王 昆，張書儀，顏志文, 魏吟秋，李碧艷，陳 方，陳 慶

(1. 廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科，福建 廈門 361003； 2. 廈門大學(xué)藥學(xué)院，福建 廈門 361102)

0 引言

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是髓系造血干/祖細(xì)胞異常增生的血液系統(tǒng)惡性疾病，自然病程僅為數(shù)周到數(shù)月，嚴(yán)重危害人類健康[1]. 雖有50%～80% 的患者通過初始治療的標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)化療方案可以獲得完全緩解(complete remission，CR)，但即使在CR后并經(jīng)過鞏固、 強(qiáng)化和維持治療，仍然存在超過50%獲得緩解的患者出現(xiàn)耐藥、 復(fù)發(fā)、 預(yù)后不良，甚至最終演變?yōu)殡y治白血病，導(dǎo)致治療失敗而死亡[2].

多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)已經(jīng)成為臨床治愈AML的主要障礙之一[3]. 而現(xiàn)有評估耐藥的標(biāo)準(zhǔn)都是基于治療中腫瘤細(xì)胞遺傳學(xué)或形態(tài)學(xué)上的改變而做出的，耽誤了寶貴的治療時機(jī). MDR相關(guān)基因的異常表達(dá)是目前公認(rèn)的AML相關(guān)耐藥主要機(jī)制之一[4]. 研究顯示，AML化療耐藥、 難治、 復(fù)發(fā)與基因編碼P糖蛋白的多藥耐藥基因1 (multidrug resistance gene 1，MDR1)和多藥耐藥相關(guān)蛋白基因(multidrug resistance-associated protein gene，MRP)的異常表達(dá)有著密切關(guān)系[5]. 目前，MDR研究的主要檢測方法均存在一定局限性：免疫組化法操作復(fù)雜、 重復(fù)性差、 易受非腫瘤抗原干擾； 熒光原住雜交法(FISH)靈敏度低，涉及復(fù)雜的熒光顯色系統(tǒng)，易出現(xiàn)假陽性； 基因芯片靈敏度、 特異性不高，同樣涉及使用復(fù)雜光學(xué)系統(tǒng)； 實(shí)時定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)為單基因篩查，不利于綜合分析，且操作繁瑣、 價格昂貴，因而限制了臨床的大規(guī)模應(yīng)用. 因此，能夠開發(fā)研制一種快速、 簡便、 靈敏、 準(zhǔn)確、 經(jīng)濟(jì)的AML多藥耐藥基因檢測技術(shù)，對于AML耐藥發(fā)生的預(yù)測及判定具有重大意義.

作為一種全新的基因快速檢測技術(shù)，多通道電化學(xué)基因傳感陣列已在傳感技術(shù)研究領(lǐng)域備受關(guān)注[6-7]. 該項(xiàng)技術(shù)結(jié)合了高特異性的核酸分子雜交手段和高靈敏的電化學(xué)傳感檢測技術(shù)[8]，可實(shí)現(xiàn)高通量、 高靈敏度的微量檢測，且快捷便攜、 價格低廉，為臨床研究提供了一種全新的、 強(qiáng)有力的手段[9-10].

本研究篩選并制備高特異性DNA探針，與納米粒子標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，設(shè)計多通道電化學(xué)基因傳感陣列檢測方法，建立靈敏、 快速、 簡便、 經(jīng)濟(jì)的AML相關(guān)多藥耐藥基因檢測的新方法，為預(yù)測腫瘤治療效果和臨床制定治療方案提供參考依據(jù)，對于AML的治愈具有重大的意義.

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

CHI1030C電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)； 金電極(φ2 mm) 、 鉑絲電極、 Ag/AgCl參比電極(上海辰華儀器公司)； Talos透射電子顯微鏡(美國賽默飛世爾科技公司)； Spectronic 200紫外可見分光光度計(美國賽默飛世爾科技公司).

1.2 試劑及探針序列

三(羥甲基)胺基甲烷(Tris)、 乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、 巰基乙醇(MCH，AR)、 牛血清白蛋白(BSA)等購于美國Sigma公司； 3, 3′, 5, 5′-四甲基聯(lián)苯(TMB)由美國Neogen公司生產(chǎn)； 鏈霉親和素標(biāo)記辣根過氧化物酶(Streptavidin-HRP)由美國Roche公司生產(chǎn)； 實(shí)驗(yàn)所需其他試劑均為分析純，來自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

寡核苷酸探針序列均從寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)購得，詳見表1.

