4植物油溶液皮下注射大鼠，2次／周，發(fā)現(xiàn)大鼠肝臟炎癥和纖維組織增生程度，與實驗周期有關(guān)。20周后，大鼠正常肝小葉結(jié)構(gòu)消失，纖維組織增生，可伴有纖維橋連，或形成假小葉。

3 構(gòu)建肝纖維化大鼠模型與四氯化碳注射方式的選擇

有研究發(fā)現(xiàn)［10］，腹腔注射CCl4后檢測生化指標，4～6 h后血清ALT、AST 值較前升高至5～6倍，在24 h后開始下降，提示腹腔注射CCl4的吸收速度快。腹腔注射CCl4常發(fā)生皮膚潰爛，而且其導致的死亡率也明顯高于皮下注射［11］。因此，雖然腹腔注射比皮下注射吸收速度快，但若是實驗者操作不夠嫻熟，可能誤將CCl4注射至腹腔內(nèi)的其他臟器，反而會影響實驗結(jié)果。綜合考慮到以上各種情況，從大鼠的存活率、死亡率、成模率等因素來分析，在注射方式的選擇上，通過皮下注射CCl4進行肝纖維化大鼠造模，其存活率、成模率比腹腔注射高，而死亡率比腹腔注射低。這樣一來，使實驗數(shù)據(jù)更加可信，也縮短了總的實驗時間，并且能減少不必要的實驗消耗。

4 注射方式與大鼠一般情況

安禎祥等［12］實驗發(fā)現(xiàn)，在構(gòu)建模型前，各組大鼠的體質(zhì)量差異并無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；在構(gòu)建肝纖維化大鼠模型過程中，發(fā)現(xiàn)腹腔注射造模組大鼠一般情況較差，精神不振，反應遲鈍，行為遲緩，納差，皮毛枯燥無光澤，體質(zhì)量增長緩慢，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與之相反的皮下注射造模組一般情況較好，精神可，反應較靈敏，行為激進，食量較多，體質(zhì)量有增長的幅度，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。造成此差異的原因可能是注射CCl4后大鼠肝臟細胞發(fā)生炎癥或壞死凋亡，進而引起形態(tài)、行為上的改變。張磊等［13］研究發(fā)現(xiàn)，皮下注射50%CCl4混合溶液，在用藥第6周后，大鼠的一般情況逐漸好轉(zhuǎn)，考慮可能與大鼠對CCl4混合溶液毒性藥物產(chǎn)生的耐受相關(guān)。從大鼠的一般情況進行考量，皮下注射的造模方式優(yōu)于腹腔注射。

5 皮下注射四氯化碳與肝纖維化檢測指標

在建模第10 周后，取腹主動脈血，檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、III型前膠原（PCⅢ）、IV 型膠原（IV-C）、層粘連蛋白（LN）及透明質(zhì)酸酶（HA）含量，切取肝組織做病理學檢查，進行蘇木精-伊紅（HE）及Masson染色，病理觀察。按照《病毒性肝炎防治方案》［14］，通過顯微鏡觀察肝細胞炎癥及纖維化增生程度，以肝纖維化分期標準進行分期，直至肝纖維化分期達2期以上，即說明大鼠肝纖維化模型構(gòu)建成功。陳剛等［15］通過實驗觀察發(fā)現(xiàn)，上述大鼠血清學指標與肝纖維化程度呈正相關(guān)關(guān)系。換言之，大鼠肝纖維化程度越嚴重，則其血清學指標也會呈遞增趨勢。在病理切片中顯示早期肝硬化（S4期）的時候，血清指標呈遞增趨勢，肝功能和肝組織損傷程度也隨之加重?？紤]這些血清指標可能是細胞外基質(zhì)沉積與降解的綜合反映。由于細胞外基質(zhì)的降解作用尚未降低，內(nèi)皮細胞修復功能尚未受到破壞，所以在S1～S2期血清指標上升幅度較小。同理推測，S3、S4期的血清指標會出現(xiàn)明顯上升，是因為細胞外基質(zhì)合成出現(xiàn)異常，內(nèi)皮細胞功能受損，導致細胞外基質(zhì)的降解也出現(xiàn)異常。雖然兩者有一定的聯(lián)系性，但上述血清指標并不能準確區(qū)分S1、S2、S3、S4期的肝纖維化程度。但其中，有幾項數(shù)值的變化，可推測注射CCl4后大鼠肝臟的改變。如:AST 數(shù)值的升高，反映了肝細胞線粒體受到一定程度的損傷；ALT 數(shù)值的升高，則是反映肝臟合成功能受到一定的破壞。

