石一，武頌文，李文涓，袁璐，李焱，張浩帆，馬國柱，劉東立*

1(陜西省疾病預(yù)防控制中心，陜西 西安，710054)2(西安醫(yī)學(xué)院，陜西 西安，710021)3(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部，陜西 西安，710061)4(西安市疾病預(yù)防控制中心，陜西 西安，710054)5(咸陽市疾病預(yù)防控制中心，陜西 咸陽，712000)

雞蛋隨著貯存時(shí)間的延長，其新鮮度下降，營養(yǎng)成分也會(huì)丟失[1]。國內(nèi)外學(xué)者圍繞雞蛋品質(zhì)積極探索主要是針對(duì)哈氏單位、質(zhì)量損失率、蛋黃系數(shù)和微生物含量等指標(biāo)[2-4]。傳統(tǒng)微生物計(jì)數(shù)的方法可以從整體上反映雞蛋的衛(wèi)生學(xué)情況，但很難反映出某種微生物具體的數(shù)量，不同培養(yǎng)基的選擇往往也會(huì)帶來一定程度的偏差[5]，操作復(fù)雜，時(shí)效性較慢。近年來越來越多的研究者通過分子生物學(xué)方法鑒定微生物的種類和變化情況，如變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)、16S～23S rRNA擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism, AFLP)和單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single strand conformation polymorphism, SSCP)等[6-8]。雖然這些技術(shù)方法具有免培養(yǎng)、快速等特點(diǎn)，但是不能對(duì)微生物的數(shù)量進(jìn)行絕對(duì)定量。

熒光定量PCR技術(shù)最大的特點(diǎn)就是可以準(zhǔn)確定量樣品中微生物的含量，SHI等[9]利用熒光定量PCR技術(shù)研究了米酒在釀造過程中酵母菌和乳酸菌的變化情況；TOFALO等[10]利用熒光定量PCR技術(shù)研究了餐用油橄欖在發(fā)酵過程中總酵母的數(shù)量變化情況，也有學(xué)者通過監(jiān)測食醋發(fā)酵過程中醋酸菌、乳酸菌的變化控制和提高產(chǎn)品的風(fēng)味[17]。

本研究旨在通過熒光定量PCR的方法，對(duì)3個(gè)地區(qū)鮮雞蛋在儲(chǔ)存過程中蛋殼表面4種優(yōu)勢菌屬(葡萄球菌屬、乳酸桿菌屬、鏈霉菌屬和腸球菌屬)進(jìn)行定量分析，從而為具體研究雞蛋腐敗微生物、延長雞蛋的貨架期奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

在榆林(YL)、漢中(HZ)和西安(XA)3個(gè)地市，分別選取一家具有代表性的蛋雞養(yǎng)殖場進(jìn)行取樣，采集當(dāng)天生產(chǎn)的雞蛋，每個(gè)養(yǎng)殖場收集30枚雞蛋，共3個(gè)批次。所有樣品遵循無菌采樣要求，存放于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱。采樣當(dāng)天即為第0天，并于后續(xù)4個(gè)時(shí)間點(diǎn)(第14、28、42和56天)分別使用一次性棉拭子收集蛋殼表面微生物標(biāo)本。所有拭子保存于-40 ℃冰箱，等待提取核酸。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取

使用德國Qiagen公司DNA提取試劑盒(51304)，采用改良的核酸提取方法提取樣本DNA。將采樣標(biāo)本拭子頭剪入1.5 mL離心管中。加入180 μL 20 mg/mL的溶菌酶，旋渦振蕩混勻37 ℃金屬浴30 min。加入25 μL蛋白酶K、200 μL AL，旋渦振蕩混勻56 ℃金屬浴過夜。短暫離心，將離心管中液體全部吸出轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中。加200 μL無水乙醇，振蕩混勻，剩余步驟參照說明書。

