上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院腎臟科，上海200127

在生物系統(tǒng)中，RNA同時(shí)具有信息分子和調(diào)控分子的雙重身份，不僅將遺傳信息從DNA傳遞到蛋白質(zhì)，同時(shí)調(diào)控著許多生物學(xué)過(guò)程，其中RNA的轉(zhuǎn)錄后修飾是這種多樣化調(diào)控功能的基礎(chǔ)[1]。在真核生物中，N6-腺苷酸甲基化（N6-methyladenosine，m6A）是mRNA內(nèi)部序列中最常見(jiàn)的一種甲基化修飾。通過(guò)甲基酶作用于第6位N原子，使其發(fā)生甲基化，從而影響mRNA的剪接、穩(wěn)定、運(yùn)輸、出核、定位、翻譯等過(guò)程[2-5]。近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)及其他化學(xué)分析技術(shù)的興起，RNA甲基化的研究取得了突破性的進(jìn)展，m6A作為最常見(jiàn)的mRNA甲基化修飾，成為了表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究熱點(diǎn)。本文就近年來(lái)有關(guān)m6A及其在免疫調(diào)控中作用的相關(guān)研究作一綜述。

1 m6A的發(fā)現(xiàn)及分布

1974年，Desrosiers等[6]首次在具有poly（A）片段的RNA中發(fā)現(xiàn)了mRNA的甲基化修飾，其中最主要的是m6A。哺乳動(dòng)物RNA分子中發(fā)生甲基化修飾的腺苷酸占0.1%～0.4%，相當(dāng)于每個(gè)mRNA分子存在3～5個(gè)m6A修飾位點(diǎn)[7]。然而，由于研究技術(shù)的限制，m6A在轉(zhuǎn)錄組水平的分布及其生物學(xué)功能一直未闡明。2011年，美國(guó)芝加哥大學(xué)一項(xiàng)研究[8]發(fā)現(xiàn)肥胖相關(guān)蛋白（fat mass and obesity-associated protein，F(xiàn)TO）可以去除m6A的甲基化修飾，證明m6A修飾是一種動(dòng)態(tài)、可逆的過(guò)程。類(lèi)似于DNA和組蛋白甲基化修飾在表觀遺傳調(diào)控中的重要作用，m6A可能具有同樣重要的調(diào)控功能，因而引起了研究者們的重新關(guān)注。2012年，2項(xiàng)分別發(fā)表在Nature和Cell的獨(dú)立研究[2,9]首次在人類(lèi)和小鼠轉(zhuǎn)錄組水平上闡明了m6A的分布，研究結(jié)果顯示m6A廣泛存在于哺乳動(dòng)物7 000余種mRNA以及300余種長(zhǎng)鏈非編碼RNA轉(zhuǎn)錄組中，主要在終止密碼子附近、3′端非編碼區(qū)和mRNA內(nèi)部長(zhǎng)外顯子富集，在人類(lèi)和小鼠mRNA中具有高度保守性。

2 m6A相關(guān)酶的組成

m6A是一種動(dòng)態(tài)、可逆的甲基化修飾，此修飾過(guò)程受甲基轉(zhuǎn)移酶（writers）、去甲基酶（erasers）和甲基化閱讀蛋白（readers）的共同調(diào)節(jié)。

2.1 m6A甲基轉(zhuǎn)移酶

甲基轉(zhuǎn)移酶是催化mRNA上的堿基發(fā)生甲基化修飾的一類(lèi)酶，又稱(chēng)為“writers”。m6A的甲基轉(zhuǎn)移酶是由多種蛋白質(zhì)組成的復(fù)合物，利用S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）為甲基供體，將腺嘌呤的第6位N原子上的氫甲基化，形成m6A。METTL3是最早發(fā)現(xiàn)的甲基轉(zhuǎn)移酶，最初被命名為MT-A70，具有SAM結(jié)合活性，在真核生物中具有高度保守性[10]。敲除METTL3后m6A甲基化修飾幾乎全部喪失[11]，因此，METTL3是m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物關(guān)鍵的組成部分，也是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能與SAM結(jié)合的甲基轉(zhuǎn)移酶。METTL14是與METTL3高度同源的另一甲基轉(zhuǎn)移酶，但METTL14缺乏SAM結(jié)合區(qū)域，無(wú)法與SAM結(jié)合，主要在識(shí)別底物RNA及定位上起到關(guān)鍵作用，并且與METTL3形成絡(luò)合物增強(qiáng)甲基酶的活性[10,12]。WTAP是m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物另一個(gè)重要組成成分。WTAP同樣缺少SAM結(jié)合區(qū)域，無(wú)甲基轉(zhuǎn)移酶活性，通過(guò)與METTL3和METTL14結(jié)合將甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物定位在核散斑上來(lái)調(diào)控甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物與靶標(biāo)RNA的結(jié)合，從而影響m6A的表達(dá)。WTAP缺失會(huì)抑制METTL3和METTL14在核散斑上的定位，導(dǎo)致m6A水平顯著降低[13]。因此，METTL3、METTL14、WTAP三者的結(jié)合是m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的中心活性組分。

