孫雪騏，肖英，彭芳，王建，張功亮

（贛州市人民醫(yī)院病理科，江西 贛州 341000）

在我國，前列腺癌發(fā)病率已位居男性惡性腫瘤前列，也是全球與死亡腫瘤相關(guān)的主要原因之一[1]。目前是采用前列腺穿刺活檢的方法來診斷前列腺癌，然而確診之后卻缺乏簡便及準確的指標來監(jiān)測和指導(dǎo)前列腺癌的預(yù)后及個體化治療[2]。 經(jīng)直腸或會陰方法進行前列腺活檢是一種侵入性創(chuàng)傷的檢查，且 偶爾伴有血尿、急性尿潴留、尿路感染和敗血癥等[3]。 血清前列腺特異性抗原（prostate-specific antigen，PSA） 是輔助臨床診斷前列腺癌的常用檢查項目[4]，可作為反映治療和疾病進展有用的生物標志物，但在轉(zhuǎn)移性去勢抵抗性前列腺癌（metastatic castration-resistant prostate cancer，mCRPC）中已經(jīng)被證實不能反映臨床療效，也不能反映患者總體生存率[5]。

循環(huán)腫瘤細胞 （circulating tumor cell，CTC）是指在腫瘤形成或進展過程中從原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落進入血液循環(huán)的腫瘤細胞。 研究表明CTC 可以為臨床提供更全面了解腫瘤生物學(xué)和腫瘤傳播[7]重要信息。 CTC 檢測作為一種新型的非侵入性診斷手段，彌補了傳統(tǒng)方法的不足，具有高度敏感性，能及時反應(yīng)腫瘤的惡性程度和侵犯能力，早于影像學(xué)預(yù)測復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，相較血清學(xué)PSA 檢測，其靈敏度及特異性好，可定性、定量檢測，并可作為腫瘤細胞分子生物學(xué)檢測的標本，實現(xiàn)適時、動態(tài)、檢測，為癌癥患者提供實時和連續(xù)的“液體活檢”檢查，實現(xiàn)實時監(jiān)測癌癥進展， 且對有足夠多CTC 的患者進行下一步治療[8]。 在前列腺癌的精準診療中引進CTC 這種更具創(chuàng)新有效、 更少侵入性的生物標記物的研究將有助于前列腺癌的診斷、 治療及預(yù)后。 本文將總結(jié)分析CTC 在前列腺癌中的技術(shù)潛力、應(yīng)用以及提供用于指導(dǎo)mCRPC 的預(yù)后信息。

1 CTC 的概述

1869 年，Ashworth 醫(yī)生首次提出了 CTC 的概念[9]，指出其能反映原發(fā)腫瘤的特性。 隨著科學(xué)研究的深入，那些被認為具有干細胞樣屬性且能夠啟動腫瘤生長的腫瘤細胞在尚未增殖形成可見病灶時，就可以進入血液循環(huán)形成CTC[10]。 科研人員發(fā)現(xiàn)入血后的腫瘤細胞隨著血液快速流動， 大約30秒循環(huán)全身，期間與血液中其他血細胞碰撞、受到血管壁的擠壓，并且遭受機體免疫系統(tǒng)以及化療藥物的攻擊，最終大多數(shù)都發(fā)生凋亡或壞死。 只有極少數(shù)的CTC 克服上述困難，最終存活下來，逃離機體免疫識別或藥物治療的CTC，在體內(nèi)尋找合適的微環(huán)境，最終造成腫瘤的轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)[11，12]。因此，CTC的研究可以促進轉(zhuǎn)移腫瘤細胞的優(yōu)勢識別，并為了解這些細胞的功能提供前景及方向。 CTC 的分子分析有助于闡明前列腺癌的侵襲性、適應(yīng)性、腫瘤傳播和轉(zhuǎn)移的機制。

