龐 碩 綜述 孔德陽 審校

順鉑(CDDP)作為臨床高效廣譜抗癌藥物，其腎臟轉運受近端小管轉運蛋白調(diào)節(jié)，在腎近端小管上皮細胞(proximal tubular epithelial cells，PTECs)蓄積致細胞發(fā)生炎癥、損傷和死亡，使30%～40%接受CDDP治療患者遭受腎毒性[1]：表現(xiàn)為急性腎損傷(AKI)，血清鈉、鎂丟失及尿液濃縮功能障礙等；其中，AKI是CDDP誘導腎毒性的主要并發(fā)癥。一些生物標志物[如中性粒細胞明膠酶相關脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)、腎損傷分子1(KIM-1)及胱抑素C(CysC)等]已應用于AKI臨床及基礎研究檢測。然而，受患者年齡、性別及原發(fā)病等因素影響，尚無一個AKI生物標志物被普遍應用于常規(guī)臨床實踐。

盡管，應用嚙齒類動物對CDDP-AKI進行了積極的基礎研究，迄今為止，為建立易于檢測的現(xiàn)有生物標志物的嚙齒類動物AKI模型，CDDP仍需大劑量給藥，致模型與臨床病例尚存差異。因而，進一步尋找新型AKI生物標志物，完善動物模型并確定治療新分子靶標至關重要。最近，該領域擴展了CDDP-AKI模型的類型，活性氧(ROS)和線粒體功能障礙所特有的CDDP誘導的損傷發(fā)病機制，特別是細胞死亡途徑、炎癥反應、自噬以及Klotho等在AKI中的作用。

CDDP的腎臟代謝

CDDP在PTECs濃度近5倍于血液濃度[2]，非毒性劑量的血液濃度可在腎臟達到毒性標準，嚴重損傷腎小管S3段致腎臟失功。CDDP細胞攝取受腎小管基膜側內(nèi)流蛋白影響，如有機陽離子轉運蛋白(OCTs)和銅離子轉運體(CTRs)；CDDP分泌進入尿液受頂端定位的外排轉運蛋白調(diào)節(jié)，如多藥耐藥相關蛋白(MRPs)及多抗菌擠壓蛋白(MATEs)等。上述轉運蛋白在腎小管高表達，CDDP給藥后表達與定位均發(fā)生異常，靶向抑制或激活上述轉運蛋白已成為CDDP-AKI治療的新方向。西咪替丁可競爭性抑制腎臟OCTs，被推測有腎保護作用，然這一理論在利用馬丁大比犬腎細胞進行的研究中未得到證實[3]。CDDP抗癌治療作用受表達在癌癥細胞轉運蛋白調(diào)節(jié)，因此利用腫瘤鼠模型檢測靶向CDDP轉運蛋白腎保護作用的治療十分重要。

血清鎂作為CDDP轉運蛋白表達的關鍵調(diào)節(jié)者，在CDDP治療后濃度顯著降低。鎂缺陷時，外排轉運蛋白表達降低使CDDP蓄積在腎小管細胞，AKI易感性增加。Kumar等[4]報道，補充鎂發(fā)揮CDDP抗癌作用同時降低AKI發(fā)生率。

CDDP-AKI模型建立

非合并腫瘤模型當前，CDDP-AKI研究主要應用兩種腎毒性嚙齒類動物模型，即短期高劑量和長期低劑量方案：前者單次大劑量CDDP 20～30 mg/kg給藥，3～7d后導致腎毒性；后者在3～4周內(nèi)CDDP 5～15 mg/kg 給藥，2～4次。模型鼠多應用 6～10周齡雄性C57BL/6小鼠，然而，雌性C57BL/6小鼠注射CDDP后更易誘導AKI發(fā)生[5]。此外，與幼齡大鼠相比，16～17月齡大鼠CDDP-AKI易感性更高。模型均使用血清肌酐(SCr)，尿素氮(BUN)，CysC，KIM-1，NGAL及CC趨化因子配體2(CCL2)等作為檢測指標；新型生物標志物[5-6]，如尿液腎特異性miRNA，給藥18h后升高；尿液Wnt4及ARL13B，給藥后24h升高。