KIAA1429和RBM15/15B是在WTAP的蛋白質(zhì)組學(xué)分析中發(fā)現(xiàn)的甲基轉(zhuǎn)移酶，下調(diào)KIAA1429、RBM15或RBM15B均可導(dǎo)致m6A水平大幅度降低；但目前對(duì)于KIAA1429如何影響甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物以及在m6A形成中的作用，尚未明確[14]。RBM15/15B可通過(guò)與m6A修飾位點(diǎn)附近的U富集區(qū)結(jié)合，從而招募甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物至甲基位點(diǎn)發(fā)揮甲基化功能[15]。METTL16是近來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種m6A形成酶，主要在U6小核RNA和甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶2A mRNA進(jìn)行RNA甲基化修飾[16]。

2.2 m6A去甲基酶

去甲基酶的發(fā)現(xiàn)是m6A研究領(lǐng)域的重大突破。m6A去甲基酶又稱(chēng)“erasers”，其作用是將m6A轉(zhuǎn)化為腺苷酸。FTO最早作為肥胖相關(guān)蛋白被發(fā)現(xiàn)，是AlkB雙加氧酶家族成員，大部分定位于核斑點(diǎn)，核內(nèi)RNA是FTO主要酶活性底物。沉默F(xiàn)TO可導(dǎo)致m6A的總體水平顯著升高，而FTO過(guò)表達(dá)可使得m6A水平下降[8]。Li等[17]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO作為m6A的去甲基酶在急性髓細(xì)胞性白血?。╝cute myeloid leukaemia，AML）中具有致癌作用。然而，2017年康奈爾大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)[18]在Nature上發(fā)表文章提出，與m6A非常相似的N6,2-O-二甲基腺苷（N6,2′-Odimethyladenosine，m6Am）修飾的去甲基酶也是FTO，而且FTO對(duì)m6Am的酶活性是m6A的100倍；因此，F(xiàn)TO雖然能將m6A去甲基化，但其真正的活性底物可能是m6Am。目前，關(guān)于FTO的功能仍然具有一定爭(zhēng)議。ALKBH5是AlkB家族另一具有m6A去甲基酶活性的蛋白質(zhì)，主要定位于細(xì)胞核，核內(nèi)mRNA及其他核內(nèi)的非編碼RNA是其主要的酶活性底物。與FTO不同，ALKBH5對(duì)m6Am無(wú)催化活性。Alkbh5基因敲除的小鼠表現(xiàn)出明顯的精子形成障礙，可能與減數(shù)分裂中期的精母細(xì)胞凋亡增加有關(guān)，ALKBH5可能通過(guò)調(diào)控m6A影響精子的形成[19]。

2.3 m6A甲基化閱讀蛋白

發(fā)生m6A修飾的RNA需與相應(yīng)的結(jié)合蛋白結(jié)合才能發(fā)揮特定的生物學(xué)功能，這類(lèi)蛋白又稱(chēng)為閱讀蛋白——“readers”。目前已知的閱讀蛋白主要包括YTH結(jié)構(gòu)域蛋白、真核起始因子（eIF3）和HNRNPA2B1。

哺乳動(dòng)物基因組中包含兩大類(lèi)YTH結(jié)構(gòu)域蛋白，分別是DC家族的YTHDC1、YTHDC2以及DF家族的YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3。3種YTHDF蛋白結(jié)構(gòu)非常相似，主要分布在細(xì)胞質(zhì)，能夠與mRNA的所有m6A修飾位點(diǎn)結(jié)合[2,4]。YTHDF2是研究最早的閱讀蛋白，廣泛存在于各種細(xì)胞中，通過(guò)招募CCR4-NOT腺苷化酶復(fù)合物將m6A結(jié)合使所在的RNA降解[20]。YTHDF1與eIF3及其他翻譯起始因子相互作用，參與蛋白翻譯過(guò)程[5]。YTHDF3的調(diào)控功能尚不明確。YTHDC類(lèi)蛋白主要分布在細(xì)胞核，DC1與未成熟的mRNA及一些核內(nèi)非編碼RNA結(jié)合，通過(guò)YTH區(qū)域介導(dǎo)m6A調(diào)控mRNA的剪切[3]。關(guān)于DC2的研究較少，研究[21]顯示，YTHDC2可能是結(jié)腸癌的診斷標(biāo)志物和治療的靶基因。

