胡傳久 ，韓素芳，魏海龍，鄒景泉，賀 亮，付立忠，程俊文

（1.浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江省森林資源生物與化學(xué)利用重點實驗室，浙江 杭州 310023；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 311402）

三葉崖爬藤Tetrastigma hemsleyanum為葡萄科Vitaceae崖爬藤屬Tetrastigma多年生草質(zhì)藤本，分布于浙江、江西、福建、湖北、湖南、廣東、四川等地區(qū)。因遺傳基因所決定，三葉崖爬藤塊根外形呈橢圓形，但其中有許多呈酒葫蘆狀，這是其獨特的外貌特征[1-3]。藥理實驗證明三葉崖爬藤具有抗腫瘤、保肝、抗病毒、抗炎、鎮(zhèn)痛及解熱等藥理作用，并基本無毒[4-6]。多糖是構(gòu)成植物細胞壁的主要成分，三葉崖爬藤根中的多糖是其主要活性成分之一，與纖維素、蛋白質(zhì)等緊密聯(lián)結(jié)。同時，由于三葉崖爬藤根中淀粉含量較高，所以不易從中分離出活性多糖。

目前，三葉崖爬藤多糖（THPS）的提取方法多為傳統(tǒng)的熱水浸提法，該方法操作簡單，但提取時間長，而且高含量的淀粉會使提取液有很大的粘性，提取率低，所得多糖提取物的純度不高。生物復(fù)合酶具有水解淀粉、果膠和蛋白質(zhì)的作用，酶的高效性能夠節(jié)約提取能源與時間，酶的專一性使得到的產(chǎn)物穩(wěn)定，純度和活性高[7]。為此，本實驗采用淀粉酶、果膠酶、蛋白酶組成復(fù)合酶提取三葉崖爬藤根中的多糖，在提高多糖提取效率的同時可以有效去除多糖產(chǎn)物中的淀粉等雜質(zhì)，避免其它物質(zhì)對多糖含量測定的干擾，提高提取物中多糖的純度。另外，本文對該方法所提取的三葉崖爬藤多糖開展了體外抗氧化活性研究，旨在為三葉崖爬藤資源能夠更有效地應(yīng)用于醫(yī)藥保健領(lǐng)域提供試驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

三葉崖爬藤根，于2017 年11 月采自浙江省磐安縣三葉崖爬藤種植基地，三年生；蛋白酶（酶活力8×104U·g-1）、果膠酶（酶活力9×104U·g-1)和淀粉酶（酶活力5×104U·g-1）均購自上海伯奧生物科技有限公司；苯酚、無水乙醇、氯仿、正丁醇均為國產(chǎn)分析醇，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

R-201 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海申勝生物技術(shù)有限公司；20B 型中藥粉碎機，南京邦斯特制藥設(shè)備有限公司；DKZ-2型電熱恒溫振蕩水槽，上海福瑪實驗設(shè)備有限公司；PL602-S 電子天平，梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司；UV-2600 紫外分光光度計，日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 THPS 的提取 將當(dāng)年采集到的三葉崖爬藤根先用自來水沖洗干凈，再用蒸餾水沖洗晾干，然后放入真空冷凍干燥機中凍干，取干燥、潔凈的三葉崖爬藤根，用20B 型中藥粉碎機粉碎成40 目，用95%乙醇浸提12 h，抽濾，取濾渣風(fēng)干粉碎備用。稱取1 g 粉末，按液料比40∶1（mL∶g）加蒸餾水混勻，根據(jù)各種生物酶的最佳酶活作用條件，在前期預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，將淀粉酶、果膠酶、蛋白酶組成2∶2∶1（質(zhì)量比）的復(fù)合酶，然后在一定酶解溫度、加酶量、酶解時間下進行提取，3 000 r·min-1離心10 min，上清液用95%乙醇醇沉4 h 后再經(jīng)3 000 r·min-1離心5 min，沉淀用相應(yīng)試驗溶劑溶解后測定。

