賀晶晶，高俊珍

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 呼吸科，內(nèi)蒙古 呼和浩特）

0 引言

肺癌是全球腫瘤相關(guān)死亡的首要原因，每年約有160 萬人死于癌癥，而每4 例癌癥死亡中就有1 例死于肺癌。考慮到50%以上的患者在初次就診和診斷時(shí)處于晚期疾病階段，肺癌在臨床、組織學(xué)和基因組學(xué)上存在著深刻的異質(zhì)性，獲得足夠的組織以進(jìn)行疾病的病理確認(rèn)和輔助分子檢測(cè)是需要面臨的挑戰(zhàn)[1-2]。靶向治療的應(yīng)用為晚期肺癌的治療帶來了新的希望。通過穿刺活檢對(duì)轉(zhuǎn)移性病變進(jìn)行再分析是可能的，但它是侵入性有創(chuàng)檢查，并且采用高度異質(zhì)性腫瘤組織樣本無法反映真實(shí)的疾病狀態(tài)。液體活檢，即通過分析血液樣本中的腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞產(chǎn)物，可以克服這些障礙，原則上可以反映該特定時(shí)間點(diǎn)存在的所有亞克隆，并允許對(duì)疾病的進(jìn)展進(jìn)行連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。

液體活檢最早在1974 年由Sarrell 等提出，當(dāng)時(shí)指關(guān)節(jié)腔的滑液分析用于診斷滑膜疾病。而近期重新提出的液體活檢的概念，涉及通過微創(chuàng)方法收集體液，例如血液、尿液、滲出液或唾液，并將進(jìn)行臨床試驗(yàn)這項(xiàng)新興技術(shù)有可能繞過上述腫瘤活檢的局限性，通過分析上述樣本中的腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞產(chǎn)物，其生物標(biāo)志物主要包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞（C i r c ulating Tumor Cells, CTC）、循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）、外泌體（Exosomes）、腫瘤血小板（Tumor Educated Platelets, TEP）等。通過非侵入性的取樣方法獲得腫瘤細(xì)胞信息，是輔助腫瘤治療的突破性檢測(cè)技術(shù)，是精準(zhǔn)醫(yī)療代表性的診斷技術(shù)之一，具有實(shí)時(shí)檢測(cè)、重復(fù)取樣、微創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn)[3]。

1 循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）最早是在1869 年由澳大利亞病理學(xué)家Ashworth 首次提出，他在死亡后的患者血液中發(fā)現(xiàn)了與腫瘤細(xì)胞相似的細(xì)胞。CTC 是指由原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落進(jìn)入外周血的腫瘤細(xì)胞，CTC 具有腫瘤干細(xì)胞特性，促進(jìn)腫瘤及腫瘤耐藥性的形成，同時(shí)CTC 能夠發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）行為，可以使得細(xì)胞失去細(xì)胞間黏附性，同時(shí)侵襲、遷移能力增強(qiáng)，易于粘附于血管壁并穿越，最終產(chǎn)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。EMT 是一個(gè)復(fù)雜的過程，通過細(xì)胞接觸連接的重排，最終導(dǎo)致細(xì)胞粘附的喪失，從而導(dǎo)致細(xì)胞去分化和運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)。在這一轉(zhuǎn)變過程中，細(xì)胞將其上皮表型部分或完全轉(zhuǎn)換為間充質(zhì)表型。

EMT 是轉(zhuǎn)移瘤形成的關(guān)鍵過程，其目的是使腫瘤細(xì)胞具有更好的侵襲性和生存特性，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位脫離并轉(zhuǎn)移到繼發(fā)部位；此外，EMT 可能是部分或完全的。導(dǎo)致CTC 的高度異質(zhì)性亞群，分別具有混合上皮間質(zhì)或純間質(zhì)表型，單憑其免疫特性，已經(jīng)經(jīng)歷過任何程度EMT 的CTC可能很難與正常造血細(xì)胞區(qū)分開來，而它們?cè)谘髦械乃缴呖赡茏鳛楦咔忠u性疾病過程的一個(gè)指標(biāo)，具有重大的預(yù)后意義高轉(zhuǎn)移潛能與耐藥性。

