黎玉瓊，黃雪利，高海慧，梁小軍，王勝義，宋曉平，崔東安，趙正偉

（1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，銀川 750002；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所/甘肅省中獸藥工程技術(shù)研究中心，蘭州 730050；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100）

胎衣不下指母畜在娩出胎兒后，胎衣不能在正常時(shí)間內(nèi)（一般是指超過12h）排出[1]。產(chǎn)后胎衣正常分離和排出是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及胎兒和母體內(nèi)多種生殖激素協(xié)同參與，任何激素水平的改變均有可能影響胎膜排出，導(dǎo)致胎膜滯留[2]。朱永剛等[3]研究發(fā)現(xiàn)，胎衣不下患牛血清和胎盤組織中的孕酮、纖維蛋白溶酶原、前列腺素以及雌二醇含量的變化可能參與了胎衣不下的發(fā)生和發(fā)展過程。其次，奶?？寡趸芰Φ慕档鸵彩翘ヒ虏幌碌闹饕±硪蛩亍＝獓萚4]的研究表明，血漿一氧化氮、丙二醛和谷胱甘肽過氧化物酶活性的變化可能是奶牛胎衣不下發(fā)生的原因之一?，F(xiàn)有的研究表明，奶牛機(jī)體抗氧化酶機(jī)能紊亂，隨之使雌激素生成減少，導(dǎo)致前列腺素F2α合成下降，子宮收縮力減弱，最終致使胎衣無法正常分離和順利排出[5,6]。

歸芎益母散是中藥制劑，治療奶牛胎衣不下臨床效果確切，有效率為85.9%～89.7%[7,8]。靶動(dòng)物安全性表明，歸芎益母散灌服、1次量400g/頭、每天1次、連用1～3d的用法與用量防治奶牛胎衣不下是安全的[9]。前期研究表明[8,10]，經(jīng)歸芎益母散治療后，受試奶牛血漿中 IL-2、TNF-ɑ、NO和6-keto-PGF1ɑ水平升高，而IL-4、IL-10、ET和TXB2水平降低，從而調(diào)節(jié)Th1/Th2型細(xì)胞因子、ET/NO以及TXB2/6-keto-PGF1ɑ趨于平衡，說明歸芎益母散不僅可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫機(jī)能，而且也可對抗內(nèi)皮功能紊亂和血小板功能紊亂，緩解患牛血瘀狀態(tài)。本試驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，通過研究歸芎益母散對血瘀型胎衣不下患牛生殖激素和抗氧化能力的影響，探討其作用機(jī)制，旨在為后續(xù)研究和臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1．1 藥物

歸芎益母散：400g/袋，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所研制。

益母生化散：250g/袋，購自華秦源（北京）動(dòng)物藥業(yè)有限公司（獸藥字（2012）010385148）。

1．2 試驗(yàn)動(dòng)物

荷斯坦牛，經(jīng)診斷確診為血瘀型胎衣不下奶牛。

1．3 主要試劑

谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒（LotNo:20170704），超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase SOD）試劑盒（LotNo:20170706），丙二醛（Malondialdehyde，MAD）試劑盒（LotNo:20170705），均購于南京建成生物工程研究所；碘[125I]雌二醇放射免疫分析試劑盒（LotNo:20170520），碘[125I]孕酮放射免疫分析試劑盒（LotNo: 20170520），PGF2αELISA 試劑盒LotNo:GR310884-3），均購于abcam公司。

1．4 主要儀器

HWS26電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），SpectraMax? M2e酶標(biāo)儀（Molecular Devices公司），SBC0060-230V離心機(jī)（Select BioProducts公司）。

2 方法

2．1 動(dòng)物的管理

舍飼飼養(yǎng)，配備臥床，按照高產(chǎn)、中產(chǎn)、低產(chǎn)以及干奶期進(jìn)行分群，每個(gè)圈舍按20%頸夾富余率調(diào)整牛群數(shù)量，并根據(jù)營養(yǎng)需要飼喂不同的全混合日糧，每日飼喂3次，自由采食、飲水。

