楊琦，劉淳劼，郭兵，段盛文，成莉鳳，馮湘沅，鄭科，彭源德

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南 長沙 410205）

苧麻（Boehmerianivea）是蕁麻科苧麻屬的多年生作物，具有重要的纖用、飼用及藥用價(jià)值［1］。苧麻原產(chǎn)中國，其栽培歷史已達(dá)4000年以上，是我國極具特色的經(jīng)濟(jì)作物，國際上稱其為“中國草”。我國的苧麻產(chǎn)量約占全世界苧麻產(chǎn)量的90%以上，具有較大的經(jīng)濟(jì)效益和國際影響力［2］。近年來，苧麻栽培過程中大范圍施用化肥，導(dǎo)致有害物質(zhì)在土壤中滯留，造成了土壤板結(jié)、鹽堿化等危害。人們逐漸意識到減少環(huán)境污染，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展，需要發(fā)現(xiàn)并使用一些新型生物肥料，減少化肥施用量，優(yōu)化傳統(tǒng)種植模式。植物內(nèi)生菌是指能夠寄生在健康植物活組織內(nèi)而不引起寄主植物明顯病變的一大類微生物，主要包括細(xì)菌、真菌和放線菌［3］。其中，內(nèi)生細(xì)菌是內(nèi)生菌的重要組成部分，植物內(nèi)生細(xì)菌可以從植物周圍組織環(huán)境中吸取營養(yǎng)來進(jìn)行生長繁殖，同時(shí)也可以通過菌株生長、生理代謝活動(dòng)等影響植物宿主的生長和發(fā)育［4］。由于植物與內(nèi)生細(xì)菌以及內(nèi)生菌群之間復(fù)雜的互作關(guān)系，內(nèi)生細(xì)菌在植物促生長以及病害生物防治方面具有較好的應(yīng)用潛力。因此，尋找既可以促進(jìn)生長，又可以促進(jìn)植物免疫能力提高的內(nèi)生菌，最終以微生物菌劑、菌肥等形式應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)是現(xiàn)代生物防治的發(fā)展趨勢之一。

內(nèi)生細(xì)菌是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在不同植物器官內(nèi)的分布數(shù)量存在差異。研究［5］發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生細(xì)菌在植物的根部分布最多，其次為莖和葉。內(nèi)生菌是植物微生態(tài)系統(tǒng)的組成成分，與寄主植物形成共生關(guān)系。一些內(nèi)生細(xì)菌具有促進(jìn)植物生長和拮抗病原菌的作用，屬于植物促生菌范疇。理論上，以促生細(xì)菌為原料制成的生物菌劑或菌肥可代替?zhèn)鹘y(tǒng)化肥，對其深入研究并力求產(chǎn)品化，可減少施用化肥對環(huán)境和作物造成的污染，對可持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展具有重要理論意義和實(shí)用價(jià)值。因此，分離鑒定苧麻根部的內(nèi)生細(xì)菌，對于探究苧麻的內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和發(fā)現(xiàn)功能菌株等具有重要意義。目前，對苧麻內(nèi)生細(xì)菌的研究較少，尤其是可用于苧麻農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的微生物菌肥稀少，因此，本文擬采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法分離苧麻根部的內(nèi)生細(xì)菌，并鑒定其種屬信息，從溶磷能力、固氮能力及具ACC脫氨酶活性三個(gè)方面評估其促生潛力，旨在為促生菌菌種資源的開發(fā)和促生菌制劑的研制奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為12年麻齡的健康苧麻根（品種為中苧1號），2020年5月采集于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院沅江試驗(yàn)站，采集后的苧麻根裝于密封袋中，于實(shí)驗(yàn)室 4℃低溫保存，并及時(shí)進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌的分離。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 10.0 g，固體培養(yǎng)基另加瓊脂粉15.0 g，加雙蒸水至1000 mL，121℃滅菌20 min。

TSB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨 17.0 g，植物蛋白胨 3.0 g，NaCl 5.0 g，K2HPO42.5 g，葡萄糖 2.5 g，pH 7.3，115℃滅菌30 min。

NBRIP無機(jī)磷固體培養(yǎng)基：葡萄糖 10.0 g，Ca3（PO4）25.0 g，MgCl25.0 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，KCl 0.2 g，（NH4）2SO41.0 g，瓊脂 15.0 g，加雙蒸水至 1000 mL，pH 7.0，115℃滅菌 30 min。