1.2.2 擴(kuò)增插入片段

針對(duì)4種菌屬按照文獻(xiàn)[11-13]合成特異性引物，引物序列見表1。25 μL PCR反應(yīng)體系包括：10×buffer 2.5 μL，正向/反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL，dNTP(10 mmol/L)0.5 μL，MgCl2(25 mmol/L)2.5 μL，rTaq(5 U/μL)0.2 μL，DEPC 水 16.3 μL，模板2 μL。PCR反應(yīng)程序如下：預(yù)變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 30 s，退火30 s(溫度見表1)，延伸72 ℃ 2 min，共40個(gè)循環(huán)；最終延伸72 ℃ 5 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。使用北京天根公司DNA純化回收試劑盒(離心柱型)對(duì)瓊脂糖電泳條帶清晰的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。

表1 四種優(yōu)勢菌屬引物序列和退火溫度Table 1 Primer sequence and annealing temperature of four dominant bacteria

1.2.3 插入片段與pMD18-T載體的連接

吸取1 μL載體 pMD18-T，1 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，3 μL DEPC 水和5 μL SolutionⅠ充分混合，室溫孵育1 h。

1.2.4 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化

吸取100 μL感受態(tài)細(xì)胞DH5α懸液到1.5 mL離心管中，將10 μL連接產(chǎn)物全部加入，吹打混勻，冰浴30 min。取出離心管，42 ℃金屬浴45 s，再放置冰中1 min。向離心管中加入890 μL SOC培養(yǎng)基，混勻后置于37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)1 h。吸200 μL懸液鋪于倒好的LB/Amp/X-gal/IPTG固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜。

1.2.5 篩選陽性轉(zhuǎn)化子

取出隔夜培養(yǎng)的平板，室溫放置1～2 h，觀察平板上的藍(lán)白斑菌落，挑取白色菌落至5 mL LB/Amp培養(yǎng)液試管中，37 ℃搖床培養(yǎng)12 h。吸取1 mL菌液，送至上海生工生物工程公司測序。

利用DNASTAR軟件對(duì)測序結(jié)果核苷酸序列進(jìn)行處理，得到目的片段基因序列。利用NCBI數(shù)據(jù)庫對(duì)得到的基因片段進(jìn)行BLAST比對(duì)，確定轉(zhuǎn)化效果。

1.2.6 質(zhì)粒提取

根據(jù)比對(duì)結(jié)果，選取轉(zhuǎn)化成功的質(zhì)粒，使用日本Takara公司MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取，最后得到標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.7 測定質(zhì)粒濃度

使用 Nanodrop微量核酸蛋白檢測儀測定質(zhì)粒濃度，應(yīng)用 Avogadro’s常數(shù)(1摩爾溶液大約有6.022 141 5×1023拷貝數(shù))計(jì)算質(zhì)?？截悢?shù)，按公式(1)、(2)、(3)和(4)計(jì)算：

質(zhì)量=質(zhì)粒質(zhì)量濃度(ng/μL)×體積(μL)

(1)

分子質(zhì)量(平均分子質(zhì)量)=(載體質(zhì)粒片段大小+插入片段大小)×(330 Da×2)

(2)

(注：每個(gè)堿基平均分子質(zhì)量為330 Da，每對(duì)堿基平均分子質(zhì)量為660 Da)

溶液摩爾數(shù)=質(zhì)量/分子質(zhì)量

(3)

拷貝數(shù)=溶液摩爾數(shù)×6.022 141 5×1023

(4)

1.2.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取8個(gè)0.2 μL PCR反應(yīng)管編號(hào)，每管加入20 μL DEPC水。從提取的質(zhì)粒溶液中吸取5 μL，加入到第1管中，旋渦振蕩3 s，充分混勻。更換槍頭后，從第1管中吸取5 μL溶液加入到第2管中，同樣振蕩3 s。以此類推直至第8管，按體積比1∶5進(jìn)行稀釋，蓋緊后短暫離心后備用。