表1 基因序列Tab.1 Gene sequences

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

TE緩沖液(含10 mmol·L-1Tris，1.0 mmol·L-1EDTA，pH=8.0)作為捕獲探針組裝液，10 mmol·L-1PBS(pH=7.4)作為雜交反應(yīng)液，1 mmol·L-1MCH為電極封閉液(避光保存). 上述實(shí)驗(yàn)用水為去離子水，配制后于4 ℃ 保存. 1 g·L-1BSA封閉液和1∶1 000(體積比，下同)稀釋的Streptavidin-HRP用滅菌水配置而成，4 ℃保存. 根據(jù)文獻(xiàn)提供方法制備納米金顆粒(AuNPs)溶液[11]，制備得到的AuNPs置于燒瓶中，4 ℃保存. 向AuNPs水溶液中分別加入50 μL信號探針S1和輔助探針A1，靜置16 h后，將其置于10 mmol·L-1PBS(0.1 mol·L-1NaCl，pH=7.0)中，靜置40 h，然后在14 000 r·min-1下離心5 min 3次后，去除多余的DNA，即得到AuNPs-DNA復(fù)合物.

金電極預(yù)處理后，在其表面滴加捕獲探針組裝液3 μL，室溫靜置2 h，置于100 μL的1 mmol·L-1的MCH溶液1 h. 將組裝后的電極置于含有待測靶序列、 AuNPs-DNA和報告探針的雜交溶液中于59 ℃孵育60 min，PBS洗脫. 置于 100 μL 1 g ·L-1BSA溶液30 min室溫封閉后，PBS洗脫，氮?dú)獯蹈?，滴? μL 1∶1 000稀釋的Streptavidin-HRP，15 min后，依次用PBS(含0.05%(體積分?jǐn)?shù))吐溫)和PBS洗脫，待測. 工作電極為金電極，參比電極為Ag/AgCl電極，對電極為鉑電極，在三電極體系下，采用循環(huán)伏安法 (CV)、 電流時間曲線(i-t)進(jìn)行檢測.

2 結(jié)果與討論

2.1 電化學(xué)基因傳感陣列檢測模式設(shè)計

本研究針對 AML相關(guān)耐藥基因MDR1和MRP，分別設(shè)計了兩組檢測探針，每組探針各包含一條捕獲探針(capture probe，C)、 一條報告探針(report probe，R)、 一條信號探針(signal probe，S)和一條輔助探針(Assistant，A)，利用酶放大技術(shù)、 納米技術(shù)，構(gòu)建一種新型的多重信號放大的多通道電化學(xué)基因傳感陣列模式，用于MDR1和MRP的同時檢測，檢測機(jī)理見圖1.

圖1 AML相關(guān)多藥耐藥基因電化學(xué)基因傳感檢測模式機(jī)理圖Fig.1 Mechanism of electrochemical gene sensor mode for AML related multidrugs resistance genes

以單通道MDR1檢測體系為例，該體系包含有一條3′端修飾巰基的C 、 一條R和一條 5′端修飾有生物素、 3′端修飾巰基的S和一條3′端修飾巰基的A. C、 R分別與靶標(biāo)序列(target，T)部分基因序列存在互補(bǔ). S、 A序列相同，按一定比例自組裝到AuNPs表面(S-AuNPs)，因序列與R的部分序列互補(bǔ). 將C固定在陣列電極表面后，置于含有R、 S-AuNPs和待測T的雜交溶液中進(jìn)行雜交，在電極表面形成含有biotin的DNA復(fù)合物傳感模式. Streptavidin-HRP通過與biotin相結(jié)合，將HRP修飾到電極表面上，催化氧化含有H2O2的TMB進(jìn)而發(fā)生電化學(xué)信號的改變. 若溶液中不含T，則雜交反應(yīng)無法進(jìn)行，電極表面無法修飾HRP催化TMB，檢測到的電流信號很弱. 通過比較電流信號變化就可以說明雜交反應(yīng)是否進(jìn)行，溶液中是否含有靶標(biāo)序列.

2.2 AuNPs及AuNPs-DNA生物復(fù)合物的表征

從AuNPs透射電鏡圖(見圖2(a))可以看到，合成的呈球形顆粒的AuNPs具有較好的單分散性，其平均尺寸約為 20 nm. AuNPs-DNA紫外吸收光譜(見圖2(b))中，AuNPs在與DNA修飾后，除了在260 nm處出現(xiàn)了DNA的特征吸收峰，其原本在520 nm處的特征吸收峰紅移至522 nm，說明AuNPs與DNA已成功鍵合[12].