1.3.2 響應(yīng)面法分析實驗 選擇酶解溫度（X1）、加酶量（X2）、酶解時間（X3）3 個因素所確定的水平范圍，運用Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，采用三因素三水平的響應(yīng)面設(shè)計，利用Design Expert 8.05 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析。自變量的試驗水平分別以-1，0，1 進行編碼，試驗因素及水平設(shè)計見表1。

1.4 項目測定

1.4.1 THPS 含量的測定 采用苯酚-硫酸比色法[8]測定三葉崖爬藤根中的多糖含量。多糖得率計算公式如下：

表1 響應(yīng)面分析因子及水平Table 1 Factors and levels of RSM analysis

1.4.2 三葉崖爬藤多糖抗氧化能力測定 分別準(zhǔn)確稱取提取的THPS 及維生素C（Vc）各25 mg，用蒸餾水配制成1 000 μg·mL-1溶液，并用蒸餾水分別稀釋至0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg·mL-1。

1.4.2.1 抑制DPPH·能力的測定[9]取0.04 mg·mL-1的DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）溶液2 mL，分別加入2 mL 不同濃度的THPS 和Vc 溶液后混勻，靜置30 min 后在波長517 nm 處用UV-2600 紫外分光光度計測定其吸光度為A樣品，另取濃度為50%的乙醇和待測樣品溶液各2 mL 混合，在波長517 nm 處測定其吸光度為A對照，再將2 mL DPPH 乙醇溶液與2 mL 無水乙醇混合后在波長517 nm 處測定其吸光度Ac。根據(jù)所測得的不同吸光度值計算DPPH·清除率。

1.4.2.2 清除·O2-能力的測定[9]采用鄰苯三酚自氧化法，向試管中加入0.05 mol·L-1的Tris-HCl(pH=8.2）緩沖液4.5 mL，水?。?5℃）20 min，取出后加不同濃度的THPS 和Vc 各0.l mL，0.4 mL 鄰苯三酚（2.5 mmol·L-1，25℃預(yù)熱），搖勻后水浴4 min，最后加入1 mL18 mol·L-1的HCl 終止反應(yīng)，在波長560 nm 處測吸光值A(chǔ)1?？瞻捉M以蒸餾水代替記為A0。

按下式計算·O2-（超氧陰離子）清除率：

1.4.2.3 清除·OH 能力的測定[9]利用H2O2對Fe2+混合產(chǎn)生·OH（羥基自由基），加入水楊酸捕捉·OH 后產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在波長510 nm 處有最大吸收。反應(yīng)體系中含有2 mL 9 mmol·L-1FeSO4、2 mL 9 mmol·L-1水楊酸-乙醇、2 mL THPS 和2 mL Vc 溶液，最后加2 mL 8.8 mmol·L-1H2O2啟動反應(yīng)，37℃反應(yīng)0.5 h，以蒸餾水為參比，在波長510 nm 處測定各樣品的吸光度。考慮到實驗試劑本身的吸光度，以2 mL 9 mmol·L-1水楊酸-乙醇、2 mL 9 mmol·L-1FeSO4和2 mL 不同濃度的THPS 溶液為多糖的本底吸收。

式中，A0為對照（以蒸餾水代替多糖樣品）的吸光度；Ai為添加不同濃度THPS 樣品時的吸光度；A0i為無H2O2時多糖樣品的吸光度。

1.5 數(shù)據(jù)分析[10]

采用Design-Expert 8.0.5 軟件進行數(shù)據(jù)分析、統(tǒng)計及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 THPS 提取工藝

2.1.1 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken 中心組合試驗設(shè)計原理，設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗。共有17 個試驗點，其中12 個為析因點，5 個零點試驗用以估計試驗誤差。以THPS 得率為響應(yīng)值，試驗方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及試驗結(jié)果Table 2 Experiment design of RSM and results of RSM

2.1.2 回歸模型建立及方差分析 利用Design Expert 8.05 軟件對表2 實驗數(shù)據(jù)進行分析[9]，獲得THPS 得率對酶解溫度、加酶量、酶解時間的多元二次回歸方程：

