劉亞潔, 安黎哲

(1. 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)教育部工程研究中心 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院, 蘭州 730020; 2. 蘭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 蘭州730000)

低溫是影響和限制植物生長最重要的環(huán)境因子之一,植物對(duì)低溫的響應(yīng)涉及不同水平上結(jié)構(gòu)和功能的變化。在低溫脅迫下,植物細(xì)胞會(huì)通過積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透平衡以緩解低溫對(duì)植物體造成的損傷,提高植物的抗寒性[1-2]。脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖是植物細(xì)胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),這些物質(zhì)的含量與植物的抗寒性密切相關(guān)。苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase, PAL)廣泛存在于各種植物和少數(shù)微生物中,是苯丙烷類代謝的關(guān)鍵酶和限速酶,研究發(fā)現(xiàn)低溫可以誘導(dǎo)PAL活性升高[3]。此外, 低溫脅迫誘導(dǎo)了一些基因的啟動(dòng)和大量表達(dá),這些基因稱為冷誘導(dǎo)基因(Cold-induced genes)或冷調(diào)節(jié)基因(Cold-regulated genes or cold-responsive genes,COR),它們在提高植物耐低溫能力方面發(fā)揮重要作用。

油菜素內(nèi)酯(Brassinosteroids, BRs)是一類甾醇類植物激素,在植物界中普遍存在,其中24-表油菜素內(nèi)酯(24-epibrassinolide, EBR)是使用最多、用途最廣泛的一種[4]。BRs對(duì)植物許多生理反應(yīng)起重要作用,如根的延長、花粉管生長、葉的卷曲和偏上性生長、根部生長抑制、誘導(dǎo)乙烯生物合成、激活質(zhì)子泵、木質(zhì)部分化以及核酸和蛋白質(zhì)的合成[5-6]。BRs還可以緩解逆境脅迫對(duì)植物造成的傷害,提高植物對(duì)逆境脅迫的抗性,特別是在提高植物耐冷性方面表現(xiàn)出了良好的效果[7-8]。然而,關(guān)于極端低溫脅迫(0 ℃)下BRs對(duì)植物細(xì)胞的影響少有研究。本試驗(yàn)以高山離子芥(Chorisporabungeana)懸浮細(xì)胞作為一個(gè)未分化的、均一的、相對(duì)脆弱的植物細(xì)胞模型來研究低溫脅迫下BRs對(duì)懸浮細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、PAL活性以及冷調(diào)節(jié)基因CbCOR15表達(dá)水平的影響,從而在細(xì)胞水平上闡明BRs影響植物響應(yīng)低溫脅迫的部分生理及分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

高山離子芥取材于新疆天山烏魯木齊河源區(qū),懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)參照Guo等[9]的方法。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將懸浮培養(yǎng)好的處于指數(shù)生長期的同一批材料轉(zhuǎn)接于加入0.1 μmol/L EBR的MS液體培養(yǎng)基中,常溫處理3 d后,立即置于0 ℃低溫光照培養(yǎng)箱中搖床培養(yǎng)處理1～5 d,搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min,每天取樣1次,以不加EBR的細(xì)胞為對(duì)照。研究EBR對(duì)CbCOR15基因表達(dá)的影響時(shí)取樣時(shí)間為低溫處理1、3、6、9、12、24、48、72、96和120 h,以不加EBR的細(xì)胞為對(duì)照。除處理時(shí)間外,其他環(huán)境條件均一致。處理結(jié)束后,按照Ishikawa等[10]提供的方法用400目雙層篩網(wǎng)過濾細(xì)胞,用蒸餾水清洗3遍,用濾紙吸干表面水分,鮮樣稱重,測定以下各生理指標(biāo)。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

1.3.1 生理生化指標(biāo)測定

脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖含量和PAL活性的測定參照李合生等[11]的方法。

1.3.2CbCOR15基因的表達(dá)分析

1)總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄。采用Trizol法提取總RNA。取2 μL RNA在1.0%的Agarose膠上跑電泳檢測,其余-70 ℃保存或者直接以總RNA為模板,用引物oligdT進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)的cDNA,放置于-20 ℃冰箱中備用。