圖2 AuNPs及AuNPs-DNA生物復(fù)合物的表征圖Fig.2 Characterization graph of AuNPs and AuNPs-DNA

2.3 Streptavidin-HRP催化行為的電化學(xué)研究

以 MDR1 檢測體系為例，試驗(yàn)考察了雜交前后的電極界面電化學(xué)行為. 無靶標(biāo)序列的情況下，修飾C的電極(C/MCH/AuC)與雜交溶液中的R和S-AuNPs完成雜交后，置于含有H2O2的TMB中進(jìn)行CV掃描，可以發(fā)現(xiàn)其CV曲線出現(xiàn)兩對的氧化還原峰(見圖3(a)曲線1). 而當(dāng)其他條件不變，C/MCH/AuC置于含有T的雜交液中進(jìn)行反應(yīng)，所得曲線2的電流信號較曲線1明顯放大. 這是因?yàn)橥ㄟ^雜交和親和素-生物素結(jié)合，可將Streptavidin-HRP修飾到電極表面，催化氧化TMB轉(zhuǎn)變?yōu)殡p偶氮聯(lián)苯胺類物質(zhì)，產(chǎn)生信號顯著的催化還原峰. 若雜交溶液中不含T，則無法將Streptavidin-HRP固定到電極表面，所得電流信號很小. 從圖3(b)可看出，在與T完成雜交后，測得的電流強(qiáng)度為3.20 μA(曲線 2)，遠(yuǎn)大于無雜交反應(yīng)檢測到的電流信號(0.07 μA，曲線1)，說明試驗(yàn)所設(shè)計的傳感模式能夠檢測溶液中是否含有靶標(biāo)序列.

圖3 不同修飾電極在TMB中的電化學(xué)行為表征圖Fig.3 Characterization graph of electrochemical behavior in TMB substrate

2.4 [Fe(CN)6]3-/4-在不同修飾電極上的交流阻抗行為

圖4(a)曲線1為無DNA修飾的AuC上 [Fe(CN)6]3-/4-電子傳輸過程，其半圓直徑小，線性頻率范圍寬，說明電極表面電子傳輸速度快，電解質(zhì)溶液在電極表面的擴(kuò)散作用控制了整個電極過程. 修飾C后，電極表面修飾帶負(fù)電荷的DNA磷酸骨架，與同樣帶負(fù)電荷 [Fe(CN)6]3-/4-相排斥，電子傳遞受阻，電阻增大(曲線2). 雜交后，雖引入AuNPs增大表面積，但AuNPs表面已有大量的帶負(fù)電荷的信號探針，在AuC表面的[Fe(CN)6]3-/4-交換仍受排斥，電極表面電阻進(jìn)一步增加(曲線3). 當(dāng)?shù)鞍状蠓肿觭treptavidin-HRP修飾到電極表面，更進(jìn)一步阻礙電極表面的電子傳遞，電阻值繼續(xù)增大(曲線4). 結(jié)果表明，探針已修飾到電極表面且能很好地識別靶標(biāo)進(jìn)行雜交.

相同條件下，未含AuNPs的檢測模式組裝步驟阻抗變化趨勢(見圖4(b))與含有AuNPs的檢測模式結(jié)果相一致. 比較圖4(a)和(b)，完成探針組裝的電極表面(C/MCH/AuC)電阻值相差不大，修飾AuNPs后，含有AuNPs的檢測模式的電阻值比相應(yīng)的未含AuNPs檢測模式的電阻值小，說明加入AuNPs能夠加快電子傳遞速度，從而提高體系的靈敏度與特異性.