合并腫瘤模型非合并腫瘤模型是了解CDDP-AKI炎癥，細胞凋亡，ROS和細胞群介導炎癥致病機理的基礎，但兩種模型還原患者臨床實際方面尚存不足。如，CDDP在實體腫瘤患者是以低于10 mg/kg劑量長期給藥[7]。然而，大鼠模型很少持續(xù)應用CDDP低于10 mg/kg，且未納入對合并腫瘤AKI大鼠模型的研究。某些小鼠品系對腎毒性物質(zhì)更具耐受力，需要超出臨床相關劑量才能產(chǎn)生類似CDDP-AKI表型，從而突出了臨床相關小動物模型的改進空間及從基礎到臨床轉化的固有困難。

圍絕經(jīng)期婦女接受CDDP抗癌治療AKI發(fā)病率遠高于同齡男性；當前動物模型中在年齡和性別上均未體現(xiàn)；迄今，探究癌癥患者CDDP-AKI 的預防性治療甚少。因此，更適用的動物模型(即接受常用劑量方案合并腫瘤的高齡小鼠)將大大改善模型的可重復性。進行預防或干預性研究，解決CDDP-AKI的病理生理并解釋性別和體內(nèi)腫瘤關系非常重要。

合并腫瘤的CDDP-AKI模型多是同種異體移植模型，宿主具有免疫功能，移植潛伏期短，由于缺乏小鼠細胞系而受限[8]，如鼠源性EL4淋巴瘤細胞、H22肝細胞癌及CMT167肺腺癌等。在快速 CDDP-AKI 模型中，同種異體移植需要7～10 d形成實體瘤。腫瘤形成后，單劑 CDDP 20～25 mg/kg 給藥；長期模型允許在快速 CDDP-AKI中觀察到腫瘤植入，而后每3～7d進行CDDP 3.33～10 mg/kg治療，持續(xù)3～4周。

病理生理機制

細胞應激狀態(tài)線粒體功能障礙與氧化應激是 CDDP-AKI的標志。CDDP能夠引起線粒體功能受損，氧化應激增加伴內(nèi)源性抗氧化酶表達失調(diào)。使用靶向促進線粒體生物發(fā)生，增強線粒體動力學或增加內(nèi)源性抗氧化劑，能夠減少氧化應激和細胞死亡起到腎保護作用。CDDP直接和間接調(diào)節(jié)線粒體功能，在受體介導內(nèi)吞作用下水解為正電荷分子，直接破壞線粒體復合物導致ROS產(chǎn)生增加。CDDP-AKI最新研究集中于間接影響，如上調(diào)miR-709與線粒體轉錄因子(如線粒體轉錄因子A)相互作用并進行抑制[9]。

CDDP引起線粒體ROS產(chǎn)生增加同時降低內(nèi)源性抗氧化酶表達增加，導致ROS在細胞內(nèi)蓄積引發(fā)氧化應激，致絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷酯酰肌醇3-激酶(PI3K)及核因子E2相關因子2(Nrf2)等多種信號通路失調(diào)[10]。新型抗氧化劑通過增加內(nèi)源性抗氧化劑減輕CDDP-AKI。抗氧化劑透過質(zhì)膜并定位在ROS產(chǎn)生部位-線粒體可以更好地發(fā)揮作用，因此，靶向線粒體抗氧化劑已被用作CDDP-AKI新型抗氧化劑干預治療[11]。

氧化應激主要下游事件是細胞死亡， ROS可以激活死亡受體，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)介導的凋亡途徑。線粒體完整性喪失是導致ROS過度產(chǎn)生，降低ATP釋放,細胞應激和死亡加劇的關鍵因素，靶向這些過程可以防止氧化應激不良的下游事件。

細胞死亡

細胞凋亡 細胞凋亡主要由半胱天冬氨酸蛋白酶 caspases 介導， caspase-3是CDDP-AKI中涉及主要的胱天蛋白酶，一條或多條凋亡途徑可激活caspase-3，即外源性、內(nèi)源性或 ERS介導的凋亡途徑。