eIF3是翻譯起始前復(fù)合物的一個(gè)組成部分，結(jié)合在m6A的5′-UTR上介導(dǎo)mRNA的翻譯起始。eIF3可通過(guò)2種模式介導(dǎo)m6A調(diào)控mRNA的翻譯過(guò)程。一種是m6A直接結(jié)合并招募eIF3至5′-UTR[22]，另一種是由YTHDF1與在終止密碼子附近的m6A結(jié)合從而招募eIF3至5′-UTR[5]，具體機(jī)制尚不明確。HNRNPA2B1主要分布在細(xì)胞核中，參與微小RNA前體（pre-microRNA，pre-miRNA）的剪接和加工[2]。研究[23]發(fā)現(xiàn)，胰島素樣生長(zhǎng)因子2 mRNA結(jié)合蛋白可與m6A結(jié)合促進(jìn)mRNA的穩(wěn)定和蛋白翻譯，是m6A的另一種閱讀蛋白。

3 m6A的生物學(xué)功能

3.1 m6A影響mRNA成熟

從核內(nèi)的加工到細(xì)胞質(zhì)的翻譯和降解，m6A幾乎影響mRNA的每一階段。進(jìn)行選擇性剪接的mRNA具有更多的METTL3結(jié)合位點(diǎn)和m6A位點(diǎn)[2]。沉默小鼠胚胎干細(xì)胞Mettl3通常導(dǎo)致外顯子跳躍和內(nèi)含子保留剪接異常[11]。FTO可通過(guò)去除剪接位點(diǎn)周?chē)膍6A以及抑制與富含絲氨酸和精氨酸的剪接因子2（serine/arginine-rich splicing factor 2，SRSF2）的結(jié)合來(lái)調(diào)控選擇性剪接。YTHDC1通過(guò)招募SRSF3，同時(shí)阻斷SRSF10的結(jié)合，導(dǎo)致外顯子增加[3]。因此，m6A在mRNA的剪接加工方面具有重要的作用，從而影響mRNA的成熟。

3.2 m6A參與mRNA的運(yùn)輸

mRNA從核內(nèi)輸出是連接核內(nèi)轉(zhuǎn)錄、加工與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)翻譯的關(guān)鍵一步，能夠選擇性地調(diào)控基因的表達(dá)。METTL3的缺失可以抑制mRNA的輸出，而ALKBH5的缺失可以促進(jìn)mRNA向細(xì)胞質(zhì)輸出，因此m6A具有促進(jìn)mRNA向細(xì)胞質(zhì)輸出的作用。并且，研究者認(rèn)為，促進(jìn)mRNA向細(xì)胞質(zhì)輸出可能是m6A調(diào)控基因表達(dá)的主要機(jī)制[19,24]。

3.3 m6A調(diào)控mRNA翻譯效率

m6A促進(jìn)蛋白翻譯的作用主要與YTHDF1有關(guān)。YTHDF1通過(guò)與m6A修飾的mRNA結(jié)合，并且招募eIF3，顯著提高翻譯效率。YTHDF1不僅將甲基化的轉(zhuǎn)錄物與核糖體偶聯(lián)，同時(shí)還募集翻譯起始因子來(lái)加快翻譯的限速步驟[5]。近期，研究[25]發(fā)現(xiàn)，METTL3同樣具有m6A閱讀蛋白的作用，通過(guò)在翻譯起始期間募集eIF3促進(jìn)特定亞群mRNA中eIF4E依賴(lài)的翻譯。

3.4 m6A參與mRNA降解

在人類(lèi)和小鼠細(xì)胞中敲除METTL3和METTL14基因后，相應(yīng)的mRNA水平卻顯著提高，表明m6A與mRNA的穩(wěn)定性有關(guān)[26]。一般來(lái)說(shuō)，m6A作為mRNA的不穩(wěn)定劑發(fā)揮作用，促進(jìn)甲基化mRNA在各種生物環(huán)境中的降解。YTHDF2是第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的以m6A依賴(lài)方式降解mRNA的蛋白。YTHDF2蛋白的羧基端YTH結(jié)構(gòu)域可選擇性地與甲基化轉(zhuǎn)錄物結(jié)合，通過(guò)氨基末端的功能結(jié)構(gòu)域?qū)⒔Y(jié)合的轉(zhuǎn)錄物傳遞到細(xì)胞質(zhì)RNA降解機(jī)制區(qū)進(jìn)行降解[4]。