2 CTC 的生物學(xué)特性及應(yīng)用

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）在中胚層發(fā)育、傷口愈合和纖維化中起著至關(guān)重要的作用[13]。參與細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化為以波形蛋白為主，細胞間黏附能力下降，運動能力增加，從而可促使單個腫瘤細胞從腫瘤組織中脫落游走遷移至血管， 認為EMT 在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中起著關(guān)鍵作用[14]。 雖然EMT 的概念在腫瘤中仍是一個爭論的話題，但腫瘤組織中間充質(zhì)標志物的表達已被報道是多種腫瘤包括前列腺癌中預(yù)后較差的因素[15]。有研究指出了EMT 標志物在CTC 中的表達較高[16]。 另一些研究認為腫瘤細胞從上皮間充質(zhì)遷移，獲得干細胞特性， 具有自我更新分化的能力，EMT細胞同時表達了上皮標志物(如cytokeratins、E-cad henn 等)和間充質(zhì)標志物（如 N-cadherin， O-cadherin， vimentin， twist， fibronectin， serpin peptidase inhibitor 等），表明上皮細胞可能向間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)變[17]。 這一發(fā)現(xiàn)提示CTC 中EMT 相關(guān)基因的表達增加與mCRPC 相關(guān)，這些與EMT 相關(guān)基因特征可能為患者分層和個體化治療提供新的機會。 大多數(shù)CTC 捕獲技術(shù)都依賴于上皮標記物的表達例如上皮細胞粘附分子 （epithelial cell adhesion molecule，EpCAM），所以EMT 在CTC 的研究中受到了限制[18]， 隨著CTC 分離技術(shù)的不斷發(fā)展和CTC 分子定性技術(shù)的不斷完善，CTC 的功能表征將有助于闡明體內(nèi)EMT 的過程，明確腫瘤轉(zhuǎn)移機制。

CTC 生物標志物可能反映腫瘤對治療的耐受性和生存能力， 而檢測CTC 分子圖譜中蛋白質(zhì)生物標志物的表達、遺傳變異和基因表達，可以利用這些信息監(jiān)測治療和檢測耐藥反應(yīng)[19]。隨著新技術(shù)的發(fā)展，在不同水平（蛋白質(zhì)、DNA、RNA 和表觀遺傳學(xué)）的CTC 高通量分子技術(shù)得到了快速發(fā)展。

3 CTC 的臨床應(yīng)用及療效評估

除了生物用途外，CTC 分析還具有作為臨床生物標志物平臺的潛力。 在臨床應(yīng)用上，CTC 可以在前列腺癌的治療疾病狀態(tài)中提供預(yù)后、預(yù)測、藥效學(xué)或替代用途，從局部疾病轉(zhuǎn)移到mCRPC 和新型治療的發(fā)展。 從CTC 中用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription PCR，RT-PCR)獲取的 PSA 是最早證實mCRPC 患者臨床相關(guān)預(yù)后信息的檢測方法之一[20]。 盡管該方法相對容易使用和評估，而且除了血清PSA 蛋白檢測之外還提供了獨立的預(yù)后信息，但該方法并未得到進一步的發(fā)展[21]。 高達30%前列腺癌患者會出現(xiàn)PSA 升高，但當前列腺癌Gleason 評分及預(yù)后分級分組較高時或患者進入CRPC 階段，PSA 水平與腫瘤分級不成正比[22]，在患者根治性前列腺術(shù)后進行放射治療期間，這種檢測方法有利于評測腫瘤情況和檢測早期復(fù)發(fā)[23]。在早期前列腺癌中可以檢測到CTC，并指出在前列腺癌治療后患者CTC 水平的降低可能是放射治療反應(yīng)的結(jié)果[24]。CTC 計數(shù)是CRPC 患者生存率的一個潛在的獨立預(yù)后因素，患者開始化療后，CTC 數(shù)量相比于PSA 的水平更先發(fā)生變化， 因此癌癥患者CT C 的計數(shù)在轉(zhuǎn)移性疾病的早期診斷中起關(guān)鍵作用[25]。研究表明CTC 數(shù)目與PSA 水平、腫瘤大小和增大的淋巴結(jié)之間存在一定相關(guān)性[26]，說明CTC 可以聯(lián)合PSA 作為診斷及檢測前列腺癌的標志物。CTC 的計數(shù)變化可以作為一個連續(xù)變量并對此進行分析，預(yù)估患者總體生存率并提供關(guān)于疾病進展的獨立預(yù)后信息，從而監(jiān)測疾病治療效果[27]。