外源性途徑由凋亡受體激活細胞內(nèi)胱天蛋白酶介導。Fas 配體(FasL)表達于淋巴細胞等免疫細胞表面，并與靶細胞Fas受體結合(如圓錐繡球[12]可減少FasL在CDDP給藥后引起的腎臟表達上調(diào))。腫瘤壞死因子α(TNF-α)與TNF-α受體結合是CDDP-AKI模型中常見凋亡刺激因素。然而，TNF-α可以通過 caspases 和 NK-κB 通路分別促進細胞的凋亡和生存。上述受體激活的主要胱天蛋白酶啟動子是caspase-8， CDDP給藥后表達上調(diào)，蘇拉明可以降低其表達[11]。

內(nèi)源性途徑部分由線粒體功能障礙介導。腫瘤抑制蛋白p53是AKI 模型中關鍵的凋亡刺激因素。DNA受損激活p53，抑制線粒體膜上抗凋亡蛋白，如Bcl家族。研究表明，CDDP 作用鼠通過p53活化下調(diào) Bcl-2 表達[13]。在缺乏抗凋亡蛋白的情況下，線粒體膜透性化發(fā)生，線粒體中細胞色素 c 等釋放進入細胞質(zhì)，通過切割 caspase-9激發(fā)caspase級聯(lián)反應。睡蓮和七神益氣丸通過保護線粒體功能和降低 caspase-9分裂，減少線粒體導致的細胞死亡和腎小管損傷[14-15]。此外，桑色素(黃烷醇)水合物能夠直接抑制 p53激活可保護 CDDP-AKI誘導的腎小管細胞死亡[16]。然而，具有抗凋亡特性的藥物也可能由于抑制癌細胞凋亡而促進癌細胞生長。

ERS是CDDP-AKI重要調(diào)節(jié)者，有三種主要 ERS 感受器，包括肌醇蛋白1(IRE1)，蛋白激酶R(PKR)-類內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)，激活轉錄因子6(ATF6)。正常情況下，這些感受器處于非活性狀態(tài)，與Bip/GRP78和XBP結合。CDDP給藥后上述標志物被釋放，激活且豐度增加。多胺分解代謝增加是ERS的標志。CDDP治療與多胺分解代謝相關酶的表達增加有關，如 SMOX 和 SSAT，此兩種酶基因突變可阻斷CDDP誘導的ERS依賴的凋亡途徑。研究表明，高同型半胱氨酸血癥(HHcy)可誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶表達，如Ero1α；非CDDP-AKI情況下，合并HHcy的鼠Ero1α活化增加，產(chǎn)生過量H2O2，未折疊蛋白反應活化及引發(fā)內(nèi)皮炎癥[17]。CDDP作用HHcy鼠后，ERS加劇合并重度腎小管損傷，更傾向發(fā)展為嚴重AKI[18]。

CDDP除介導caspase 級聯(lián)的蛋白質(zhì)間相互作用，還在轉錄水平調(diào)節(jié)凋亡蛋白。如給予CDDP后，凋亡基因甲基化失調(diào)；CDDP上調(diào)組蛋白去乙?；?HDAC)2表達；HDAC 2與抗凋亡分子BMP-7啟動子結合；研究表明，促紅細胞生成素對CDDP誘導的腎小管上皮細胞凋亡具有保護作用[19]。令人驚訝的是caspase抑制劑，如zVAD-fmk在CDDP-AKI小鼠模型中，直接抑制細胞凋亡的效果較差，ANT和凋亡評分也更差[20]，提示由泛半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制劑或直接自噬抑制劑引起的自噬通量受損，加重CDDP-AKI。

細胞壞死和壞死性細胞凋亡 細胞壞死和非程序性細胞死亡，可見于伴隨細胞凋亡的AKI鼠模型中。此外，新的凋亡-壞死雜合途徑，即壞死性細胞凋亡，參與了CDDP-AKI。壞死性細胞凋亡是程序性細胞死亡，由受體相互作用蛋白激酶(RIPK)和混合譜系激酶結構域(如MLKL)協(xié)同激活介導，導致細胞透化。caspases除在凋亡中發(fā)揮作用，還可通過與PIPK相互作用在壞死性細胞凋亡機制中發(fā)揮作用。在CDDP給藥時，RIPK1、RIPK3、pMLKL及caspase-8表達上調(diào)，敲除MLKL或RIPKs的小鼠其腎小管壞死及損傷減輕[21]。目前，持續(xù)性壞死介導CDDP給藥后從AKI到CKD的轉化是壞死治療干預的重要靶點。