無氮固體培養(yǎng)基：蔗糖 10.0 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.2 g，CaCO31.0 g，瓊脂 15.0 g，加雙蒸水至1000 mL，pH 7.2，115℃滅菌30 min。

ADF液體培養(yǎng)基：購自北京雷根生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離

內(nèi)生細(xì)菌的分離方法參照文獻(xiàn)［6］，略做修改。將生長狀況良好的苧麻根樣品置于流動(dòng)的自來水下沖洗干凈，用濾紙吸干根部表面水分。將洗凈吸干后的材料放入超凈工作臺內(nèi)，在工作臺內(nèi)用剪枝剪將枝干剪成2～3 cm的小段，然后在超凈工作臺內(nèi)用無菌水洗滌苧麻根3次，每次約3 min。將洗滌后的苧麻根浸在75%的乙醇中消毒3 min，無菌水洗滌3次，再用Cl－濃度約為3%的NaOCl浸泡3 min，無菌水洗滌5次。為驗(yàn)證苧麻根表面消毒成功，取最后的清洗液200μL涂布于LB固體培養(yǎng)基上，若沒有長菌，則證實(shí)滅菌成功［7］。將洗凈的苧麻根置于無菌濾紙上，吸去多余水分。隨后將處理好的苧麻根置于無菌研缽中，加入10倍體積的無菌生理鹽水（0.9%的NaCl溶液）進(jìn)行研磨，勻漿后靜置5 min，取懸液進(jìn)行10倍系列的梯度稀釋，分別取不同稀釋梯度的懸液200μL涂布于LB固體培養(yǎng)基上，封口膜封好培養(yǎng)皿，置于30℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，培養(yǎng)期間每隔12 h觀察1次，待菌落長出后及時(shí)分離純化并編號記錄。

1.2.2 內(nèi)生細(xì)菌的純化與鑒定

將長出的內(nèi)生細(xì)菌菌落挑取至液體LB培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)培，培養(yǎng)溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速為200 r／min，培養(yǎng)時(shí)間為24 h。采用多步梯度稀釋涂布的方法對培養(yǎng)液中的細(xì)菌進(jìn)行純化，直至在LB固體平板上獲得多個(gè)菌落形態(tài)一致的單菌落。對純化后的菌株進(jìn)行試管斜面和甘油管保存。

采用16S rRNA基因序列分析法鑒定內(nèi)生細(xì)菌［8－9］。將試管斜面或甘油保藏管中的內(nèi)生細(xì)菌置于液體LB培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)時(shí)間約為24 h，搖床轉(zhuǎn)速為200 r／min。采用平板劃線的方法將活化后的細(xì)菌轉(zhuǎn)接于LB固體培養(yǎng)基上，30℃倒置暗培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后從平板上隨機(jī)挑取3個(gè)單菌落置于LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)培，第二天提取基因組DNA，提取步驟按照細(xì)菌基因組試劑盒的操作說明（天根生化科技有限公司，北京，中國）。以基因組DNA為模板，利用通用引物 27F（5’－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3’）和 1492R（5’－GGTTACCTTGTTACGACTT－3’）擴(kuò)增基因組中的16S rRNA基因序列。建立50μL PCR擴(kuò)增體系：34μL無菌雙蒸水，5μL 10×PCR緩沖液，4.5μL dNTP，2μL 27F引物，2μL 1492R引物，1.5μL細(xì)菌基因組模板，1μL rTaq DNA聚合酶（Takara，寶生物工程有限公司，大連，中國）。采用Bio－Rad PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；12℃停止程序并保存。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增結(jié)果，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果并拍照。將PCR產(chǎn)物送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，利用NCBI上的BLAST工具對菌株的測序結(jié)果進(jìn)行對比，通過軟件MEGA 6.0進(jìn)行序列相似性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［10］。

1.2.3 促生潛力分析

將純化并鑒定后的內(nèi)生細(xì)菌在TSB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)培，培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)時(shí)間為24 h，搖床轉(zhuǎn)速為200 r／min。擴(kuò)培好的內(nèi)生細(xì)菌用于評估其促生潛力，本研究從溶磷能力、固氮能力及具ACC脫氨酶活性三個(gè)方面評估了內(nèi)生細(xì)菌的促生潛力。所有試驗(yàn)重復(fù)3次。