2．2 動(dòng)物選擇

根據(jù)黃雪利[8,10]規(guī)定的診斷標(biāo)準(zhǔn)、辨證標(biāo)準(zhǔn)、納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)等入選標(biāo)準(zhǔn)，選擇受試奶牛。

2．3 分組與處理

將40頭血瘀型胎衣不下奶牛隨機(jī)分為4組，分別為歸芎益母散高、中、低劑量組和藥物對照組，每組10頭，另選擇10頭胎衣正常排出的健康奶牛為空白對照組（不給予藥物）。于給藥前，將藥物用20～25L開水浸泡30min，候溫，灌服，每天1次，連續(xù)用藥1～3d。

2．4 樣品制備

于用藥后第0天和第7天，頸靜脈采血10mL，靜置，冷藏過夜，37℃水浴30min，3 500r/min，離心10min，分離血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2．5 檢測指標(biāo)

采用黃嘌呤氧化酶法（羥胺法）、二硫?qū)ο趸郊姿岱ê土虼捅韧姿岱?，檢測受試奶牛血清SOD、GSH-Px、MDA的含量；采用放射免疫法測定血清前列腺素（PGF2α）、孕酮和雌二醇的含量，操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2．6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

運(yùn)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以“mean±std”表示，P＞0.05為差異不顯著，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

3 結(jié)果與分析

3．1 歸芎益母散對血瘀型胎衣不下奶?？寡趸芰Φ挠绊?/h3>

給藥后第0天，與空白對照組比較，胎衣不下患牛血清GSH-Px、SOD含量低，MDA含量高，差異極顯著（P＜0.01）（表1）。給藥后第7天，與空白對照組比較，高、中劑量組中奶牛血清GSH-Px、MDA、SOD水平無明顯變化（P＞0.05）；與藥物對照組比較，高、中劑量組奶牛血清GSH-Px含量高，差異極顯著（P＜0.01），低劑量組奶牛血清GSH-Px、MDA、SOD水平無明顯變化（P＞0.05）（表2）。

表1 給藥后第0天各組奶牛血清氧化指標(biāo)

表2 給藥后第7天各組奶牛氧化指標(biāo)的變化

3．2 歸芎益母散對血瘀型胎衣不下奶牛生殖激素的影響

用藥前與空白對照組比較，胎衣不下患牛血清孕酮偏高，差異極顯著（P＜0.01），雌二醇水平低，差異顯著（P＜0.05），PGF2ɑ含量亦低，差異極顯著（P＜0.01）（表3）。用藥后第7天，與空白對照組比較，歸芎益母散組奶牛血清中孕酮水平高，差異顯著（P＜0.05），PGF2ɑ含量差異不顯著（P＞0.05），高、中劑量組雌二醇差異不顯著（P＞0.05）；高、中劑量組孕酮極顯著低于藥物對照組（P＜0.01），高劑量組雌二醇顯著高于藥物對照組與低劑量組（P＜0.05）（表4）。

表3 用藥前各組血清激素含量變化

表4 用藥后第7天各組奶牛血清激素含量變化

4 討論

4．1 歸芎益母散對胎衣不下奶?？寡趸芰Φ挠绊?/h3>

正常情況下，機(jī)體的抗氧化能力與不斷產(chǎn)生的氧自由基的氧化能力之間保持著動(dòng)態(tài)平衡，不會(huì)引起組織損傷。若自由基產(chǎn)生異常增多或機(jī)體的抗氧化能力下降，將導(dǎo)致組織的氧化損傷[11]。SOD和GSH-Px是體內(nèi)清除自由基的主要酶類，這些酶類的活性反映了機(jī)體內(nèi)氧自由基被清除的能力，其氧化產(chǎn)物主要是MDA[12]。

