陶佳玲，樊慧敏,2，唐濤，邵啟祥，丁慶

(1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院檢驗科，江蘇 鎮(zhèn)江 212002)

T細(xì)胞免疫球蛋白及黏蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白-4(T-cell immunoglobulin and mucin domain containing protein-4，TIM-4)表達(dá)于巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞等細(xì)胞表面，在抗原免疫或感染過程中促進(jìn)抗原特異性T細(xì)胞擴增，但在免疫應(yīng)答后期通過清除抗原特異性T細(xì)胞調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答[1]。此外，TIM-4在炎癥期間促進(jìn)效應(yīng)T細(xì)胞增殖分化，介導(dǎo)自身免疫應(yīng)答和移植排斥反應(yīng)[2]?？筎IM-4單克隆抗體通過阻斷TIM-4分子，可誘導(dǎo)體內(nèi)初始CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，從而提高同種異體移植物存活時間[3]。TIM-4作為跨膜蛋白，因其胞質(zhì)內(nèi)部分缺失酪氨酸殘基，所以并不能直接傳導(dǎo)胞內(nèi)信號[4]。因此，抗TIM-4單克隆抗體與TIM-4結(jié)合后，不能直接激活或抑制其細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，所以抗TIM-4單克隆抗體可理解為阻斷性抗體。在已有的報道中，通常利用抗TIM-4單克隆抗體治療實驗性移植物排斥和自身免疫性疾病模型[5-6]。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類內(nèi)源性長度約22 nt的單鏈非編碼RNA，通常與靶基因mRNA的3′UTR互補結(jié)合，抑制翻譯或降解靶mRNA[7]。研究表明，在腫瘤和自身免疫性疾病患者中miR-21表達(dá)上調(diào)[8-9]。miR-21可靶向結(jié)合p35 mRNA，抑制其表達(dá)，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能[7]。我們前期研究證實，敲低miR-21可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性B細(xì)胞產(chǎn)生IL-10，有效抑制同種異體移植排斥反應(yīng)[10]。巨噬細(xì)胞根據(jù)活化狀態(tài)可分為M1和M2型：M1是經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞，具有殺傷微生物和抗腫瘤的作用；M2是旁路活化的巨噬細(xì)胞，與抗炎、組織重塑和修復(fù)有關(guān)[11]。miR-21是巨噬細(xì)胞中含量最豐富的一種miRNA[12]。研究表明，通過抑制miR-21表達(dá)可抑制M1型炎性巨噬細(xì)胞，促進(jìn)向調(diào)節(jié)性M2型巨噬細(xì)胞極化，減輕同種異體移植排斥反應(yīng)[13]。但是，TIM-4是否能夠通過調(diào)控miR-21誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化，減輕免疫排斥反應(yīng)尚不清楚。因此，本研究通過抗TIM-4單克隆抗體阻斷TIM-4后，檢測脾臟和腹腔中M1/M2極化情況以及miR-21、炎癥性和抑制性細(xì)胞因子的表達(dá)，探討TIM-4信號通路對同種異體免疫排斥的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6～8周齡C57BL/6雄性小鼠12只(No.201907363)；6～8周齡BALB/c雄性小鼠2只(No.201907408)，購于江蘇大學(xué)實驗動物中心。

1.2 主要試劑儀器

胎牛血清(美國Gibco公司)；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑盒均為日本TaKaRa公司產(chǎn)品；異丙醇、無水乙醇和三氯甲烷購自上海國藥集團；S1000TMThermal Cycler PCR儀和CFX-96定量PCR儀均為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；F4/80-FITC、CD11b-APC、CD38-PE和CD206-PE均為美國eBioscience公司產(chǎn)品；同型對照免疫球蛋白(兔抗鼠Fc抗體)和抗TIM-4單克隆抗體均為美國Bioxcell公司產(chǎn)品；ND-1000紫外分光光度計(美國Nanodrop公司)；Accuri C6流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。所有引物序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 同種異體小鼠免疫排斥模型構(gòu)建及分組