細胞焦亡 細胞焦亡又稱細胞炎性壞死，屬程序性細胞死亡，表現(xiàn)為細胞不斷脹大直至細胞膜破裂，細胞內(nèi)容物釋放進而激活強烈炎癥反應。最初在幾種吞噬細胞中發(fā)現(xiàn)，如巨噬細胞及單核細胞；最近，在肝細胞、神經(jīng)元細胞及腎小管上皮細胞亦被發(fā)現(xiàn)。Li等[22]證實，GSDMD活化通過靶向細胞焦亡促進了CDDP-AKI，靶向GSDMD 或GSDMD N端結構域(GSDMD-N)的預防性治療或許是臨床有前景的治療策略。

CDDP-AKI與炎癥

細胞因子 在CDDP可誘導前炎癥細胞因子和趨化因子，導致腎臟組織損傷和腎衰竭進展。Volarevic等[23]證實，抗炎細胞因子IL-10能夠減輕CDDP誘導的腎組織損傷和腎小管細胞死亡。炎癥反應的作用通過靶向特異性炎癥因子TNF-α進一步證實。CDDP可增加血清和尿液中TNF-α的濃度，受IL-1，NF-κB，Sir1和Deptor刺激后，受損的腎小管、成纖維細胞、角質(zhì)形成細胞、巨噬細胞和白細胞產(chǎn)生TNF-α。例如，IL-1受體敲除小鼠(IL-1R1-/-)表現(xiàn)出CDDP-AKI減輕和腎臟TNF-α水平降低[24]。

炎癥細胞 趨化因子促進白細胞募集到損傷部位，大量炎性細胞通過釋放細胞因子,髓過氧化物酶(myeloperoxidases，MPO)和ROS等直接損傷組織，增加血管通透性并損害內(nèi)皮功能。黏附分子介導白細胞黏附于其他細胞定位于炎癥特定部位。黏附分子CD54+(ICAM1)在TNFα刺激下在血管內(nèi)皮上表達。連接黏附分子C(JAM-C)可阻止嗜中性粒細胞從炎癥組織運動返回體循環(huán)，逆向內(nèi)皮遷移[25]。 JAM-C阻斷抗體已顯示可從CDDP誘導的炎癥組織中去除CD54+中性粒細胞，從而減輕炎癥反應和改善CDDP-AKI。

在CDDP-AKI中，激活的CD4+T細胞侵入腎臟，產(chǎn)生細胞因子(例如TNFα)介導損傷。此外，活化的CD4+T細胞表達并脫落死亡激活因子Fas配體(FasL) 和T細胞免疫球蛋白黏蛋白(Tim-1，Hcvr1，Kim-1)，介導細胞凋亡(FasL)和受體介導的吞噬作用(Kim-1)損傷腎小管細胞。然而，遺傳性CD4耗竭研究證明了對CDDP-AKI的保護。此外，在合并腫瘤AKI小鼠模型中，CD4耗竭不能抵抗CDDP-AKI并導致腫瘤負擔加重，可能與調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)有關。磷脂酶A2可增加IL-10產(chǎn)生并在體內(nèi)和體外擴大Treg種群，最終用于CDDP-AKI的治療[26]。

腎臟MPO升高與中性粒細胞和巨噬細胞(Mφ)引起的腎損傷相關。CDDP誘導損傷后1～3d，可以確定Mφ(F4/80LoCD11bHi)和樹突狀細胞 [DC(F4/80HiCD11bLo)]浸潤腎臟[27]。 DC/Mφ耗竭實驗加劇了CDDP-AKI腎臟病變，表明DC/Mφ介導了腎臟損傷的保護作用[28]。相反，DC/Mφ消耗已顯示可降低CDDP-AKI嚴重程度。關于DC/Mφ在CDDP-AKI中作用的矛盾數(shù)據(jù)集表明，需要進行更多的研究以更好地定義DC/Mφ亞型的作用和功能[27]。

