張 月，陳 風(fēng)，盧 瑩，袁 媛，陳清西

(福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002)

茉莉花(Jasminum sambac)是木犀科(Oleaceae)素馨屬(Jasminum)常綠灌木[1]，廣泛用于茉莉花茶的窨制、香料香精、化妝品、藥品、食品和園林等方面，是著名的芳香植物和香料作物[2]。此外，茉莉花的根、莖、葉皆可入藥，有重要的藥用價值。我國是茉莉花主產(chǎn)區(qū)，栽培面積占世界三分之二，年產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量一半以上[3]，因此茉莉花產(chǎn)業(yè)對于我國南方農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展有重要意義。

茉莉花自然敗育率高、結(jié)實困難[4]，很難通過雜交獲得新種質(zhì)，目前生產(chǎn)上主要通過扦插繁殖。長期的無性繁殖使母株的優(yōu)良性狀退化，植株退化香氣減弱現(xiàn)象經(jīng)常出現(xiàn)[5]。利用基因工程技術(shù)對香型進(jìn)行改造已在月季(Rosa hybrida)[6]、草莓(Fragaria × ananassa)[7]、矮牽牛(Petunia hybrida)[8]等多個物種中得以實現(xiàn)，為茉莉的香型改造提供了參考。但目前我國對于茉莉的研究仍以基礎(chǔ)種植[3,9—11]、茉莉花茶窨制[12—15]、香氣成分分析[16—17]等方面為主，在分子生物學(xué)方面的研究主要集中在香氣合成相關(guān)基因克隆[18—20]、分子標(biāo)記[21]等。多年來研究者一直在嘗試建立其遺傳轉(zhuǎn)化體系，但進(jìn)展緩慢。早期孫艷妮等[22]、何麗斯[23]、嚴(yán)華兵等[24]對雙瓣茉莉的離體快繁體系進(jìn)行了探索和優(yōu)化，但未建立轉(zhuǎn)化體系，后期甘煌燦等[25—26]探索了茉莉花愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系，主要以葉片和花瓣愈傷組織為對象，但對于轉(zhuǎn)化體系的條件摸索并未多作報道。目前，茉莉的遺傳轉(zhuǎn)化再生體系仍在探索中。

本研究嘗試以茉莉幼嫩的莖段為材料，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將GFP基因向茉莉進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，通過設(shè)置不同的預(yù)培養(yǎng)時間和篩選培養(yǎng)基抗生素濃度，統(tǒng)計抗性愈傷組織存活率、轉(zhuǎn)化后生長狀況以及檢測莖段或愈傷中GFP熒光，探索能獲得較高成活率的抗性愈傷組織以及適宜進(jìn)行轉(zhuǎn)化檢測的預(yù)培養(yǎng)和篩選方法，為利用茉莉轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

雙瓣茉莉種植于福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院的人工氣候室內(nèi)，氣候室溫度26 ℃，光照周期16 h/8 h(晝/夜)，相對濕度70%左右。剪取當(dāng)年生嫩枝作為外植體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

1.1.2 主要試劑

鏈霉素(Streptomycin,Str)；WPM培養(yǎng)基粉末(生工)；頭孢霉素(Cefotaxime sodium,Cef)；利福平(Rifampin,Rif)；6-BA(6-Benzylaminopurine)；NAA(1-Naphthalene acetic acid)；乙酰丁香酮(Acetosyringone,AS)；Tween-80；多菌靈；慶大霉素(Gentamicin,GM)；巴氏消毒液；卡那霉素(Kanamycin,Kan)；蔗糖(生工)；瓊脂粉(生工)。

1.1.3 農(nóng)桿菌菌株與載體

根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株株系為GV3101，植物表達(dá)載體為GFP陽性對照質(zhì)粒(pCAMBIA1300)骨架，細(xì)菌抗性Kan，植物抗性潮霉素Hyg，啟動子為35S。載體適合煙草注射瞬時表達(dá)及擬南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)等的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所陳松彪研究員惠贈。