1.2.9 熒光定量PCR擴(kuò)增

20 μL反應(yīng)體系包括：SYBR Green Realtime PCR Mix 10 μL，正/反向引物(10 μmol/L)各0.8 μL(引物序列同前)，ROX Reference Dye 0.4 μL，DEPC 水 6 μL，模板2 μL。預(yù)變性95 ℃ 5 min，變性95 ℃ 10 s，退火15 s(溫度同前)，延伸72 ℃ 45 s，共40個(gè)循環(huán)，72 ℃收集熒光，溶解曲線設(shè)置為默認(rèn)值。

1.2.10 統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 18.0軟件，組間差異性分析采用單因素方差分析的方法，當(dāng)P<0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果于分析

2.1 擴(kuò)增插入片段

隨機(jī)挑選3份提取好的樣本核酸，利用4種優(yōu)勢菌屬的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小與預(yù)期長度基本一致，葡萄球菌屬(150 bp)、乳酸桿菌(341 bp)、鏈霉菌(583 bp)和腸球菌(144 bp)。擴(kuò)增產(chǎn)物無明顯非特異性條帶，說明菌屬引物特異性較好，陰性對(duì)照均正常無污染。

a-乳酸桿菌屬和葡萄球菌屬;b-鏈酶菌屬;c-腸球菌屬圖1 特異性引物擴(kuò)增效果Fig.1 Specific primer amplification effect

2.2 陽性轉(zhuǎn)化子篩選

經(jīng)過平板篩選和DNA測序驗(yàn)證，4種優(yōu)勢菌屬的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒均構(gòu)建成功，通過提取質(zhì)粒可以用于標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本的制備。

2.3 葡萄球菌屬標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測結(jié)果

經(jīng)過qPCR測定，計(jì)算葡萄球菌屬標(biāo)準(zhǔn)曲線各參數(shù)分別為：E=84.71%，R2=0.998，Slope=-3.753，Tm=83.67(圖2-a)，R2值較好。不同取樣時(shí)間熒光定量PCR結(jié)果見表2。數(shù)據(jù)顯示HZ、XA組葡萄球菌屬的數(shù)量在14 d前均呈增多趨勢，而后持續(xù)減少。

2.4 乳酸桿菌屬標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測結(jié)果

乳酸桿菌屬標(biāo)準(zhǔn)曲線各參數(shù)分別為：E=88.73%，R2=0.996，Slope=-3.625，Tm=87.09(圖3-a)，不同取樣時(shí)間熒光定量PCR結(jié)果見表2。由表2可知，隨著時(shí)間延長，3組乳酸桿菌屬的數(shù)量在14 d后均呈下降趨勢。

a-標(biāo)準(zhǔn)曲線;b-熔解曲線;c-擴(kuò)增曲線圖2 葡萄球菌屬熒光定量PCR結(jié)果Fig.2 Staphylococcus qPCR results

表2 三個(gè)地市4種優(yōu)勢菌屬的比較 單位：拷貝數(shù)

a-標(biāo)準(zhǔn)曲線；b-熔解曲線；c-擴(kuò)增曲線圖3 乳酸桿菌屬熒光定量PCR結(jié)果Fig.3 Lactobacillus qPCR results

2.5 鏈霉菌屬標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測結(jié)果

經(jīng)過倍比稀釋，鏈霉菌屬標(biāo)準(zhǔn)品所測得的標(biāo)準(zhǔn)曲線各參數(shù)分別為：E=79.68%，R2=0.990，Slope=-3.929，Tm=89.93(圖4-a)。從表2數(shù)據(jù)可以看出,隨著時(shí)間的延長，YL、XA組鏈霉菌屬的數(shù)量整體呈上升趨勢。

2.6 腸球菌屬標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測結(jié)果

腸球菌屬標(biāo)準(zhǔn)曲線各參數(shù)分別為：E=102.71%，R2=0.999，Slope=-3.259，Tm=84.86(圖5-a)，R2值也較好，不同取樣點(diǎn)熒光定量PCR結(jié)果見表2。結(jié)果表明,HZ、XA組腸球菌屬的數(shù)量在28 d后才出現(xiàn)下降。