自噬自噬是高度保守的細胞內(nèi)溶酶體蛋白降解途徑，是維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要途徑。損傷后自噬體標記物lc3-Ⅱ的表達多被認為是自我保護和防御機制。

HDAC6是自噬體成熟和自噬體-溶酶體融合的主要調(diào)節(jié)因子，CDDP-AKI刺激HDAC6的表達和活性。HDAC6抑制結果增加自噬蛋白的表達(ATG7，Beclin-1)。 HDAC6抑制和刺激自噬與減少腎臟氧化應激、抑制TNF-α和 IL-6表達、抑制生物標志物NGAL 和 KIM-1、抑制腎小管細胞凋亡最終減輕CDDP-AKI有關。同樣，植物黃酮燈盞乙素[29]，被廣泛研究的HDAC抑制劑(如二甲雙胍等)以及外源性補充或增強自噬相關蛋白的表達(如14-3-3和 atg16l)均可通過增強自噬減輕CDDP-AKI[30]。

Klotho Klotho是存在于多種組織和細胞中的跨膜蛋白，尤其在腎臟近端小管高表達，分泌參與器官保護。Klotho細胞內(nèi)形成能抑制炎癥介導的衰老和礦物質(zhì)代謝。在CDDP-AKI情況下，無論是人或嚙齒類動物模型，尿液中Klotho水平均是降低的[31]。在Klotho缺陷小鼠中，CDDP給藥前Klotho表達降低，加劇了CDDP-AKI?？傊?，Klotho表達與器官保護，降低氧化應激及調(diào)節(jié)生長因子信號相關。

CDDP-AKI 新型早期生物標記物

尿液外泌體尿液中的外泌體可來自腎單位每一部分，包括足細胞。外泌體由細胞在正常和病理條件下分泌，受RNA調(diào)控。在大鼠AKI模型發(fā)現(xiàn)活化轉錄因子3(ATF3)水平升高比SCr水平更早[32]。水通道蛋白2早期在尿液細胞外囊泡釋放降低發(fā)生在SCr升高及小管損傷之前。人胚胎干細胞外泌體釋放減輕CDDP誘導的氧化應激和細胞凋亡。總之，檢測尿液外泌體轉錄因子對提供細胞調(diào)解途徑的洞察和疾病早期生物標志物的發(fā)現(xiàn)十分有益。

miRNA miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼長度約為22 個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子。研究表明，p53介導了CDDP誘導鼠腎小管上皮細胞miR-34a表達上調(diào)；抑制腎小管上皮細胞中miR-34a表達可促進細胞凋亡，miR-34a過表達可減少細胞壞死、增加細胞活力，提示miR-34a成為早期診斷CDDP-AKI生物標志物及為治療提供新靶點的可能[33]。新近Kagawa等[34]發(fā)現(xiàn)，CDDP-AKI大鼠模型中，血液miR-143-3p和miR-122-5p表達下調(diào)，其變化顯著于SCr變化。上述提示，miRNA或許成為CDDP-AKI早期診斷的生物標志物。

總結與展望

現(xiàn)階段常用嚙齒類CDDP-AKI動物模型，多為應用高劑量、幼齡及非腫瘤小鼠構建。盡管已有應用合并腫瘤小鼠構建的CDDP-AKI模型，但鼠齡及劑量方面需要進一步優(yōu)化及改良，以提高臨床相關性，進一步通過大量實驗研究得出的基礎數(shù)據(jù)更具說服力。

CDDP-AKI病理生理包括氧化應激、凋亡、壞死、炎癥及自噬等，對上述任一環(huán)節(jié)進行調(diào)節(jié)都會減輕CDDP-AKI。盡管，大量實驗研究對CDDP-AKI分子機制有了新認識，然而CDDP調(diào)節(jié)細胞存活、新陳代謝和免疫應答的信號傳導途徑多同時涉及CDDP對腫瘤細胞的細胞毒活性及其功能的潛在改變，可能減低CDDP 抗腫瘤效應。目前，AKI調(diào)節(jié)仍然是CDDP腎保護和腫瘤毒性之間的平衡點。建立不限制抗癌效應同時具有腎保護效應的新CDDP化療方案，將顯著提高CDDP臨床應用價值，為化療開辟新途徑。