4 CTC 的分離富集方法和生物學(xué)應(yīng)用

第一個FDA 認證分析和臨床驗證CTC 檢測平臺是CellSearch，CellSearch是一種基于免疫磁性分離原理發(fā)展起來的半自動化CTC 檢測儀器，捕獲表達EpCAM 的細胞，抗EpCAM 抗體與鐵磁珠結(jié)合， 細胞被分離出來， 然后對細胞角蛋白（cytokeratin，CK） 和 CD45 進 行 染 色 。 使 用CellSearch的初步臨床研究[28]評估了964 名患有惡性疾病的患者，其中123 人是轉(zhuǎn)移性前列腺癌。一共有188 名患者提供了樣本(每個樣本有7.5 ml全血)，其中77 個(41%)的樣本有5 個以上數(shù)量的CTC。 在344 個健康志愿者或良性疾病樣本中，5%的人每7.5 ml 血液中有1 個CTC，在 7.5 ml 血液中沒有一個 CTC 超過 2 個。 因此，CellSearch能作為檢測前列腺癌患者CTC 的敏感平臺。此外，通過重復(fù)性試驗與中心實驗室試驗的比較，確定了該試驗分析的有效性， 證實轉(zhuǎn)移性腫瘤患者的CTC 計數(shù)顯著高于良性疾病和健康對照組。 基于這些結(jié)果，證明了在轉(zhuǎn)移性前列腺癌中，每7.5 ml 全血中檢測到的CTC 數(shù)量可以根據(jù)環(huán)境的不同有很大的差異。 CellSearch檢測到的 CTC 可能是mCRPC 患者預(yù)后不良的獨立預(yù)測因子[29]。在一項前瞻性研究中，每管7.5 ml 的血液中檢測到的細胞范圍從0 到847 不等，CTC 的中位數(shù)為 16，且重復(fù)性高達（＞ 99%）， 這些細胞的分子分析額外證實了雄激素受體（androgen receptor，AR）擴增或其他前列腺癌特異性生物標志物的表達，證實了它們的惡性來源[30]。

由于在CRPC 中已經(jīng)證明了由配體介導(dǎo)的AR 信號的持續(xù)存在，因此，一種雄激素生物合成抑制劑被用來延長已經(jīng)接受化療的CRPC 患者的生命。 運用CTC 這種液體活檢方式在衡量AR 信號可能有助于指導(dǎo)轉(zhuǎn)移性前列腺癌的治療[31]。研究結(jié)果表明， 在CRPC 患者的CTC 中監(jiān)控AR 亞細胞定位可能預(yù)示著對紫杉烷化療的臨床反應(yīng)[32]。此外，在晚期前列腺癌患者的組織樣本以及CRPC 患者的CTC 富集的外周血液樣本中， 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了代表CRPC 發(fā)展的潛在機制的AR 基因的編碼突變[33]。

在一項關(guān)于CTC 預(yù)后影響的前瞻性研究中，研究發(fā)現(xiàn)≥5 個CTC 的患者與開始新的細胞毒性治療前＜5 個CTC 的患者相比，總體生存率更差，≥5 個 CTC 患者的中位總生存期為 11.5 個月， 而＜5個 CTC 患者為 21.7 個月 （HR 3.3，95%可信區(qū)間2.2～5.1，P 值＜0.0001）[34]。 因此，≥5 個 CTC 的基線被認為是預(yù)后差的預(yù)測標志。5 mCRPC 分子生物學(xué)標志物在CTC 臨床實驗的研究