綜合來看，4種優(yōu)勢菌屬的擴(kuò)增曲線基線平整、指數(shù)區(qū)明顯，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性擬合度高，說明可信度高結(jié)果可靠，熔解曲線呈現(xiàn)單一熔解峰，說明無引物二聚體和非特異性產(chǎn)物。

2.7 不同地區(qū)間優(yōu)勢菌屬的比較

比較不同地區(qū)間4種優(yōu)勢菌qPCR結(jié)果后發(fā)現(xiàn)，葡萄球菌屬和腸球菌屬3組之間存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，說明受采樣地影響較為明顯。而乳酸桿菌和鏈霉菌2個(gè)菌屬則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

a-標(biāo)準(zhǔn)曲線；b-熔解曲線；c-擴(kuò)增曲線圖4 鏈霉菌屬熒光定量PCR結(jié)果Fig.4 Streptomyces qPCR results

a-標(biāo)準(zhǔn)曲線；b-熔解曲線；c-擴(kuò)增曲線圖5 腸球菌屬熒光定量PCR結(jié)果Fig.5 Enterococcus qPCR results

3 結(jié)論與討論

不同品牌的雞蛋蛋殼表面菌落總數(shù)在貯存初期介于9.315×102～1.367×104CFU/個(gè)[4]，隨著貯藏時(shí)間的變化呈上升趨勢，貯藏時(shí)間越長受污染的程度越大[18]。然而蛋殼表面的菌群多種多樣，只有少部分是致病菌，一些正常菌群的增加似乎起到了避免雞蛋被致病菌定植，防止雞蛋腐敗變質(zhì)的作用[22-23]。采用DGGE分析的方法與傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)的方法，所測得的細(xì)菌總數(shù)和多樣性也不盡相同[24]。

在美國雞蛋的貨架期通常被限定為45 d[19]，國內(nèi)銷售的散裝雞蛋目前大多沒有標(biāo)注生產(chǎn)日期，盒裝品牌雞蛋的保質(zhì)期根據(jù)儲(chǔ)藏溫度也有所不同，通常在30～60 d且尚未有完善的雞蛋貨架期標(biāo)準(zhǔn)。此次通過熒光定量PCR的方法發(fā)現(xiàn)，4種蛋殼表面的優(yōu)勢菌屬數(shù)量隨著儲(chǔ)存時(shí)間的變化各不相同，其中葡萄球菌屬、乳酸桿菌屬數(shù)量在儲(chǔ)存的前14 d呈現(xiàn)增多的趨勢，14 d后則下降。鏈霉菌屬數(shù)量整體呈上升趨勢，而腸球菌屬數(shù)量在儲(chǔ)存28 d 后呈下降趨勢。葡萄球菌屬是蛋內(nèi)發(fā)現(xiàn)的主要細(xì)菌之一，除此之外還有鏈球菌、大腸桿菌、變形桿菌、假單胞菌和沙門氏菌等均能引起禽蛋不同程度的腐敗變質(zhì)[20]。蛋殼表面葡萄球菌屬數(shù)量的增多與蛋內(nèi)葡萄球菌的污染是否有關(guān)有待進(jìn)一步研究。乳酸桿菌屬適宜在厭氧的環(huán)境下生長，此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示蛋殼表面的乳酸桿菌屬數(shù)量先增加后減少。有研究顯示乳酸菌能夠抑制某些腐敗菌引起的產(chǎn)膜、變色和使汁液渾濁等腐敗現(xiàn)象的發(fā)生[25]，除此之外，鏈霉菌也具有一定的抗菌活性[21]，此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果中鏈霉菌屬數(shù)量的增加是否與抑制其他細(xì)菌的生長有關(guān)還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。蛋殼表面乳酸桿菌屬和鏈霉菌屬的數(shù)量在3個(gè)地區(qū)間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，也許可以反映鮮雞蛋在儲(chǔ)存過程中品質(zhì)變化的真實(shí)情況。由于我們的樣品數(shù)量有限， 4種優(yōu)勢菌屬的統(tǒng)計(jì)學(xué)規(guī)律還有待進(jìn)一步研究。