2)基因擴(kuò)增引物序列。根據(jù)離子芥CbCOR15基因(基因登記號(hào)：EF208112)設(shè)計(jì)特異引物:上游引物:5′-CGCAAGAAGTCGTCGTT-3′,下游引物:5′-GTGGCATCCTTAGCATCT-3′。同時(shí)根據(jù)已知的高山離子芥Actin基因(基因登記號(hào)：AY825363)設(shè)計(jì)特異引物作為內(nèi)參,來調(diào)節(jié)每個(gè)樣品中的RNA含量。上游引物:5′-ATACGCTCTTCCACACGCTATTC-3′,下游引物:5′-TCACGATTTCACGCTCTGCT-3′。

3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。按SYBR Premix ExTaq(TaKaRa)操作手冊的要求在Multicolor Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad)上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。離子芥CbCOR15基因的擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性10 s；95 ℃變性15 s,55 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s,共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。高山離子芥Actin基因的擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性10 s；95 ℃變性5 s,59 ℃退火及延伸20 s,共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。

4)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。以梯度稀釋的cDNA為模板進(jìn)行與樣本條件相同的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng),用儀器配套軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)至少重復(fù)3次,用SPSS 19.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和方差分析,用Origin 9.0繪制數(shù)據(jù)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下EBR對(duì)細(xì)胞脯氨酸含量的影響

如圖1所示,在0 ℃脅迫下,對(duì)照細(xì)胞脯氨酸含量呈緩慢上升趨勢,在第5天又有所下降,經(jīng)過EBR處理的細(xì)胞脯氨酸含量在前3天顯著上升,雖然在第4天和第5天有所下降,但比未處理的對(duì)照分別提高了29.11%和46.26%。

2.2 低溫脅迫下EBR對(duì)細(xì)胞可溶性蛋白含量的影響

如圖2所示,在0 ℃脅迫下,EBR處理的細(xì)胞和未經(jīng)過EBR處理的對(duì)照細(xì)胞中可溶性蛋白含量均呈先上升后下降的趨勢,EBR處理的細(xì)胞中可溶性蛋白含量顯著增加,雖然在低溫處理第5天時(shí)，可溶性蛋白含量有所下降,但比對(duì)照提高了21.00%。

注:圖中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)；柱上不同字母表示經(jīng)Duncan法檢驗(yàn)在P<0.05水平差異顯著;下同

圖2 低溫脅迫下EBR對(duì)高山離子芥懸浮細(xì)胞可溶性蛋白含量的影響

2.3 低溫脅迫下EBR對(duì)細(xì)胞可溶性糖含量的影響

如圖3所示,在低溫脅迫前4天,EBR處理可以明顯提高細(xì)胞可溶性糖含量,到第5天EBR處理和未經(jīng)過EBR處理細(xì)胞的可溶性糖含量沒有明顯差異。未經(jīng)過EBR處理細(xì)胞的可溶性糖含量在低溫脅迫前3天沒有變化,到第4天呈上升趨勢。經(jīng)過EBR處理細(xì)胞的可溶性糖含量在前4天呈明顯上升趨勢,在第5天時(shí)又有所下降。

圖3 低溫脅迫下EBR對(duì)高山離子芥懸浮細(xì)胞可溶性糖含量的影響

2.4 低溫脅迫下EBR對(duì)細(xì)胞PAL活性的影響

圖4顯示了在0 ℃低溫脅迫下EBR處理對(duì)懸浮細(xì)胞PAL活性的影響。對(duì)照細(xì)胞的PAL活性在低溫脅迫前4天緩慢上升,第5天恢復(fù)到正常水平(0天)；EBR處理明顯提高了懸浮細(xì)胞的PAL活性,尤其是在處理后的第4天達(dá)到最大值,比對(duì)照提高了174.01%,處理后第5天細(xì)胞的PAL活性比對(duì)照提高了478.60%。

圖4 低溫脅迫下EBR對(duì)高山離子芥懸浮細(xì)胞PAL活性的影響

2.5 低溫脅迫下EBR對(duì)細(xì)胞CbCOR15基因表達(dá)的影響

如圖5所示,0 ℃低溫脅迫誘導(dǎo)了對(duì)照細(xì)胞CbCOR15基因在短時(shí)間內(nèi)大量表達(dá)(1～24 h),隨后呈緩慢上升的趨勢。在低溫脅迫初期(1～12 h),EBR處理的細(xì)胞中CbCOR15表達(dá)量顯著高于對(duì)照,隨著脅迫時(shí)間的延長,EBR處理并沒有提高CbCOR15基因的表達(dá)量,對(duì)照和EBR處理細(xì)胞的CbCOR15表達(dá)量沒有顯著差異。