但是，CTC 在血液中含量少，大概每100 萬血細(xì)胞（1 mL血液）中混雜1個(gè)腫瘤細(xì)胞。因此進(jìn)行CTC 研究時(shí)必須先進(jìn)行富集，合理有效的富集方法就是最為重要也急需攻克的難題。主要的挑戰(zhàn)是如何獲得足夠數(shù)量的、最佳條件的、可用于進(jìn)一步評(píng)估的CTC。

2 循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）

液體活檢在靶向腫瘤治療領(lǐng)域也產(chǎn)生了很有希望的結(jié)果，因?yàn)檠h(huán)游離DNA（cfDNA）的分析，特別是來自腫瘤細(xì)胞的部分，即循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）能夠檢測(cè)特定的基因改變，作為靶向治療的潛在靶點(diǎn)[4]。cfDNA 和ctDNA 通過多種機(jī)制釋放到血液中，包括凋亡、壞死甚至主動(dòng)脫落。ctDNA被認(rèn)為能夠提供全身腫瘤的基因組圖譜，具有更廣闊的藍(lán)景。液體活檢所需的微創(chuàng)取樣也提供了檢測(cè)癌細(xì)胞在治療過程中發(fā)生的分子變化的機(jī)會(huì)，并監(jiān)測(cè)腫瘤負(fù)擔(dān)和復(fù)發(fā)的發(fā)生。

1940 年Mandel 和Metais 首次提出了細(xì)胞外游離核酸的概念，ctDNA 是指來自腫瘤基因的DNA 片段，它隨著人體血液循環(huán)系統(tǒng)不斷的流動(dòng)，并攜帶有基因突變、缺失、重排、拷貝數(shù)異常和甲基化等信息。一些研究報(bào)告表明，隨著疾病的進(jìn)展，ctDNA 水平迅速上升，而在切除手術(shù)和/或成功的藥物治療的情況下，ctDNA 水平下降。

3 外泌體（Exosomes）

外泌體是球形納米大小的囊泡，是一類特殊的細(xì)胞外囊泡（EVs），直徑為40～100 nm，密度為1.13～1.19 g/mL。在生理和病理?xiàng)l件下，外泌體均可通過幾種細(xì)胞類型釋放，包括免疫細(xì)胞，干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。

通常，這些納米大小的囊泡包含許多分子，包括核酸（例如雙鏈DNA 和RNA 的各種亞型），蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。重要的是，供體細(xì)胞釋放的外泌體可以以自分泌、旁分泌或外分泌的方式被受體細(xì)胞吸收，這表明外泌體在細(xì)胞間通訊中的關(guān)鍵作用。在腫瘤環(huán)境中外泌體介導(dǎo)的交流影響了與腫瘤相關(guān)的途徑，并促進(jìn)了包括肺癌在內(nèi)的多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展。腫瘤細(xì)胞外泌體在許多腫瘤生物學(xué)過程中起著重要作用。它們負(fù)責(zé)促進(jìn)受體細(xì)胞的血管生成、侵襲和增殖，以促進(jìn)腫瘤擴(kuò)展和前轉(zhuǎn)移生態(tài)位的形成。

與正常細(xì)胞相比，外泌體的形成在腫瘤細(xì)胞中顯著改變。此外，盡管外泌體從所有細(xì)胞類型中釋放出來，但外泌體在腫瘤細(xì)胞中高度豐富。在肺癌患者中，發(fā)現(xiàn)體液中的外泌體水平上調(diào)，表明外泌體在肺癌發(fā)展和進(jìn)程中的關(guān)鍵作用。

與其他液體活檢方法（如CTC 和ctDNA）相比，外泌體更可能反映細(xì)胞間通訊的作用，此外與CTC（1-10 CTC/mL血液）相比，腫瘤細(xì)胞外泌體釋放是一個(gè)活躍的過程，血液中的泡數(shù)≥109個(gè)/mL，此外外泌體還敏感地反映腫瘤的狀態(tài)，從而使外泌體更好地替代腫瘤的液體活檢。盡管基于外泌體的肺癌液體活檢策略在臨床應(yīng)用中具有很大的潛力，但在目前階段，還是存在一些局限性，應(yīng)將機(jī)制研究和臨床研究更好地結(jié)合起來。

