陳天琰，張磊，高建一，余佳紅，唐彬，胡嘉波

(江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)在神經(jīng)炎癥疾病如缺血性卒中[1]、阿爾茨海默病[2]和脊髓修復(fù)[3-4]中發(fā)揮積極作用。異常的慢性炎癥是促進(jìn)神經(jīng)炎癥疾病的關(guān)鍵因素[5]，抑制關(guān)鍵的炎癥介質(zhì)可改善病理狀況[6]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細(xì)胞，如肥大細(xì)胞[7]和巨噬細(xì)胞[8]等為阿爾茨海默病和多發(fā)性硬化癥[9]的治療提供靶標(biāo)。巨噬細(xì)胞具有異質(zhì)性，M1/M2巨噬細(xì)胞的平衡極化影響組織器官在炎癥或損傷中的進(jìn)展[10]。抑制巨噬細(xì)胞促炎群體及炎癥介質(zhì)與改善臨床癥狀密切相關(guān)[11-12]。已證實NSCs可通過巨噬細(xì)胞在抗炎方面發(fā)揮巨大免疫調(diào)控作用[13]。研究表明，干細(xì)胞可以通過旁分泌機(jī)制發(fā)揮治療效應(yīng)[14-15]。但是，神經(jīng)干細(xì)胞微囊泡(neural stem cell microvesicles，NSC-MVs)是否可以調(diào)控巨噬細(xì)胞極化發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用尚不清楚。因此，本研究旨在探究人胚胎干細(xì)胞源NSC-MVs在體外對巨噬細(xì)胞極化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚胎干細(xì)胞源NSCs由本課題組先前誘導(dǎo)分化所得[15]；人白血病單核細(xì)胞株THP-1購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。

DMEM/F12、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清和B27均購于美國Gibco公司；表皮生長因子(EGF)和重組人堿性成纖維生長因子(bFGF)均為美國PeproTech公司產(chǎn)品；非必需氨基酸、即用型4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)、Trizol 試劑、小鼠IgG2b K 同型對照Alexa FluorTM488、抗CD86 FITC(美國Thermofisher公司)；基質(zhì)膠(美國Corning公司)；佛波酯(瑞典ENZO Biochem公司)；脂多糖(LPS，上海昂一生物科技有限公司)；Dil(美國Sigma-Aldrich公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑和SYBR Green定量試劑(南京Vazyme公司)；BCA試劑盒，RIPA蛋白裂解液均購自上海碧云天生物技術(shù)公司；多克隆兔抗誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)，多克隆兔抗精氨酸酶1(Arginase-1，Arg-1)，單克隆小鼠抗β-肌動蛋白購于美國Santa Cruz公司；羊抗兔HRP標(biāo)記二抗、羊抗鼠HRP標(biāo)記二抗購于杭州聯(lián)科生物有限公司；實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；CytoFLEX 流式細(xì)胞儀(美國Beckman Coulter公司)；多維全景流式細(xì)胞儀(Flow Sight，美國Merck Millipore公司)；Olympus FV1000激光掃描共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

NSCs從人胚胎干細(xì)胞中誘導(dǎo)分化獲得，并在補(bǔ)充有1×B27，20 ng/mL EGF，20 ng/mL bFGF，1%非必需氨基酸和1% 青霉素/鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

THP-1細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板(1.2×106個/孔)，用100 ng/mL佛波酯誘導(dǎo)24 h，在倒置顯微鏡下對誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞觀察拍照，誘導(dǎo)的細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.3 NSC-MVs提取和濃度測定

參考文獻(xiàn)[14],收集NSCs條件培養(yǎng)液，于4 ℃2 000×g離心5 min，取上清液；4 ℃行12 000×g離心15 min去除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)；將收集的上清液以100 000×g超速離心2 h；PBS洗滌沉淀，并在相同條件下進(jìn)行第二次超速離心；棄上清液加入200 μL PBS重懸沉淀，分裝于-80℃儲存。在20 μL微囊泡中加入等體積的RIPA裂解液，冰上裂解1 h，每隔15 min劇烈振蕩；通過BCA檢測試劑盒，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并分析NSC-MVs蛋白含量。

1.4 THP-1內(nèi)化NSC-MVs

按試劑說明書將NSC-MVs于37 ℃避光環(huán)境中用Dil標(biāo)記30 min；加入1%牛血清白蛋白溶液終止反應(yīng)，隨后PBS洗滌；于4 ℃以100 000×g離心2 h；然后，將標(biāo)記的微囊泡與THP-1細(xì)胞孵育12 h；PBS洗滌2遍；流式細(xì)胞儀檢測THP-1細(xì)胞內(nèi)熒光表達(dá)情況。溫育24 h后，用DAPI進(jìn)行核染色，細(xì)胞圖像通過Olympus FV1000激光掃描共聚焦顯微鏡獲得。