1.1.4 培養(yǎng)基配方

1/2MS液體培養(yǎng)基：取2.22 g MS粉溶于1 L超純水中，121 ℃滅菌20 min備用。LB液體培養(yǎng)基：10 g胰蛋白胨，5 g 酵母提取物，10 g NaCl，溶解于1 L超純水中，調(diào)節(jié)pH 7.0左右，121 ℃滅菌20 min備用。LB固體培養(yǎng)基為LB液體培養(yǎng)基添加15 g·L-1瓊脂粉。WPM基本培養(yǎng)基：1 L超純水中加入2.14 g WPM粉末和0.56 g硝酸鈣，116 ℃滅菌30 min備用。

1.2 方法

1.2.1 材料處理

將枝條去除葉片和頂端幼嫩部分，剪成約3 cm莖段裝入500 mL錐形瓶。用洗衣粉水將莖段清洗干凈，超純水清洗5～8次。加50 mg·mL-1鏈霉素和0.5 g·L-1多菌靈于錐形瓶，200 r·min-1振蕩80 min。轉(zhuǎn)入干凈的組培瓶，加入適量75%酒精，以剛好沒過外植體材料為宜，輕柔晃動30 s，倒出酒精，無菌水清洗3～4次，倒入加有2～3滴Tween-80的20%巴氏消毒液(主要成分為NaClO) 100 mL，搖晃殺菌15 min，無菌水清洗多次，再將茉莉莖段切成長1 cm左右待接種。

1.2.2 預(yù)培養(yǎng)及其時間設(shè)置

在WPM基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加20 g·L-1蔗糖、6.75 mg·L-1NAA和2.25 mg·L-16-BA，6 g·L-1瓊脂，充分混勻，調(diào)節(jié)pH 5.8，高溫煮沸三次使瓊脂溶解，分裝于組培瓶，然后116 ℃高壓滅菌30 min。

每瓶接種5～7個莖段外植體，置于28 ℃左右、光照周期12 h/12 h(晝/夜)組培室內(nèi)培養(yǎng)，預(yù)培養(yǎng)天數(shù)設(shè)4、7、10、15、20 d，每種預(yù)培養(yǎng)條件接種120個。預(yù)培養(yǎng)后進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染，再轉(zhuǎn)至添加80 mg·L-1抗生素的篩選培養(yǎng)基，記錄篩選培養(yǎng)的抗性愈傷生長狀態(tài)，期間及時清理污染的組培瓶。

1.2.3 農(nóng)桿菌侵染液制備

將含GFP表達(dá)載體的農(nóng)桿菌在含有GM、Rif、Kan三種抗生素的LB培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，28 ℃培養(yǎng)2 d獲得單菌落，放置于4 ℃冰箱備用。侵染前兩天制備農(nóng)桿菌侵染液。挑取農(nóng)桿菌單菌落，放入5.0 mL LB液體培養(yǎng)基(含50 mg·L-1GM、50 mg·L-1Rif、50 mg·L-1Kan)，于28 ℃、200 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)過夜，再取適量菌液接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基(菌液OD600初始值0.2左右)繼續(xù)28 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)若干小時至OD600值為0.6～0.8。將菌液4000 r·min-1離心10 min收集菌體，加入重懸液(1/2 MS+100 mmol·L-1AS)，重懸菌體至OD600為0.6～0.8備用。

1.2.4 共培養(yǎng)

選取預(yù)培養(yǎng)的外植體放入滅菌組培瓶，并加入含GFP報告基因的農(nóng)桿菌侵染液侵染20 min，期間不斷輕柔晃動。取出外植體晾干，接種于共培養(yǎng)基(WPM+20 g·L-1蔗糖+6 g·L-1瓊脂+2.25 mg·L-16-BA+6.75 mg·L-1NAA+15 mg·L-1AS)，每瓶5～6個莖段，于28 ℃左右暗培養(yǎng)2 d。