將BALB/c小鼠斷頸處死，分離脾臟，加入含2%胎牛血清的DMEM，用無菌眼科剪剪成1 mm3組織塊，然后過200目無菌鋼篩網(wǎng)。加入紅細(xì)胞裂解液裂解5 min；加入5 mL無菌PBS輕輕吹打混勻；4 ℃，1 000 r/min離心5 min；棄上清液，加入5 mL PBS重懸，計數(shù)備用。取3×107個脾細(xì)胞注射至C57BL/6小鼠腹腔中。

將注射脾細(xì)胞的C57BL/6小鼠分為抗TIM-4組(n=6)和同型對照組(n=6)，分別腹腔注射抗TIM-4單克隆抗體和同型對照免疫球蛋白抗體，300 μg/只；第5天，重復(fù)注射1次；第10天，處死兩組小鼠進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實驗。

1.4 小鼠腹腔細(xì)胞和脾細(xì)胞的制備

將C57BL/6小鼠置于75%乙醇中浸泡1 min；將其固定于解剖板，取5 mL無菌PBS注射于腹腔，輕揉腹部5 min；打開腹腔并剪一個小口，用一次性塑料滴管吸取腹腔液于離心管中；用PBS重復(fù)灌洗腹腔5次，獲得腹腔細(xì)胞懸液，置4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

取C57BL/6小鼠脾臟，按“1.3”制備脾細(xì)胞懸液，計數(shù)。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測腹腔和脾中M1和M2型巨噬細(xì)胞

取“1.4”獲得的腹腔細(xì)胞和脾細(xì)胞，每管加入1×106個單細(xì)胞懸液，每種細(xì)胞分2管，分別用于M1和M2型巨噬細(xì)胞檢測。檢測M1型巨噬細(xì)胞為F4/80、CD11b和CD38組合；檢測M2型巨噬細(xì)胞為F4/80、CD11b和CD206組合。細(xì)胞于4 ℃行1 000 r/min離心5 min；用60 μL PBS重懸細(xì)胞，分別加入3種熒光抗體(F4/80、CD11b、CD38或CD206)，每種抗體各0.25 μL，4 ℃避光染色30 min；加入1 mL PBS輕輕吹打混勻，1 000 r/min離心5 min；洗去未結(jié)合的游離抗體；最后再加入400 μL PBS重懸，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測并用FlowJo 10.0軟件分析。

1.6 qRT-PCR檢測脾和腹腔細(xì)胞中miR-21、促炎和抑炎相關(guān)因子等mRNA表達(dá)水平

取“1.4”腹腔和脾細(xì)胞提取總RNA，檢測純度，行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序：42 ℃ 2 min除去基因組DNA，然后 37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s合成cDNA。以cDNA為模板，對上述基因表達(dá)水平行PCR反應(yīng)。miR-21和U6采用專用引物行逆轉(zhuǎn)錄，以U6作為檢測miR-21內(nèi)參基因；IL-10、p35、p40和EB病毒誘導(dǎo)基因3(Epstein-Barr virus-induced gene-3，EBi-3)采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中的Oligo dT 引物行逆轉(zhuǎn)錄，以β-肌動蛋白作為其內(nèi)參基因。qRT-PCR反應(yīng)體系為10 μL，包括2×SYBR Premix ExTaq5.0 μL，正向和反向引物各0.2 μL，cDNA 1 μL，無RNA酶雙蒸水3.6 μL。qRT-PCR主要實驗步驟：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，退火30 s；40個循環(huán)。采用2-ΔCt方法計算結(jié)果。引物序列如表1所示。

表1 引物序列

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 抗TIM-4單克隆抗體處理同種異體免疫小鼠對其脾臟和腹腔M1和M2型巨噬細(xì)胞組成的影響