溶磷能力測定［11］：取5μL菌液點(diǎn)接于NBRIP無機(jī)磷固體培養(yǎng)基上，置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，觀察有無解磷圈及解磷圈大小，根據(jù)解磷圈與菌落比值大小確定其對無機(jī)磷的解磷作用。

固氮能力測定：根據(jù)趙?？〉龋?2］的方法并作少量修改，取5μL菌液點(diǎn)接于無氮固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)6 d，觀察其生長情況，根據(jù)菌斑大小推測內(nèi)生細(xì)菌的固氮潛力。

產(chǎn)ACC脫氨酶潛力分析：以2%的接種量將菌液轉(zhuǎn)接至5mL ADF液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后于OD600nm下測定吸光值，觀察各內(nèi)生細(xì)菌的生長情況，以轉(zhuǎn)接前后吸光值的比值大小評估其產(chǎn)ACC脫氨酶的潛力。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

所獲得的數(shù)據(jù)采用Excel 2007記錄及繪制圖表，并采用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)分析，利用t檢驗(yàn)分析極值是否具有顯著性差異（p＜0.01）。

2 結(jié)果與分析

經(jīng)過對苧麻根部內(nèi)生細(xì)菌的分離，從最初的LB分離平板上共獲得19個(gè)單菌落，編號分別為Strain 1至Strain 19。進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)和純化發(fā)現(xiàn)，僅有12株內(nèi)生細(xì)菌可以在LB液體或固體培養(yǎng)基上生長，后續(xù)對這12株內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行了16S rRNA基因序列鑒定和促生潛力分析。

2.1 16S rRNA基因序列與系統(tǒng)發(fā)育分析

用引物27F和1492R從12株內(nèi)生細(xì)菌基因組中分別擴(kuò)增出約1.5 kb的PCR產(chǎn)物，所得PCR產(chǎn)物送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。在NCBI網(wǎng)站上利用BLAST工具進(jìn)行序列比對分析，結(jié)果顯示除了Strain 19外，其余11株內(nèi)生細(xì)菌的16S rRNA基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中已報(bào)道的相關(guān)菌株16S rRNA基因序列的相似性均為100%（表1）。其中，Strain 2、Strain 4、Strain 5、Strain 6、Strain 12、Strain 15、Strain 18與菌株 Pseudomonas frederiksbergensis strain PgBE257的16S rRNA基因序列的相似性均達(dá)到100%，說明這7株內(nèi)生細(xì)菌為同一株或同一種屬的細(xì)菌，菌株間的同源性極高。

表1 內(nèi)生細(xì)菌的16S rRNA基因序列相似性Table 1 16S rRNA gene sequence similarity ofendophytic bacteria from ramie roots

通過MEGA 6.0軟件構(gòu)建了12株內(nèi)生細(xì)菌和6株參考菌株16S rRNA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1）。結(jié)果顯示，Strain 14與Bacillus solani strain DSS－ERY－4在同一分支，Strain 19與Pseudomonas umsongensis strain JZY5－53在同一分支，且這4株菌株同屬于一個(gè)簇群中。Strain 16與Pseudomonas sp.strain WR9在同一分支，Strain 7與Lysinibacillusxylanilyticus strain YEBFR4在同一分支，Strain 1與P.frederiksbergensis strain BF5－2在同一分支，其余內(nèi)生細(xì)菌則與P.frederiksbergensis strain PgBE257在同一分支，且這12株內(nèi)生細(xì)菌同屬于一個(gè)簇群中。根據(jù)12株內(nèi)生細(xì)菌16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析，將Strain 14鑒定為B．solani，Strain 7鑒定為L．xylanilyticus，其他內(nèi)生細(xì)菌均屬于假單胞菌屬（Pseudomonas），Strain 19鑒定為 P．umsongensis，Strain 1、Strain 2、Strain 4、Strain 5、Strain 6、Strain 12、Strain 15與 Strain 18鑒定為 P．frederiksbergensis，而 Strain 16屬于Pseudomonas屬菌種。