鄧惠芳等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，奶水牛發(fā)生胎衣不下或子宮脫垂，其血漿和乳清中TAC水平降低，而MDA含量呈升高趨勢。Endler等[14]的研究表明，與胎盤正常自主排出產(chǎn)婦比較，胎衣不下患牛組織中GPX-1蛋白濃度水平降低，GPX1 mRNA表達(dá)量也出現(xiàn)下降趨勢。GPX是一種硒依賴性抗氧化酶，在細(xì)胞抗氧化防御中發(fā)揮重要作用。有研究報(bào)道，奶牛機(jī)體對活性氧抗氧化能力的下調(diào)，增加了奶?；继ヒ虏幌碌娘L(fēng)險(xiǎn)[15]。由此可見，機(jī)體對氧化酶抗氧化防御作用的抑制間接或直接影響胎衣不下的發(fā)生。

本研究中，胎衣不下奶牛血清GSH-Px和SOD活性較低，而MDA處于較高狀態(tài)。經(jīng)歸芎益母散治療后，患牛血清中GSH-Px活性上調(diào)，MDA含量下降，說明歸芎益母散可通過上調(diào)患?？寡趸富钚?，提高機(jī)體抗氧化能力，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)。其作用機(jī)理可能是，復(fù)方中益母草和川芎可提高GSH-Px活性[16,17]，當(dāng)歸中多糖和阿魏酸能夠降低MDA水平[18]。

4．2 歸芎益母散對胎衣不下奶牛生殖激素的影響

奶牛產(chǎn)犢前后，機(jī)體內(nèi)多種生殖激素協(xié)同參與胎衣分離和排出。其中，孕酮是一種維持妊娠的重要激素，可抑制子宮肌的自發(fā)性活動(dòng)，保持子宮安靜[19]。而分娩時(shí)，血漿孕酮水平降低，則可促進(jìn)子宮收縮；同時(shí)，雌激素水平升高，可促進(jìn)PGF2α合成，子宮收縮增強(qiáng)。因此，妊娠后期，機(jī)體孕酮和雌激素的協(xié)同作用，有利于胎兒娩出和胎衣排出[5,6]。

朱永剛等[3]研究發(fā)現(xiàn)，胎衣不下患牛血清和胎盤組織中孕酮、PGF2α水平明顯降低，而雌二醇水平則升高。Mcnaughton等[15]研究表明，胎衣不下患牛胎盤組織中雌二醇和PGF2α較低，而類固醇激素受體表達(dá)增加，導(dǎo)致子宮絨毛膜上皮細(xì)胞凋亡率降低，增加了奶牛胎衣不下發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。王曉芳等[20]探討了中藥“本草-產(chǎn)安”預(yù)防胎衣不下的效果及機(jī)制，結(jié)果顯示，試驗(yàn)組奶牛胎盤組織中孕酮水平顯著低于對照組，胎衣不下發(fā)病率極顯著低于對照組。上述結(jié)果表明，產(chǎn)前奶牛機(jī)體激素分泌紊亂可能參與了胎衣不下的發(fā)生過程。本研究中，胎衣不下患牛血清孕酮水平顯著較高，而雌二醇、PGF2α水平則明顯較低。

前期研究結(jié)果表明，益母草具有改善子宮、卵巢血液循環(huán)，調(diào)節(jié)性激素分泌和代謝的作用[21,22]；當(dāng)歸能顯著提高大鼠血清雌二醇的濃度[23]；當(dāng)歸-川芎可降低PGF2α濃度[24]；三棱-莪術(shù)組分配伍可降低子宮肌瘤病實(shí)驗(yàn)大鼠雌二醇、孕酮含量[25]，說明歸芎益母散中單味藥或合劑具有調(diào)節(jié)機(jī)體生殖激素的藥理作用。本研究表明，經(jīng)歸芎益母散治療后，胎衣不下奶牛血清孕酮水平明顯降低，而雌二醇含量升高，說明歸芎益母散可調(diào)節(jié)胎衣不下患牛血清激素失衡，進(jìn)而達(dá)到病愈的治療效果。

5 結(jié)論

本研究得出，歸芎益母散可通過提高患牛機(jī)體抗氧化能力以及調(diào)節(jié)患牛血清中生殖激素而達(dá)到治愈胎衣不下的治療效果。