由表3 可知，以THPS 得率為目標(biāo)函數(shù)的回歸方程的回歸效果不顯著，P值基本大于0.1；模型的決定系數(shù)R2=0.954 7，說明模型與實際實驗擬合較好；校正決定系數(shù)AdjR2=0.896 4，說明該模型能解釋95.47%響應(yīng)值的變化；模型的失擬項表示模型預(yù)測值與實際值不擬合的概率，表3 中模型失擬項的P值為0.086 0＞0.05，表明模型的失擬項不顯著；根據(jù)表3 的顯著性分析結(jié)果，因素一次項X1、二次項X12以及X32對THPS 得率均呈顯著影響（P＜0.05）。綜合以上分析表明，這個模型建立的回歸方程能運用于復(fù)合酶法提取THPS 提取條件優(yōu)化的理論預(yù)測。

2.1.3 響應(yīng)面圖形分析 分別將模型中的酶解溫度、加酶量、酶解時間的其中一個因素固定在0水平，得到另外兩個因素的交互影響結(jié)果，二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線如圖1、圖2 和圖3所示，各個因素及其相互間的交互作用對響應(yīng)值的影響結(jié)果通過該組圖可以直觀地反映出來。極值條件應(yīng)該在等高線的圓心處。由幾組圖可以看出，影響THPS提取得率的最顯著因素為酶解溫度（X1），表現(xiàn)為響應(yīng)面變化弧度較大。加酶量（X3）酶解時間（X2）響應(yīng)面弧度變化平緩，說明對響應(yīng)值影響相對較小。

此外，等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強弱，橢圓形表示二因素交互作用顯著，而圓形則與之相反[10]。從圖1 至圖3 可以看出，X1與X3之間的交互作用相對更顯著。

表3 回歸模型方差分析Table 3 ANOVA on regression model

圖1 酶解溫度和加酶量交互影響多糖得率的曲面圖（A）和等高線圖（B）Figure 1 Surface diagram and contour for polysaccharide yield by interaction of enzymatic hydrolysis temperature and total enzyme amount

圖2 酶解溫度和酶解時間交互影響多糖得率的曲面圖和等高線圖Figure 2 Surface diagram and contour for polysaccharide yield by interaction of enzymatic hydrolysis temperature and time

圖3 加酶量和酶解時間交互影響THPS 得率的曲面圖和等高線圖Figure 3 Surface diagram and contour for polysaccharide yield by interaction of total enzyme amount and hydrolysis time

2.1.4 驗證實驗 根據(jù) Box-Behnken 試驗所得的結(jié)果和二次多項回歸方程，利用Design Expert 8.05 進行數(shù)據(jù)分析，得到最佳提取條件為：酶解溫度51.7℃，加酶量2.8%，酶解時間92.3 min。在此條件下，THPS得率理論值可達3.97%。

為檢驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測值與實際實驗值之間的相關(guān)性，即檢驗響應(yīng)面優(yōu)化模型的可靠性，對THPS 的提取得率進行實驗驗證。實驗中酶解溫度、加酶量和酶解時間的優(yōu)化值分別為51.7℃，2.8%，92.3 min，三次平行實驗，測得THPS得率分別為3.83%，3.82%，3.87%，實際THPS 得率平均值為3.84%，達到了回歸模型預(yù)測理論值的96.7%，實驗結(jié)果與模型符合良好，說明該模型能較好地模擬和預(yù)測THPS 得率。

圖4 THPS 和Vc 對DPPH·的清除能力Figure 4 Scavenging capacity of polysaccharides and vitamin C on DPPH·

2.2 THPS 抗氧化結(jié)果

2.2.1 對DPPH·的清除能力 DPPH·是一種穩(wěn)定的以氮原子為中心的自由基，DPPH·法是評價天然化合物抗氧化能力的一種有效而靈敏的方法。圖4 為THPS 和Vc 清除DPPH·的能力。由圖4 表明，THPS 對DPPH·的清除能力隨著濃度的增加而增加，呈劑量依賴性。THPS 的IC50（半抑制濃度）值為0.32 mg·mL-1。當(dāng)THPS 的濃度達到0.8 mg·mL-1時，其對DPPH·的清除率為86.4%，濃度超過0.8 mg·mL-1后，清除率沒有明顯的增加。