4 m6A參與免疫調(diào)控

4.1 m6A參與機(jī)體固有免疫反應(yīng)

2005年，Karikó等[27]發(fā)現(xiàn)，暴露于RNA修飾如m6A的樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞因子及活化標(biāo)志物顯著低于不含m6A的細(xì)胞。DEAD-box（DDX）螺旋酶對(duì)于RNA的識(shí)別和代謝至關(guān)重要，也是啟動(dòng)機(jī)體抗病毒固有免疫的關(guān)鍵。研究[28]發(fā)現(xiàn)，核內(nèi)DDX蛋白質(zhì)家族成員DDX46可抑制病毒感染后Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。在病毒感染后，DDX46通過(guò)DEAD螺旋酶結(jié)構(gòu)域招募ALKBH5使得m6A修飾的抗病毒轉(zhuǎn)錄物去甲基化，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄物滯留于細(xì)胞核，抑制蛋白翻譯。因此，DDX46可通過(guò)消除m6A修飾將選定的抗病毒轉(zhuǎn)錄物滯留在細(xì)胞核中，從而抑制抗病毒固有免疫反應(yīng)。近期，研究[29]發(fā)現(xiàn)，在樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）中，m6A通過(guò)YTHDF1調(diào)控腫瘤免疫反應(yīng)。與野生型小鼠比較，Ythdf1基因缺陷型小鼠抗原特異性CD8+T細(xì)胞抗腫瘤免疫反應(yīng)顯著增強(qiáng)，經(jīng)典DCs中YTHDF1的缺失可顯著增強(qiáng)腫瘤抗原的交叉呈遞和CD8+T細(xì)胞的交叉激活作用。因此，YTHDF1可作為抗腫瘤免疫治療的潛在靶點(diǎn)。

4.2 m6A調(diào)控初始T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和分化

初始T細(xì)胞在不同的特定條件下可分化為不同的T細(xì)胞亞群。2017年Li等[30]在Nature首次報(bào)道，m6A通過(guò)靶向初始T細(xì)胞IL-7/STAT5/SOCS信號(hào)通路中的信號(hào)分子影響T細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，Mettl3基因敲除小鼠來(lái)源的初始T細(xì)胞分化為輔助性T細(xì)胞（helper T cell，Th）1和Th17細(xì)胞比例顯著減少，Th2細(xì)胞比例顯著增多，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）比例無(wú)顯著變化。將這種初始T細(xì)胞轉(zhuǎn)輸至腸炎模型中，初始T細(xì)胞將無(wú)法進(jìn)行穩(wěn)態(tài)增殖和分化，維持初始狀態(tài)長(zhǎng)達(dá)12周，從而抑制小鼠慢性腸炎的發(fā)生。該研究首次揭示了m6A修飾在哺乳動(dòng)物T細(xì)胞介導(dǎo)的腸炎中的重要作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，m6A通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制物（suppressor of cytokine signaling，SOCS）蛋白家族mRNA降解，來(lái)調(diào)控IL-17/STAT5信號(hào)通路介導(dǎo)的初始T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)增殖和分化。

4.3 m6A維持Treg細(xì)胞免疫抑制功能

Treg是一類(lèi)具有免疫抑制功能的由初始T細(xì)胞分化而來(lái)的CD4+T細(xì)胞。有研究[31]發(fā)現(xiàn)，m6A具有維持Treg細(xì)胞免疫抑制功能的作用。該研究顯示Treg細(xì)胞特異性缺失Mettl3的小鼠，在斷乳后表現(xiàn)出外周淋巴結(jié)腫大、脾腫大、脫發(fā)等嚴(yán)重自身免疫性疾病的表現(xiàn)。出生后10 d和20 d的Mettl3缺失小鼠的Treg細(xì)胞在脾和胸腺的比例、數(shù)量與野生型小鼠無(wú)明顯差異；但在60 d時(shí)由于過(guò)度炎癥而衰竭，并且Mettl3缺失的Treg細(xì)胞免疫抑制功能顯著降低。類(lèi)似于m6A調(diào)控初始T細(xì)胞的機(jī)制，研究者同樣發(fā)現(xiàn)敲除Mettl3可導(dǎo)致特定Socs基因轉(zhuǎn)錄物中m6A修飾減少，使得SOCS家族蛋白mRNA表達(dá)上調(diào)，從而抑制與Treg細(xì)胞抑制功能相關(guān)的IL-2/STAT5信號(hào)通路，使得Treg抑制功能喪失。因此，m6A在調(diào)控T細(xì)胞分化及維持Treg細(xì)胞抑制功能中具有重要的作用，表明m6A可能是自身免疫性疾病治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。