1.5 THP-1巨噬細(xì)胞分組及相關(guān)指標(biāo)檢測

1.5.1 實驗分組 將THP-1巨噬細(xì)胞種于6孔板,并按照如下進(jìn)行分組：對照組，無血清RPMI 1640培養(yǎng)液孵育；LPS組，100 ng/mL LPS處理6 h，隨后PBS洗滌，更換為等量無血清RPMI 1640培養(yǎng)液孵育12 h或24 h；LPS+MVs組，100 ng/mL LPS處理6 h，隨后PBS洗滌，加入含各濃度NSC-MVs(0.024,0.12,0.6,3,15 μg/mL)的無血清RPMI 1640培養(yǎng)液孵育12 h或24 h。

1.5.2 實時熒光定量PCR檢測THP-1巨噬細(xì)胞炎性因子mRNA表達(dá) 用各濃度NSC-MVs(0.024，0.12，0.6，3，15μg/mL)或0.12 μg/mL NSC-MVs按照“1.5.1”分組孵育12 h，用Trizol法提取3組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取2 μL cDNA 以20 μL體系進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共40個擴(kuò)增循環(huán)。用StepOneTMSoftware v2.3軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以β-肌動蛋白為內(nèi)參基因，通過2-ΔCt法計算目的基因mRNA相對表達(dá)量。相關(guān)引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR相關(guān)引物序列

1.5.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測THP-1巨噬細(xì)胞iNOS和Arg-1蛋白表達(dá) 用0.12 μg/mL微囊泡，按照“1.5.1”分組孵育24 h；棄上清液，用預(yù)冷PBS洗2遍；每孔加入含1%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液100 μL，細(xì)胞刮刀刮取研磨充分；冰上裂解1 h，期間每隔15 min劇烈振蕩1次；4℃，12 000×g離心10 min；收集上清液并檢測蛋白含量；上清液與上樣緩沖液以4 ∶1比例混合，100 ℃熱水浴10 min；-20 ℃保存。參考文獻(xiàn)[15]行SDS-PAGE，iNOS、多克隆兔抗Arg-1和單克隆小鼠抗β-肌動蛋白均1 ∶500，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG為1 ∶3 000，ECL顯色系統(tǒng)曝光，Lane 1D軟件對條帶進(jìn)行掃描并分析其灰度值。

1.5.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測THP-1巨噬細(xì)胞CD86表達(dá) 用0.12 μg/mL微囊泡，按照“1.5.1”分組孵育24 h；棄上清液，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞，0.25%胰酶消化；4 ℃、1 000×g離心5 min，棄上清液，沉淀加入200 μL PBS混勻；加入50 μL含2×105個細(xì)胞懸液；按照分組分別加入小鼠IgG2b K 同型對照Alexa FluorTM488、抗CD86 FITC，避光冰上孵育30 min；隨后加入1 mL PBS，4 ℃-350×g離心5 min；棄上清液，渦旋振蕩，加入PBS重懸細(xì)胞沉淀，流式細(xì)胞儀檢測。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 巨噬細(xì)胞形態(tài)及內(nèi)化NSC-MVs觀察

如圖1所示，THP-1經(jīng)佛波酯誘導(dǎo)后呈圓形、長梭形改變，或伸出偽足，胞質(zhì)透亮，界限清楚，貼壁能力強(qiáng)。流式圖像顯示，多數(shù)THP-1巨噬細(xì)胞在與Dil標(biāo)記NSC-MVs共孵育12 h時能有效內(nèi)化NSC-MVs。激光共聚焦熒光顯微鏡圖像同樣顯示，共孵育24 h，Dil標(biāo)記的人胚胎干細(xì)胞源NSCs衍生的MVs可以被巨噬細(xì)胞內(nèi)化至THP-1細(xì)胞質(zhì)中。

A：THP-1巨噬細(xì)胞形態(tài)(×100)；B：流式細(xì)胞儀檢測THP-1細(xì)胞吞噬Dil標(biāo)記NSC-MVs；流式通道1(CH01)：白光下THP-1細(xì)胞；流式通道5(CH05)，Dil標(biāo)記NSC-MVs；CH01/CH05：吞噬NSC-MVs的THP-1細(xì)胞；C：內(nèi)化NSC-MVs的THP-1巨噬細(xì)胞激光共聚焦顯微鏡圖像(×400)圖1 巨噬細(xì)胞形態(tài)及內(nèi)化NSC-MVs觀察

2.2 NSC-MVs抑制巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)

如圖2所示，與對照組相比，LPS組IL-6mRNA表達(dá)水平明顯增加(P<0.01)，經(jīng)0.12 μg/mL和0.6 μg/mL NSC-MVs處理后表達(dá)水平顯著下降(P<0.01或P<0.05)；而0.024 μg/mL，3 μg/mL和15 μg/mL NSC-MVs組與LPS組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。因此，選擇0.12 μg/mL NSC-MVs進(jìn)行后續(xù)實驗。

如圖3所示，與對照組相比，LPS組THP-1巨噬細(xì)胞炎性因子IL-1β，TNF-α，IL-6等mRNA表達(dá)水平明顯增加(P均<0.01)，經(jīng)0.12 μg/mL NSC-MVs處理后則顯著下降(P均<0.05)。