隨著我們對mCRPC 的了解和治療選擇的增加，更需要易于檢測且能給我們提供有關(guān)腫瘤實時信息的生物標志物。 之前在一項評估增殖指數(shù)標記物（Ki-67）的初步研究中，從不同前列腺癌患者中分離出的CTC 在Ki-67 陽性中表現(xiàn)出很大的變異性（1～81%），提示 CTC 中 Ki-67 增殖指數(shù)的增加與 CRPC 有關(guān)[35]。 研究表明，CTC 中微管束的可視化和測量可用于監(jiān)測多西紫杉醇化療的藥物靶點的參與，這可能有助于預(yù)測個體患者治療的有效性[36]。

CTC 的分子表征可用作藥物作用的藥效量度或用于患者的各種臨床試驗設(shè)計的選擇，CTC 分析可以評估臨床試驗的早期療效以及目標參與，可以顯著節(jié)省藥物開發(fā)。 例如，在Ⅰ期試驗中，mCRPC可以通過促進預(yù)測的生物標志物有助于患者選擇，應(yīng)用替代生物標志物開發(fā)的新型藥物的早期結(jié)果來加速試驗的進展。同時，獲得CTC 分子譜可以為藥效方面的研究提供一個實時采樣平臺，實時監(jiān)測不同劑量水平下藥物對CTC 的影響， 確定藥代動力學(xué)或藥效學(xué)的相關(guān)性，避免原發(fā)或轉(zhuǎn)移前列腺癌活檢的重復(fù)性。 mCRPC 的CTC 計數(shù)現(xiàn)已在 Ⅲ 期隨機對照試驗中得到前瞻性驗證，但在CRPC 的新治療發(fā)展中運用CTC 還存在一些挑戰(zhàn)。首先，許多mCRPC 患者缺乏CTC。隨著CTC 新技術(shù)的發(fā)展，更靈敏的CTC 捕獲設(shè)備可能會解決這個問題。其次，從外周血中檢測和捕獲的CTC 數(shù)量有限， 可能存在不同的CTC 表型，離體培養(yǎng)CTC 用于藥物敏感性測試的能力可以克服該限制，但尚未在前列腺癌中得到證實[37，38]。 無論是對前列腺癌個體患者的臨床管理，還是對臨床試驗治療方法的評估，臨床上對高信息性生物標志物的需求仍未得到滿足。

小結(jié)與展望

對比傳統(tǒng)的影像學(xué)方法、 血清PSA 檢測和骨轉(zhuǎn)移活檢都有一定局限性，限制了它們在前列腺癌評估中的應(yīng)用。目前，CTC 是一種新型生物標志物，無論是在前列腺癌早期、晚期階段及預(yù)后判斷治療效果方面都是很有前景的領(lǐng)域。 CTC 可以來自原發(fā)腫瘤本身或轉(zhuǎn)移部位，而且可以通過實時液體活檢進行非侵入性測量，它們的分子表征為更好了解腫瘤轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性和對已建立的治療的耐藥性提供了獨特的潛力。 CTC 研究為細胞、DNA、RNA 或蛋白檢測分析方面都提供了卓越的平臺，為腫瘤異質(zhì)性的分析提供了個體化治療發(fā)展的可能。新的檢測技術(shù)仍需大樣本、多中心的研究證實，以達到建立標準化的檢測方法和廣泛使用，目前缺乏關(guān)于臨床實踐的前瞻性研究， 隨著CTC 檢測技術(shù)的改良進步， 通過 CTC 的液體活檢中獲得的實時分子信息的合理靶向治療的使用，驗證這些方法與臨床的相關(guān)性， 將使CTC 更廣泛應(yīng)用于前列腺癌研究并且為患者治療服務(wù)。