2.2 內(nèi)生細(xì)菌的促生潛力分析

分別對鑒定的12株苧麻根部內(nèi)生細(xì)菌的溶磷能力、固氮能力和產(chǎn)ACC脫氨酶潛力進(jìn)行了測定，其相關(guān)的促生指標(biāo)如表2所示。結(jié)果顯示，不同菌株間的促生潛力差異較大。其中，Strain 18是溶磷能力最強(qiáng)的內(nèi)生細(xì)菌；Strain 12在無氮培養(yǎng)基上的生長最旺盛，具有明顯菌斑；Strain 19則是最具有產(chǎn)ACC脫氨酶潛力的菌株。

圖1 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的內(nèi)生菌株與參考菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenic tree of endophytic bacteria and reference strains based on 16S rRNA gene sequences

表2 內(nèi)生細(xì)菌的促生指標(biāo)Table 2 The results of growth－promoting indexes of endophytic bacteria

通過促生試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大部分內(nèi)生細(xì)菌具有溶磷作用，其中溶磷能力最強(qiáng)的菌株為Strain 18，經(jīng)測量溶磷圈直徑與菌落直徑比值為3.800，說明該菌株有較強(qiáng)的溶磷能力；Strain 14雖然可在NBRIP無機(jī)磷固體培養(yǎng)基生長，但是沒有出現(xiàn)明顯的溶磷圈，其溶磷圈直徑與菌落直徑比值為1.000，說明該菌株不具有溶磷的能力；Strain 7在NBRIP無機(jī)磷固體培養(yǎng)基不能生長，說明該培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不利于Strain 7的生長（圖2）。

圖2 內(nèi)生細(xì)菌在NBRIP平板上的生長情況Fig.2 The growth of endophytic bacteria on NBRIP culturemedium

根據(jù)內(nèi)生細(xì)菌在無氮培養(yǎng)基上的生長情況差異，對各內(nèi)生細(xì)菌的固氮能力進(jìn)行評估分級，不同固氮能力級別的細(xì)菌生長情況如圖3所示。Strain 7不能在無氮培養(yǎng)基上生長，固氮能力級別為“－”，表示沒有固氮能力；Strain 14可在無氮培養(yǎng)基上生長，固氮能力級別為“＋”，表示具有固氮能力；Strain 18在無氮培養(yǎng)基上生長較好，固氮能力級別為“＋＋”，表示具有較強(qiáng)固氮能力；Strain 12在無氮培養(yǎng)基上生長良好，固氮能力級別為“＋＋＋”，表示具有很強(qiáng)固氮能力。12株內(nèi)生細(xì)菌中，僅有1株細(xì)菌（Strain 7）在無氮培養(yǎng)基上不能生長，不具有固氮能力，其余11株內(nèi)生細(xì)菌均具有固氮能力（表2）。其中，具有固氮能力的內(nèi)生細(xì)菌有3株（Strain 14、Strain 16與Strain 19），具有較強(qiáng)固氮能力的內(nèi)生細(xì)菌有 7株（Strain 1、Strain2、Strain 4、Strain 5、Strain 6、Strain 15與 Strain 18），最具固氮潛力的內(nèi)生細(xì)菌是Strain 12，該細(xì)菌在無氮培養(yǎng)基上的生長情況顯著優(yōu)于其他菌株。

圖3 內(nèi)生細(xì)菌在無氮固體培養(yǎng)基上的生長情況Fig.3 The growth of endophytic bacteria on N－freemedium

3 結(jié)論與討論

本研究采用稀釋涂布的方法從健康苧麻根中分離到12株內(nèi)生細(xì)菌，內(nèi)生細(xì)菌分別屬于假單胞菌屬（10株）、賴氨酸芽孢桿菌屬（1株）和芽孢桿菌屬（1株）三個(gè)種屬，說明苧麻根部內(nèi)生細(xì)菌的種屬豐富度不高，例如，劉魯峰等［16］從甘蔗的不同組織分離獲得的內(nèi)生細(xì)菌和真菌分屬于21個(gè)屬和17個(gè)屬，顯示了豐富的多樣性。后續(xù)研究中，可采用多種非選擇性或選擇性培養(yǎng)基相結(jié)合的分離方法，同時(shí)對苧麻植株的不同組織進(jìn)行內(nèi)生菌的分離和純化，以期獲得較多具有種屬差異性的內(nèi)生菌。研究結(jié)果表明，假單胞菌在苧麻根內(nèi)顯著富集，是苧麻根部內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢菌群。根據(jù)現(xiàn)有報(bào)道，從苧麻中篩選獲得的內(nèi)生細(xì)菌主要屬于芽孢桿菌屬細(xì)菌（Bacillus）［13－15］和伯克霍德菌屬（Burkholderia）［17］，內(nèi)生真菌主要屬于曲霉屬（Aspergillus）［18－19］。本研究初次從苧麻根部分離鑒定到多株假單胞菌屬內(nèi)生細(xì)菌，這與其他植物中（如黃芪與高寒草甸優(yōu)勢植物等）根部內(nèi)生細(xì)菌的種屬豐富度具有一致性［20－21］，說明不同植物的內(nèi)生細(xì)菌具有種屬相似性。