1：對照組；2：LPS組；3：LPS+0.024 μg/mL MVs組；4：LPS+0.12 μg/mL MVs組；5：LPS+0.6 μg/mL MVs組；6：LPS+3 μg/mL MVs組；7：LPS+15 mg/mL MVs組；a:P<0.01，b:P<0.05圖2 qRT-PCR檢測不同濃度NSC-MVs處理后各組巨噬細(xì)胞IL-6 mRNA表達(dá)

圖3 qRT-PCR檢測各組巨噬細(xì)胞IL-1β，TNF-α和IL-6 等mRNA表達(dá)

2.3 NSC-MVs抑制巨噬細(xì)胞M1極化蛋白表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，LPS組THP-1巨噬細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)水平明顯增加(P<0.01)，Arg-1差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與LPS組相比，LPS+MVs組iNOS表達(dá)顯著降低(P<0.05)，Arg-1蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)，如圖4所示。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，LPS組CD86表達(dá)增加，而LPS+MVs組CD86表達(dá)較LPS組略低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。如圖5所示。

圖4 蛋白質(zhì)印跡法檢測各組巨噬細(xì)胞iNOS和Arg-1蛋白表達(dá)

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測NSC-MVs處理巨噬細(xì)胞CD86表達(dá)

3 討論

研究表明，持續(xù)活化的單核巨噬細(xì)胞與神經(jīng)炎癥性疾病的進(jìn)展密切相關(guān)，已證實靶向抑制免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，降低巨噬細(xì)胞M1活化，具有神經(jīng)保護(hù)作用[16]。單核—巨噬細(xì)胞譜系的細(xì)胞療法被認(rèn)為是有力的神經(jīng)炎癥疾病的免疫調(diào)節(jié)靶標(biāo)[17]。同時研究表明，NSCs可以調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥微環(huán)境從而改善腦功能[18]，在治療卒中、帕金森病、阿爾茨海默病、脊髓損傷等神經(jīng)炎癥疾病中具有重要意義[19-22]。NSCs移植通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化下調(diào)M1群體從而改善神經(jīng)功能恢復(fù)[13，22]。干細(xì)胞的衍生產(chǎn)物，例如條件培養(yǎng)基和微囊泡，具有潛在的治療作用[23-24]。本組前期結(jié)果顯示人胚胎干細(xì)胞源NSCs-MVs具有生物學(xué)活性，在坐骨神經(jīng)損傷修復(fù)[14]和抑制心肌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮積極作用[15]。本研究表明，人胚胎干細(xì)胞源NSCs-MVs具有免疫調(diào)控作用，能夠在體外抑制巨噬細(xì)胞M1極化。

本研究流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，Dil標(biāo)記的NSCs-MVs在孵育后12 h即進(jìn)入THP-1細(xì)胞內(nèi)，共聚焦熒光顯微鏡更加直觀反映孵育后24 h THP-1內(nèi)化微囊泡情況。巨噬細(xì)胞受微環(huán)境影響根據(jù)表型和功能分為經(jīng)典活化促炎M1表型和替代活化抑炎M2表型，受LPS刺激后向M1型極化，促炎細(xì)胞因子如IL-1，IL-6，TNF-α以及iNOS表達(dá)增強(qiáng)等。促炎細(xì)胞因子參與神經(jīng)疾病中炎癥過程，iNOS大量增加，催化精氨酸分解生成NO，NO與O2-生成過氧化亞硝酸鹽，通過強(qiáng)烈過氧化作用導(dǎo)致細(xì)胞死亡和廣泛的組織損傷[25]。此外，本研究根據(jù)文獻(xiàn)[26]用100 ng/mL LPS處理THP-1細(xì)胞，LPS處理組巨噬細(xì)胞炎性因子IL-1β，TNF-α，IL-6等mRNA表達(dá)水平明顯增高，iNOS蛋白表達(dá)增加；同時發(fā)現(xiàn)0.12 μg/mL NSC-MVs能夠有效降低LPS處理后巨噬細(xì)胞IL-6，IL-1β，TNF-α等mRNA表達(dá)，誘導(dǎo)iNOS蛋白和Arg-1蛋白表達(dá)升高。由此表明，NSC-MVs能夠抑制THP-1巨噬細(xì)胞M1極化相關(guān)炎癥因子和主要標(biāo)志蛋白的表達(dá)。此外，LPS處理有增加CD86表達(dá)的趨勢，經(jīng)NSC-MVs處理后CD86表達(dá)水平降低，但是無統(tǒng)計學(xué)意義，考慮為100 ng/mL LPS對于THP-1巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志的誘導(dǎo)作用不明顯。

本研究表明，人胚胎干細(xì)胞源NSCs-MVs能夠減少THP-1細(xì)胞炎性細(xì)胞因子和iNOS表達(dá)，抑制巨噬細(xì)胞M1表型發(fā)揮其抗炎作用。