1.2.5 篩選培養(yǎng)及抗生素濃度設(shè)置

用含300 mg·L-1Cef無菌水溶液清洗共培養(yǎng)茉莉莖段，重復(fù)3～4次，每次10 min，再用無菌水反復(fù)沖洗若干次。將茉莉莖段晾干接種至含有卡那霉素的篩選培養(yǎng)基(WPM+20 g·L-1蔗糖+6 g·L-1瓊脂+2.25 mg·L-16-BA+6.75 mg·L-1NAA+300 mg·L-1Cef)。其中，卡那霉素設(shè)置6個濃度，分別為40、60、80、100、120、140 mg·L-1。每濃度接種100個外植體，統(tǒng)計外植體的褐化數(shù)。

1.2.6 轉(zhuǎn)化愈傷組織中GFP熒光檢測

選擇預(yù)培養(yǎng)7 d再篩選培養(yǎng)3 d和30 d生長良好的抗性茉莉愈傷組織，以及預(yù)培養(yǎng)20 d再篩選培養(yǎng)14 d的茉莉莖段和莖段組織，在Leica體視熒光顯微鏡下觀察茉莉花抗性愈傷組織的GFP熒光。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)培養(yǎng)時間對茉莉莖段侵染后存活的影響

結(jié)果顯示，莖段預(yù)培養(yǎng)4 d，經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后外植體發(fā)生褐化和污染，成活率為55.8%；莖段預(yù)培養(yǎng)7 d時，莖段侵染后成活率顯著提升至80.8%；當(dāng)莖段預(yù)培養(yǎng)延長至10 d、15 d時，莖段侵染后成活率分別為76.7%、75.0%，顯著高于預(yù)培養(yǎng)4 d的莖段，說明愈傷組織生長較多(表1)。預(yù)培養(yǎng)7 d的莖段抗性愈傷生成率最高。

表1 預(yù)培養(yǎng)時間對雙瓣茉莉抗性愈傷存活的影響Table 1 Effect of pre-culture time on the survival of jasmine callus

2.2 抗生素濃度對茉莉外植體存活的影響

將預(yù)培養(yǎng)7 d的莖段進(jìn)行GFP基因農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化后接種至含不同濃度Kan的篩選培養(yǎng)基上。篩選培養(yǎng)30 d后，在含40 mg·L-1和60 mg·L-1Kan的培養(yǎng)基中莖段褐化率為0。隨著培養(yǎng)基中Kan含量不斷增加，愈傷組織褐化率不斷上升，當(dāng)Kan濃度為100 mg·L-1時，褐化率升至100%(表2)。確定適宜雙瓣茉莉愈傷組織篩選的Kan質(zhì)量濃度為80～100 mg·L-1。

表2 卡那霉素濃度對茉莉抗性愈傷組織褐化的影響Table 2 Effects of kanamycin concentration on browning of jasmine resistant callus

2.3 茉莉莖段遺傳轉(zhuǎn)化的GFP熒光檢測

預(yù)培養(yǎng)7 d后侵染可提高抗性愈傷的存活率，但侵染后長勢較慢(圖1:A,B)。相比之下，預(yù)培養(yǎng)20 d后莖段長出部分愈傷組織，雖然抗性愈傷的存活率相對較低，但侵染時接觸面更大，侵染后體積更大(圖1:C～F)。將GFP基因轉(zhuǎn)化預(yù)培養(yǎng)7 d的茉莉莖段，轉(zhuǎn)化3 d后及30 d后均可檢測到GFP熒光(圖2:A,C)，而未轉(zhuǎn)化的莖段中無GFP熒光(圖2:A,B)。將GFP基因轉(zhuǎn)化預(yù)培養(yǎng)20 d的茉莉莖段并篩選培養(yǎng)14 d后也可檢測到GFP熒光(圖2:D)，而未轉(zhuǎn)化莖段培養(yǎng)30 d后未能檢測到熒光(圖2:B)，說明GFP基因轉(zhuǎn)化莖段后，隨著莖段的生長，愈傷組織中也轉(zhuǎn)入了GFP基因。此外，直接轉(zhuǎn)化預(yù)培養(yǎng)天數(shù)更長的茉莉莖段愈傷組織，也可使GFP基因直接轉(zhuǎn)入愈傷組織中表達(dá)。