對這些內(nèi)生細(xì)菌的促生潛力進(jìn)行評估，篩選獲得具有較強(qiáng)固氮能力的內(nèi)生菌1株，具有較強(qiáng)溶磷能力的內(nèi)生菌1株，以及具有產(chǎn)ACC脫氨酶潛力的內(nèi)生菌1株，且這三株細(xì)菌均屬于假單胞菌。有趣的是，盡管有8株細(xì)菌同屬于P．frederiksbergensis，且這些菌株的16S rRNA基因序列與P．frederiksbergensis strain BF5－2的相似性均達(dá)到100%，它們的促生潛力卻具有較大差異，這說明同一種屬的內(nèi)生細(xì)菌的促生潛力存在菌株間的差異，引起菌株間促生潛力差異的機(jī)理有待于進(jìn)一步研究探索。

目前，已從楊樹根際土壤和玉米根際土壤中分別分離篩選得到具有良好溶磷能力的P．frederiksbergensis JW－SD2［22］和 P．frederiksbergensis11－D3［23］，但具有良好溶磷作用的 P．frederiksbergensis植物內(nèi)生細(xì)菌鮮見報(bào)道。本研究中獲得的苧麻根部內(nèi)生細(xì)菌P．frederiksbergensis strain 18可直接定植于植株根部，作為菌肥使用時(shí)能降低根際土壤復(fù)雜微生態(tài)環(huán)境對其促生性能的影響，更有利于進(jìn)一步在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的推廣與應(yīng)用。具有固氮能力和產(chǎn)ACC脫氨酶潛力的內(nèi)生假單胞菌較為少見，秦寶軍等［24］從小麥中新分離一株具有固氮酶活性的假單胞菌屬內(nèi)生細(xì)菌，具有產(chǎn)ACC脫氨酶潛力的假單胞菌屬內(nèi)生菌株主要有杜仲內(nèi)生菌Pseudomonas koreensis JDM－2［25］和人參內(nèi)生菌Pseudomonas fluorescens JJ8－3［26］等。從苧麻根中分離獲得的 P．frederiksbergensis strain 12和 P．umsongensis strain 19，豐富了假單胞菌屬中具固氮能力和具產(chǎn)ACC脫氨酶潛力的內(nèi)生細(xì)菌的多樣性。

研究［27］表明，植物的內(nèi)生細(xì)菌在發(fā)揮促生作用時(shí)通常存在協(xié)同效應(yīng)，利用篩選出的優(yōu)良促生細(xì)菌進(jìn)行合理的組合與復(fù)配，開發(fā)出多菌劑聯(lián)合促生的微生物菌肥，可進(jìn)一步提高內(nèi)生細(xì)菌的促生作用［28］。本研究發(fā)現(xiàn)同一種屬的不同菌種間，其促生作用與促生潛力具有顯著性差異，說明苧麻內(nèi)生細(xì)菌在發(fā)揮促生作用時(shí)可能具有協(xié)同效應(yīng)，研究該協(xié)同效應(yīng)對于開發(fā)復(fù)合微生物菌肥具有重要意義。綜上所述，本研究從苧麻根部分離獲得多株具溶磷能力、固氮能力或產(chǎn)ACC脫氨酶潛力的內(nèi)生細(xì)菌，豐富了植物促生細(xì)菌的資源，為進(jìn)一步研發(fā)單一或復(fù)合微生物菌肥奠定了基礎(chǔ)，具有良好的開發(fā)潛力和應(yīng)用前景。