圖4 檢測模式組裝步驟交流阻抗圖Fig.4 Impedance spectra graphs (Nyquist plot) of detection modes

2.5 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

探針設(shè)計過程中，利用計算機(jī)Zucher折疊程序[13]針對MDR1和MRP序列的解鏈溫度進(jìn)行雜交模擬，使得探針與靶標(biāo)鏈各雜交互補(bǔ)序列(C-T/T-R/R-S)的解鏈溫度均落在75～80 ℃之間，并對MDR1和MRP的雜交溫度進(jìn)行考察. 在MDR1和MPR兩個雜交體系中，當(dāng)溫度達(dá)到 59 ℃時，探針與MDR1和MPR的雜交效率最佳. 試驗(yàn)還考察了雜交液中Na+濃度，發(fā)現(xiàn)當(dāng)Na+濃度為1 mol·L-1時，雜交效率最優(yōu). 此外，檢測過程的雜交順序優(yōu)化結(jié)果表明，電極表面的C置于含T、 R、 S-AuNPs的雜交液中同時進(jìn)行雜交的結(jié)果優(yōu)于不同序列先后雜交的結(jié)果，可能是因?yàn)樵谝欢舛认?，四條序列同時雜交既能避免空間位阻又能減少先后雜交操作的誤差影響.

2.6 電化學(xué)基因傳感陣列檢測模式特異性考察

在最佳的條件下，試驗(yàn)對比了含有AuNPs與未含AuNPs的檢測模式的選擇性能(見圖5). 兩種檢測模式與互補(bǔ) T 雜交后所檢測到的I均達(dá)最大值(T1，T2). 在MDR1和MRP兩個雜交體系中均可看出當(dāng)待測序列中含有一個錯配堿基(M1-1，M2-1)時，含有AuNPs的檢測模式所檢測出來的含有錯配堿基序列 的I與完全互補(bǔ)序列的I二者之間的差值 ΔI(ΔI=I互補(bǔ)-I錯配)明顯大于未含AuNPs的檢測模式檢測所得ΔI. 說明加入AuNPs除了提高檢測信號，還能更有效地區(qū)分錯配序列. 隨著錯配堿基對數(shù)量的增加，對雜交效率的影響越大，當(dāng)待測堿基序列中存在至少3個錯配堿基對時，檢測所得的I與空白對照組(1)的I基本一致.

圖5 不同序列MDR1和MRP雜交后電流信號直方圖Fig.5 Current signals (I) corresponding to the hybridization with different gene sequences of MDR1 and MRP

2.7 不同靶標(biāo)序列雜交線性及檢測限考察

采用i-t法對MDR1和MRP進(jìn)行定量考察，結(jié)果見圖6. 從圖6可以看出，電流隨著互補(bǔ)序列濃度的增加而增大. 因?yàn)锳uNPs的加入，含有AuNPs的傳感陣列具有較高的靈敏度，檢測范圍可達(dá) 10 f mol·L-1～10 nmol·L-1，比不含AuNPs的傳感陣列的檢測范圍(1 pmol·L-1～10 nmol·L-1)多出兩個數(shù)量級.

圖7(a)為MDR1標(biāo)準(zhǔn)曲線，MDR1檢測體系在1.0×10-14～ 1.0×10-12mol·L-1范圍內(nèi)，ΔI與靶標(biāo)序列濃度對數(shù)間表現(xiàn)出較好的線性關(guān)系，線性回歸方程為ΔI(nA)=83.094 7 lgcDNA(fmol·L-1)+ 7.708 7，r2=0.992 6，檢出限(S/N=3)為4.8 fmol·L-1. 圖7(b)為MRP標(biāo)準(zhǔn)曲線，MRP檢測體系在5.0×10-14～ 5.0×10-12mol·L-1范圍內(nèi)，ΔI與靶標(biāo)序列濃度對數(shù)線性關(guān)系良好, 線性回歸方程為ΔI(nA)=91.595 8 lgcDNA(fmol·L-1)+36.324 4，r2=0.981 5，檢出限(S/N= 3)為7.4 fmol·L-1. 結(jié)果表明檢測含AuNPs的傳感陣列可以實(shí)現(xiàn)對MDR1和MRP的定量檢測，且具有較高的靈敏度.

2.8 重現(xiàn)性考察

重現(xiàn)性考察中，MDR1和MRP的靶標(biāo)溶液均為1 nmol·L-1，平行測定5次后，分別觀察其電化學(xué)信號的變化. 結(jié)果表明，MDR1和MRP的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為8.9%和7.4%.

3 結(jié)語

本研究設(shè)計出高特異性、 高靈敏度的AML相關(guān)耐藥基因(MDR1和MRP)檢測探針，并成功制備出生物相容性較好、 粒徑均一性良好的AuNPs，構(gòu)建用于AML多藥耐藥基因檢測的多通道電化學(xué)基因傳感陣列的新方法，該方法具有較好的特異性、 靈敏度和重現(xiàn)性，能夠在一定濃度范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)對MDR1和MRP的定量檢測.