5 m6A與疾病的關(guān)聯(lián)性

5.1 m6A與腫瘤

m6A在基因表達(dá)調(diào)控中的重要作用表明了其可能參與了腫瘤的發(fā)生。目前，在肝細(xì)胞癌[32]、腎癌[33]以及AML[17]等多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)異常的m6A修飾及其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的重要作用。Gong等[33]研究發(fā)現(xiàn)，m6A在腎細(xì)胞癌組織RNA中顯著降低，METTL14通過(guò)調(diào)控m6A修飾水平減少ATP受體P2RX6蛋白翻譯從而抑制腎細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移。Li等[17]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO高表達(dá)于AML的t(11q23) /MLL-重組、t(15;17)/PML-RARA、FLT3-ITD或NPM1突變亞型中。FTO可通過(guò)降低AML轉(zhuǎn)錄物中m6A水平，調(diào)節(jié)ASB2、RARA等靶基因的表達(dá)，促進(jìn)白血病癌基因介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化和白血病發(fā)生，并抑制全反式維甲酸（alltrans retinoic acid，ATRA）誘導(dǎo)的AML細(xì)胞分化。因此，異常的m6A修飾與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

5.2 m6A與心血管疾病

心血管疾病是慢性腎臟病主要的并發(fā)癥和死亡原因。Dorn等[34]發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞METTL3表達(dá)增加可導(dǎo)致心臟代償性肥大，但不影響心臟功能，而METTL3基因敲除可誘導(dǎo)心肌重構(gòu)，并表現(xiàn)出心臟衰竭的形態(tài)學(xué)和功能性的體征。Mathiyalagan等[35]提出，F(xiàn)TO可選擇性地去甲基化心肌收縮轉(zhuǎn)錄物，從而防止其降解并提高其在缺血時(shí)的蛋白表達(dá)。此外，在心肌梗死小鼠模型中FTO的過(guò)表達(dá)可降低纖維化和增加血管生成。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）在人類(lèi)基因組中廣泛存在。研究[36]顯示，m6A相關(guān)的SNPs可能與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，其中SNP rs12286在全基因組與該病顯著相關(guān)。

5.3 m6A與糖尿病

糖尿病是繼發(fā)性腎病的主要病因之一。研究[37]顯示，m6A可能是2型糖尿病的新型標(biāo)志物。與對(duì)照組比較，2型糖尿病患者及糖尿病大鼠的RNA中m6A含量顯著降低，并且2型糖尿病患者FTO的mRNA表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。Yang等[37]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者與FTO血糖水平呈正相關(guān)，并且在人肝癌細(xì)胞中，高血糖水平可顯著上調(diào)FTO蛋白表達(dá)量。因此，高血糖水平可能是導(dǎo)致2型糖尿病患者FTO表達(dá)增加的刺激因子。

5.4 m6A與自身免疫性疾病

自身免疫性疾病是一類(lèi)由于機(jī)體對(duì)自身抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而導(dǎo)致自身組織損害的疾病，也是繼發(fā)性腎臟疾病的主要病因之一。基于在免疫調(diào)節(jié)尤其是T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和分化中的重要作用，m6A可能與自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制息息相關(guān)。目前，已有研究[38]顯示m6A相關(guān)的SNPs（m6A-associated SNPs，m6A-SNPs）可能在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）的發(fā)病中扮演重要的角色；該研究共發(fā)現(xiàn)37個(gè)在亞洲或歐洲人的全基因組水平上與RA顯著相關(guān)的m6A-SNPs，其中包括編碼主要組織相容性復(fù)合體的基因，如C6orf10中的rs1033500和HLA-DPB1中的rs1042136，為研究m6A與RA以及自身免疫性疾病之間的關(guān)系提供了新的思路。

6 總結(jié)與展望

目前，m6A作為真核細(xì)胞中最常見(jiàn)、最豐富的mRNA轉(zhuǎn)錄后修飾，已經(jīng)得到了研究者們的廣泛關(guān)注。甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基酶以及閱讀蛋白調(diào)控的動(dòng)態(tài)可逆的甲基化過(guò)程是m6A表觀遺傳調(diào)控功能的基礎(chǔ)。m6A在免疫細(xì)胞分化及調(diào)控功能中的重要作用表明其可能是免疫相關(guān)性疾病治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。因此，進(jìn)一步研究m6A在免疫相關(guān)性疾病及其繼發(fā)的腎病中的作用，可能為該類(lèi)患者的治療帶來(lái)新的希望。