6 停止四氯化碳注射與大鼠肝纖維化的發(fā)展趨勢

有研究發(fā)現(xiàn)［16］，停止注射CCl4的大鼠，其肝纖維化有自愈的趨勢。還有實驗發(fā)現(xiàn)［17］，造模到達肝纖維化后，大鼠行為狀態(tài)并未出現(xiàn)明顯的變化，也沒有明顯的肝硬化癥狀（腹水、肝功能異常），但停止注射CCl4一段時間后，通過解剖大鼠腹腔，僅見少許腹水等肝功能失代償?shù)谋憩F(xiàn)。出現(xiàn)嚴重的肝纖維化甚至肝硬化，可能是因為CCl4注射劑量過多或者建模周期過長所導致。

7 構(gòu)建大鼠肝纖維化過程中大鼠死亡的原因

在構(gòu)建大鼠肝纖維化模型過程中，大鼠的死亡是不可避免的，若是死亡率過高，則會影響實驗結(jié)果，造成實驗結(jié)果誤差，從而影響實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計。所以分析并總結(jié)大鼠死亡原因在所難免。原因如下:①若是在建模過程中，由于操作不當，原本是皮下注射卻不慎將CCl4注入血管使CCl4進入血液循環(huán)，引起急性中毒，大鼠會在數(shù)分鐘后出現(xiàn)死亡。②未按照相應體重注射相應劑量的CCl4，導致輸入劑量過大，或CCl4濃度過高，也可引起大鼠死亡。③因個體的差異，耐受力的不同，在24 h后肝臟損傷達到高峰期，若大鼠發(fā)生急性肝衰竭，在2～3 d也會出現(xiàn)死亡。④因CCl4是有毒溶劑，注射創(chuàng)口易發(fā)生潰爛，甚至傷及至腹膜或腹腔臟器，從而引起大鼠感染致死。⑤注射CCl4導致大鼠性情改變，發(fā)生撕咬行為，也會致使大鼠感染而亡。因此，在實驗過程中應及時總結(jié)分析大鼠死亡原因，盡量避免在后續(xù)實驗過程中再出現(xiàn)大批量的死亡，為實驗順利進行及實驗結(jié)果的可靠性打下良好的基礎。

8 前景與展望

是否能成功地構(gòu)建大鼠肝纖維化模型是研究肝纖維化的發(fā)病機制、發(fā)病經(jīng)過及如何治療肝纖維化的重要前提條件。實驗者通過以下方法，構(gòu)建大鼠肝纖維化模型，如:運用刀豆素A［18］，膽 管結(jié) 扎 術(shù)［19-20］，注 射 豬 血 清 或 人 血 白 蛋 白［21-22］，血 吸蟲［23］，酒精［24］、四氯化碳［25］，這些實驗方式，分別會引起免疫性肝損害，膽汁郁積，自身免疫性肝纖維化，感染，中毒性肝損害，從而形成肝纖維化模型。CCl4所構(gòu)建的肝纖維化動物模型是這些方法中造價成本相對低廉且實施方法相對簡易，并且是最經(jīng)典、最早、運用最廣泛、也最受實驗者和研究者鐘愛的方法之一。其中皮下注射CCl4進行造模，操作簡易，大鼠死亡率低，成模率高，與自然生活環(huán)境更貼近，便于研究抗肝纖維化作用機制，因而更廣泛應用。但由于CCl4是有毒溶劑，又因造模周期長，在用藥時要注意中毒劑量和觀察大鼠活動狀態(tài)，也因CCl4有自愈趨勢，應根據(jù)實驗情況隨時予以調(diào)整，這方面值得進一步深入研究。