流式結(jié)果顯示，與同型對照組相比，抗TIM-4處理組小鼠脾臟中M1、M2和M1/M2百分比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；腹腔M1型巨噬細(xì)胞百分比無明顯變化(t=0.667，P>0.05)，但M2型巨噬細(xì)胞所占比例顯著升高(t=3.317，P<0.05)，腹腔細(xì)胞中M1/M2顯著降低(t=5.331，P<0.01)。由此說明，抗TIM-4單克隆抗體阻斷TIM-4分子后，在腹腔中誘導(dǎo)產(chǎn)生有利于免疫耐受的M2型巨噬細(xì)胞。見圖1。

2.2 抗TIM-4單克隆抗體降低腹腔中miR-21表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果表明，與同型對照組相比，抗TIM-4組小鼠脾細(xì)胞中miR-21表達(dá)呈下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.131，P>0.05)，而腹腔細(xì)胞中miR-21表達(dá)水平顯著降低(t=3.251，P<0.05)。見圖2。

圖2 qRT-PCR檢測脾臟和腹腔細(xì)胞中miR-21表達(dá)水平

2.3 抗TIM-4單克隆抗體上調(diào)脾細(xì)胞中IL-10和p35的mRNA表達(dá)，下調(diào)EBi-3 mRNA表達(dá)

qRT-PCR結(jié)果顯示，與同型對照組相比，抗TIM-4組脾細(xì)胞促炎因子p40 mRNA表達(dá)水平無明顯變化(t=0.311，P>0.05)，但抑炎因子IL-10 和p35 mRNA表達(dá)水平顯著升高(t=3.049，5.027，P<0.05或0.01)，而抑炎因子EBi-3 mRNA表達(dá)水平明顯降低(t=2.507，P<0.05)。由此可見，抗TIM-4單克隆抗體促進(jìn)具有免疫抑制作用的IL-10和p35 的mRNA表達(dá)。見圖3。

2.4 抗TIM-4單克隆抗體促進(jìn)腹腔細(xì)胞中IL-10，p40和EBi-3的mRNA表達(dá)

如圖4結(jié)果顯示，與同型對照組相比，抗TIM-4組腹腔細(xì)胞中促炎因子p40，抑炎因子IL-10和EBi-3等mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，但抑炎因子p35 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。由此說明，抗TIM-4促進(jìn)腹腔細(xì)胞抑炎因子IL-10，EBi-3和促炎因子p40等mRNA表達(dá)。

a：P<0.05；b：P<0.01圖3 qRT-PCR檢測脾細(xì)胞中促炎和抑炎因子mRNA表達(dá)

a：P<0.05；b：P<0.01圖4 qRT-PCR檢測腹腔細(xì)胞中促炎和抑炎因子mRNA表達(dá)

3 討論

巨噬細(xì)胞是介導(dǎo)移植物排斥的主要細(xì)胞[13]。在同種異體移植物中，巨噬細(xì)胞是造成組織浸潤，急性和慢性排斥的一類主要免疫細(xì)胞，其受到不同組織微環(huán)境和炎癥因子的刺激，具有不同的功能表型[13-14]。M2型巨噬細(xì)胞在局部先天性和獲得性免疫中均發(fā)揮重要作用[15]。研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞通過向M2極化，誘導(dǎo)免疫耐受，提高移植物存活率[13]。已有報道，腹腔中巨噬細(xì)胞高表達(dá)TIM-4，通過阻斷TIM-4分子可促進(jìn)移植物存活[14]。本研究結(jié)果顯示，在同種異體免疫排斥模型中，通過TIM-4單克隆抗體處理，小鼠腹腔中M1型巨噬細(xì)胞百分比無明顯變化，而M2百分比顯著升高；脾臟中，M1和M2比例無顯著變化。這可能與巨噬細(xì)胞的可塑性和異質(zhì)性的特點有關(guān)。此外，可能由于免疫部位不同造成小鼠不同組織中巨噬細(xì)胞比例變化不一致。本實驗采取的是經(jīng)典腹腔注射，腹腔中存在大量的巨噬細(xì)胞，注射的供體細(xì)胞首先與腹腔中巨噬細(xì)胞等相互作用，這也可能是腹腔中M1/M2平衡變化明顯，而脾臟中變化不明顯的原因。