圖5 低溫脅迫下EBR對(duì)高山離子芥懸浮細(xì)胞CbCOR15基因表達(dá)的影響

3 討論與結(jié)論

在本研究中,低溫脅迫促進(jìn)了對(duì)照細(xì)胞和EBR處理細(xì)胞脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量的上升,但在EBR處理的細(xì)胞中，這3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量升高的程度明顯高于對(duì)照(圖1～圖3)。以上結(jié)果與前人[12-14]在其他植物上的研究結(jié)果相一致。EBR處理可以增強(qiáng)低溫脅迫下細(xì)胞積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的能力,增強(qiáng)細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)功能,防止細(xì)胞過度脫水,緩解低溫對(duì)植物細(xì)胞造成的損傷,從而提高植物的抗寒能力。近幾年的研究[15]發(fā)現(xiàn),脯氨酸可以穩(wěn)定生物膜的結(jié)構(gòu)和功能,還可以清除活性氧,是羥基自由基清除劑。EBR處理可以清除冷害所造成的活性氧自由基大量積累,緩解氧化損傷[14]。本研究中，EBR誘導(dǎo)低溫脅迫下脯氨酸大量積累,EBR清除活性氧的生理功能可能與其對(duì)脯氨酸的調(diào)節(jié)有關(guān)。

PAL在植物形成次生物質(zhì)如木質(zhì)素、植保素等方面起重要作用,對(duì)植物生長發(fā)育、抵御病蟲害、防紫外輻射及構(gòu)成植物支撐系統(tǒng)等方面具有重要意義[16]。此外,許多植物在遭受到低溫、高溫、干旱、機(jī)械損傷及紫外輻射時(shí),植物的防衛(wèi)系統(tǒng)特別是苯丙烷類代謝被激活,PAL活性也會(huì)迅速上升,因此PAL活性可以作為植物抗逆境能力的一個(gè)生理指標(biāo)[3]。本研究結(jié)果表明EBR處理可以明顯提高懸浮細(xì)胞PAL活性,這種促進(jìn)效應(yīng)在0 ℃低溫脅迫后期表現(xiàn)得尤為顯著(圖4),這表明EBR可以通過提高植物的PAL活性來增強(qiáng)植物對(duì)低溫脅迫的抗逆性。目前,BRs對(duì)PAL活性的影響多局限于對(duì)病原體脅迫的研究中,BRs可以提高植物對(duì)病原體脅迫的抗性,這與BRs處理激活PAL活性有關(guān)[17-18]?？梢?BRs提高植物抗寒性和抗病性的機(jī)制存在一定的相似性,都有可能通過激活植物的苯丙烷類代謝防衛(wèi)系統(tǒng)來增強(qiáng)植物對(duì)逆境脅迫的抗性。

經(jīng)過長期的研究,大量冷調(diào)節(jié)基因被分離并鑒定出來。在眾多的冷調(diào)節(jié)基因中,對(duì)擬南芥AtCOR15a的研究比較深入和系統(tǒng)。AtCOR15a編碼的多肽具有兩親性的α-螺旋結(jié)構(gòu)域,有可能通過影響膜磷脂層內(nèi)部的彎曲性來減少膜遇冷時(shí)所產(chǎn)生的由脂雙層向六角形HII相位轉(zhuǎn)變的發(fā)生率,從而穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)以抵抗由于低溫或冰凍等引起的細(xì)胞脫水而造成的膜傷害[19]。高山離子芥CbCOR15基因編碼的親水性多肽也具有類似的功能[20]。在本研究中,低溫脅迫可以誘導(dǎo)CbCOR15大量表達(dá),EBR處理可以明顯提高低溫脅迫最初期(1～12 h)CbCOR15基因的表達(dá)水平(圖5),從而在低溫脅迫一開始就防止細(xì)胞膜六角形HII相位的產(chǎn)生,這有利于穩(wěn)定細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)和功能,從分子水平上提高植物的抗寒能力。

綜上,在低溫脅迫下,EBR處理通過提高高山離子芥懸浮細(xì)胞中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量,促進(jìn)PAL活性的升高以及誘導(dǎo)CbCOR15基因大量表達(dá)來增強(qiáng)其抗寒性。本研究結(jié)果可為合理利用外源EBR提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)支持。