4 腫瘤培養(yǎng)血小板

液體活檢的另一類新成分是腫瘤培養(yǎng)血小板（TEP）。這些無核的細(xì)胞碎片在外周血中形成第二種最豐富的細(xì)胞類型，可以通過轉(zhuǎn)移與腫瘤相關(guān)的生物分子（主要是RNA）來受腫瘤細(xì)胞的教育。TEP 參與了多個(gè)實(shí)體腫瘤的進(jìn)展和擴(kuò)散，拼接的TEP-RNA 替代信號(hào)可以提供關(guān)于腫瘤存在、位置和分子特征的特定信息[5]。

傳統(tǒng)上以止血作用著稱的血小板在腫瘤的生長發(fā)育過程中也起著顯著的作用。在與腫瘤細(xì)胞對(duì)抗的過程中，腫瘤相關(guān)分子可以轉(zhuǎn)移至血小板內(nèi)，最終形成TEP。

在癌癥發(fā)生期間，血小板對(duì)癌細(xì)胞以及進(jìn)入血液的癌細(xì)胞都有影響。首先，血小板通過向腫瘤提供多種促血管生成因子，如vegf、pdgf 和bfgf，并刺激這些因子的表達(dá)，創(chuàng)造支持新生血管形成的環(huán)境。其次，血小板減少局部腫瘤細(xì)胞凋亡和失活，并能通過直接的物理作用和釋放TGF-β 分子誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換。隨后，血小板保護(hù)循環(huán)中腫瘤細(xì)胞免受正常免疫反應(yīng)。心臟病患者使用的血小板聚集抑制劑，如氯吡格雷等，這些藥物針對(duì)血栓形成所必需的受體（例如二磷酸腺苷受體），發(fā)現(xiàn)它們也主要通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞/血小板相互作用和血管生成而影響導(dǎo)致癌癥進(jìn)展的機(jī)制。因此，血小板介導(dǎo)了腫瘤進(jìn)展和癌癥的全身擴(kuò)散的關(guān)鍵步驟。

據(jù)報(bào)道，升高的預(yù)處理血小板、淋巴細(xì)胞比例與對(duì)nivolumab 抗PDL1 免疫療法的應(yīng)答率降低相關(guān)，表明在存在抗腫瘤免疫應(yīng)答的情況下，循環(huán)中的血小板可能會(huì)增強(qiáng)促癌作用。有趣的是，還顯示血小板可以浸潤在腫瘤組織中，表明血小板可以連續(xù)地定植并從腫瘤微環(huán)境中疏散。

除了檢測(cè)癌癥外，還對(duì)TEP 進(jìn)行了研究以監(jiān)測(cè)癌癥的進(jìn)展。隨著TEP 螯合腫瘤來源的RNA 分子，包括EML4-ALK融合轉(zhuǎn)錄本，已顯示出有效的抗EML4-ALK crizotinib 治療對(duì)NSCLC 患者降低了循環(huán)TEP 中EML4-ALK 轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量。由于正常血小板的壽命約為7～10 d，因此腫瘤衍生的轉(zhuǎn)錄本可以在TEP 中積聚并受到循環(huán)血漿衍生RNA 酶的保護(hù)，因此可以預(yù)期TEP RNA 分析會(huì)揭示出高表達(dá)的腫瘤最新活動(dòng)和反映其動(dòng)態(tài)。已有研究表明，NSCLC 通過釋放pf4 促進(jìn)血小板生成，然后血小板進(jìn)入肺和腫瘤實(shí)質(zhì)。

較CTC，腫瘤血小板更加豐富。但是目前分析的樣本數(shù)量相對(duì)較少，算法過度擬合的風(fēng)險(xiǎn)較高，獲得TEP 的技術(shù)仍在發(fā)展。

5 展望

液體活檢已經(jīng)發(fā)展成為一個(gè)非?；钴S的研究領(lǐng)域，尤其是CTC 和ctDNA 作為生物標(biāo)志物受到了廣泛的關(guān)注。盡管取得了重要進(jìn)展，但液體活檢的臨床應(yīng)用仍處于爭論之中，一些技術(shù)挑戰(zhàn)仍有待解決，其在早期癌癥檢測(cè)方面的應(yīng)用仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)?？傊疚乃龅母鞣N液體活檢平臺(tái)可能在癌癥患者的治療中相互補(bǔ)充。連續(xù)地實(shí)時(shí)液體活檢將有可能早期識(shí)別個(gè)體患者對(duì)癌癥治療的抵抗力，作為個(gè)體化癌癥醫(yī)學(xué)的重要標(biāo)志。