圖1 預(yù)培養(yǎng)7 d和20 d后進(jìn)行侵染并再培養(yǎng)30 d的茉莉莖段形態(tài)Fig.1 Morphology of jasmine stems pre-cultured for 7 d or 20 d and cultured for 30 d after transformed

圖2 GFP基因轉(zhuǎn)化茉莉莖段后熒光檢測Fig.2 Fluorescence detection of GFP in transformed jasmine stem and callus

3 討論

外植體在侵染前先預(yù)培養(yǎng)一定時間可以減輕農(nóng)桿菌感染過程中的應(yīng)激損傷，并促進(jìn)細(xì)胞分裂，使其處于對農(nóng)桿菌更加敏感的活化狀態(tài)，易于農(nóng)桿菌吸附，從而提高外植體的轉(zhuǎn)化效率[27]。甘煌燦等[25]使用茉莉花愈傷組織轉(zhuǎn)化外源基因，但對愈傷組織的來源和選用時間并未進(jìn)行交代。本研究設(shè)置5個不同的外植體預(yù)培養(yǎng)時間，發(fā)現(xiàn)預(yù)培養(yǎng)7 d后進(jìn)行侵染，獲得抗性莖段組織的存活率最高，但轉(zhuǎn)化后的莖段生長緩慢，遠(yuǎn)不如未轉(zhuǎn)化的莖段。預(yù)培養(yǎng)20 d的莖段可長出較大的愈傷，此時再進(jìn)行轉(zhuǎn)化，接觸面更大，雖然污染率也加大，但進(jìn)行外源GFP檢測時體積更大，更易觀察。

甘煌燦等[25—26]在對茉莉花愈傷組織轉(zhuǎn)化的探索中主要使用MS為基本培養(yǎng)基，并添加氨基酸和無機(jī)酸。本研究使用WPM為基本培養(yǎng)基，且未添加其他營養(yǎng)物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)、篩選培養(yǎng)等階段，莖段或愈傷組織在生長速度上未見顯著差異。

甘煌燦等[25]使用茉莉花愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化時，摸索了不同潮霉素濃度對茉莉愈傷組織生長的影響，發(fā)現(xiàn)愈傷組織對潮霉素較敏感，但未對其他常見的抗生素濃度進(jìn)行篩選。本研究探索了不同濃度Kan對茉莉莖段篩選的作用，發(fā)現(xiàn)適宜雙瓣茉莉愈傷組織篩選的Kan質(zhì)量濃度為80～100 mg·L-1，對于以Kan作為抗性的雙元載體轉(zhuǎn)化有參考意義。

甘煌燦等[25,28]用于轉(zhuǎn)化的茉莉花愈傷組織來自于莖段或花瓣。本研究主要使用莖段或帶愈傷組織的莖段進(jìn)行轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)莖段也可直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化，雖然后期污染率低，成活率高，但轉(zhuǎn)化后生長較慢；使用愈傷組織直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化，熒光檢測更易觀察，對于檢測GFP融合蛋白表達(dá)的研究可在獲得較好的檢測效果的前提下有效地縮短時間。本研究中，茉莉莖段進(jìn)行GFP基因轉(zhuǎn)化并篩選培養(yǎng)3 d和30 d，可在莖段和愈傷中檢測到GFP熒光，表示GFP基因隨著莖段的生長在愈傷中仍可表達(dá)，而不是一種瞬時表達(dá)?？蔀楹罄m(xù)茉莉花基因功能研究提供參考。