研究發(fā)現(xiàn)，miR-21作為調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵微小RNA，可調(diào)控多個靶基因[8]。本研究結(jié)果顯示，抗TIM-4單克隆抗體降低腹腔細(xì)胞中miR-21表達(dá)。由此說明，阻斷TIM-4分子下調(diào)miR-21表達(dá)水平，可抑制炎癥反應(yīng)，從而減輕免疫排斥反應(yīng)。p35和IL-10作為miR-21靶基因，負(fù)向調(diào)控炎癥反應(yīng)[16]。IL-12是由p40和p35組成的炎癥性細(xì)胞因子，在炎癥中起重要作用[17]。IL-35是由p35和EBi-3作為獨立的亞基分泌形成，炎癥條件下結(jié)合形成具有免疫抑制活性的異二聚體分子，通過誘導(dǎo)免疫耐受減輕小鼠的心臟移植排斥反應(yīng)[18]。游離p35和EBi-3均可發(fā)揮免疫抑制作用，有效抑制同種異體移植排斥反應(yīng)，誘導(dǎo)同種異體移植物的免疫耐受[18-19]。本實驗結(jié)果顯示，抗TIM-4單克隆抗體可促進(jìn)脾臟中抑炎因子IL-10和p35 mRNA表達(dá)，而抑制抑炎因子EBi-3 mRNA表達(dá)。由此說明，阻斷TIM-4分子造成脾臟細(xì)胞中抑炎因子表達(dá)水平升高。此外，本實驗結(jié)果顯示，抗TIM-4組腹腔細(xì)胞中抑炎因子IL-10和EBi-3 mRNA表達(dá)水平明顯升高。以上實驗結(jié)果顯示，腹腔和脾臟中抑炎因子EBi-3表達(dá)水平不一致。這可能是由于小鼠脾臟和腹腔免疫細(xì)胞組成不同，脾臟主要有T、B細(xì)胞組成，巨噬細(xì)胞約占2%，而腹腔存在大量巨噬細(xì)胞，這種不同的細(xì)胞組成可能引起不同的免疫反應(yīng)[20]。然而，腹腔細(xì)胞中促炎因子p40 mRNA表達(dá)水平升高，這與抑炎因子IL-10和EBi-3 mRNA表達(dá)水平升高相矛盾。有文獻(xiàn)報道p40通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化，可發(fā)揮免疫抑制作用，減緩炎癥反應(yīng)[21]。由此可見，在免疫排斥反應(yīng)中，促炎和抑炎因子呈動態(tài)變化。研究表明，miR-21抑制M2型巨噬細(xì)胞極化，下調(diào)miR-21表達(dá)促進(jìn)M2極化，有利于誘導(dǎo)移植物存活[13,22]。由此說明，miR-21是參與巨噬細(xì)胞極化的關(guān)鍵分子。本實驗結(jié)果顯示，腹腔細(xì)胞中miR-21表達(dá)水平降低，M2型巨噬細(xì)胞百分比升高。由此說明，抑制腹腔細(xì)胞中miR-21表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2極化，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫耐受。

綜上所述，阻斷TIM-4分子可促進(jìn)抑炎功能的M2型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生和IL-10、EBi-3和p35等抑炎因子分泌，并且降低miR-21表達(dá)水平，減輕同種異體免疫排斥反應(yīng)。然而促炎因子p40和抑炎因子IL-10、EBi-3和p35等變化的機制有待進(jìn)一步研究。