2.2.2 清除·O2-能力的測定 THPS對·O2-的清除能力如圖5所示。由圖5中可以看出，在測試濃度范圍內(nèi)，THPS表現(xiàn)出很強的·O2-清除能力。THPS的IC50值為0.46mg·mL-1。在0.8mg·mL-1濃度時，THPS對·O2-的抑制率為77.6%，THPS 顯示出較強的對·O2-的清除能力。

2.2.3 清除·OH 能力的測定 ·OH 是最活躍的活性氧，具有誘導(dǎo)作用，嚴(yán)重破壞相鄰的生物分子，導(dǎo)致各種疾病。圖6 為不同濃度下THPS 和Vc 清除·OH 的能力。從圖6 中可以看出，THPS 和Vc 對·OH 的清除能力都與濃度的增加有很好的相關(guān)性。在0.4 mg·mL-1濃度以下，Vc 對·OH 的抑制作用明顯強于THPS，此后隨著濃度的增加，其抑制作用不再明顯增強，而THPS 的抑制作用繼續(xù)增強。THPS 的IC50值為0.37 mg·mL-1。在0.8 mg·mL-1濃度時，THPS 對·OH 的抑制率為77.8%。

圖5 THPS 和Vc 清除超氧陰離子自由基的能力Figure 5 Scavenging capacity of polysaccharides and vitamin C on superoxide anion

圖6 THPS 和Vc 清除·OH 的能力Figure 6 Scavenging capacity of polysaccharides and vitamin C on hydroxyl radical

3 結(jié)論與討論

目前對中藥植物類中多糖的提取及其含量的測定大多采用熱水浸提，或輔以微波法、酶解法，再通過苯酚-硫酸法測定含量[11-12]。由于苯酚-硫酸法無法有效地區(qū)別淀粉與活性多糖，因此，對于像三葉崖爬藤中根莖部分的成分，由于其富含大量的淀粉類（非活性多糖）物質(zhì)和果膠類粘性物質(zhì)，若只是簡單地采用傳統(tǒng)的提取方法再通過苯酚-硫酸法測定其多糖含量，往往會使測定的真實多糖的含量偏高。為此，本實驗針對三葉崖爬藤中根莖淀粉類物質(zhì)豐富的特點，采用淀粉酶、果膠酶和蛋白酶組成復(fù)合酶對三葉崖爬藤根進行酶解處理，對工藝中主要參數(shù)酶解溫度、加酶量和酶解時間等參數(shù)條件進行了實驗設(shè)計，根據(jù)Box-Benhnken 中心組合實驗設(shè)計及三因素三水平的響應(yīng)面分析，通過二次多項回歸模型進行方差分析和回歸擬合，預(yù)測了三葉崖爬藤多糖的最佳提取工藝條件為：酶解溫度51.7℃，加酶量2.8%，酶解時間92.3 min。在此工藝下，其多糖得率理論值可達3.97%。驗證實驗中多糖得率平均值為3.84%，與預(yù)測值十分接近，證明了該實驗方法的穩(wěn)定性。本實驗在提高多糖提取效率的同時可以有效去除多糖產(chǎn)物中淀粉等雜質(zhì)，避免非多糖類物質(zhì)對多糖含量測定的干擾，使其多糖含量測定值更加接近真實含量。

抗氧化實驗表明，三葉崖爬藤多糖具有一定的抗氧化能力，其對DPPH·，·O2-，·OH 清除作用的IC50分別為：0.32，0.46，0.37 mg·mL-1。當(dāng)三葉崖爬藤多糖的濃度達到0.8 mg·mL-1時，其對DPPH·，·O2-，·OH 的清除率分別為86.4%，77.6%，77.8%。何文等也報道三葉崖爬藤多糖具有較好的抗氧化活性[14]。同時，李盛等研究表明多糖的生物活性與其多糖的單糖組成，空間構(gòu)象有緊密的聯(lián)系[15]，有關(guān)三葉崖爬藤多糖生物活性與結(jié)構(gòu)間的關(guān)系及三葉崖爬藤多糖作為天然抗氧化劑等產(chǎn)品的應(yīng)用，值得進一步研究和開發(fā)。