任琎，曹一鑫，王德強，莊秀芬，李小琴

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是最主要的肺癌類型，復(fù)發(fā)率高，預(yù)后差[1-2]。抑癌基因的缺失與肺癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3-4]。張力蛋白(tensin,TNS)家族是一種多結(jié)構(gòu)域蛋白，可與細胞膜交互作用，是聯(lián)系細胞外基質(zhì)、肌動蛋白骨架的重要成分，亦可結(jié)合酪氨酸激酶受體，影響細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在細胞黏附、運動、生長等細胞生物學(xué)活動中發(fā)揮著重要的作用[5]。TNS1是一種定位于胞質(zhì)灶性黏附區(qū)域的磷酸蛋白[6]。已有研究報道，TNS1與乳腺癌、胃癌轉(zhuǎn)移有關(guān)，并顯著影響乳腺癌、胃癌患者的預(yù)后[7-8]。然而，TNS1在NSCLC發(fā)病過程中是否發(fā)揮作用目前并不清楚。本研究通過比較TNS1在NSCLC組織和細胞中的表達，分析其與NSCLC患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系；探討外源性上調(diào)TNS1表達對NSCLC細胞生物學(xué)功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例 收集2010年1月至2015年12月于江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科行部分肺葉切除的56例NSCLC患者肺癌組織及癌旁組織(距離腫瘤邊緣>5 cm)。其中，男35例，女21例。年齡18～78歲，所有患者術(shù)前均未行放療、化療，所有標(biāo)本均經(jīng)過病理證實。其中，鱗癌23例，腺癌33例。本研究通過江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.1.2 試劑及儀器 人正常支氣管上皮16HBE、人肺腺癌A549和H1299細胞均購自中國科學(xué)院上海細胞生物研究所；RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM、小牛血清(美國Hyclone公司)；MTT(美國Sigma公司)；過表達TNS1的質(zhì)粒(pcDNA3.1/TNS1)及相應(yīng)的空載質(zhì)粒(pcDNA3.1)購自上海英駿生物技術(shù)有限公司；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen公司)；熒光實時定量PCR(qRT-PCR)試劑盒(日本TaKaRa公司)；羊抗人TNS1單抗(美國Abcam公司)；兔抗人E-鈣黏蛋白、波形蛋白單抗(美國BD Biosciences公司)；羊抗兔HRP耦聯(lián)二抗(美國Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 A549和H1299肺癌細胞培養(yǎng)、分組與轉(zhuǎn)染 在37 ℃、5% CO2條件下，將A549和H1299細胞置于含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)；16HBE細胞置于含10%小牛血清的DMEM中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期A549和H1299細胞，并于轉(zhuǎn)染前24 h 接種至6孔板(3×105個/孔)，待細胞生長融合度達70%～80%時進行轉(zhuǎn)染。依照轉(zhuǎn)染說明書，將4 μg過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入A549和H1299細胞中(分別命名為A549/pcDNA3.1/TNS1和H1299/pcDNA3.1/TNS1)，另轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pcDNA3.1作為陰性對照組(分別命名為A549/pcDNA3.1和H1299/pcDNA3.1)，用于后續(xù)相關(guān)實驗檢測。

1.2.2 qRT-PCR檢測TNS1mRNA表達 通過Tri-zol提取組織和細胞總RNA，行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，然后對產(chǎn)物進行擴增。GAPDH引物序列上游：5′-GCAAATTCCATGGCACGTC-3′，下游：5′-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3′；TNS1引物序列上游：5′-GTGCAAAGGGGACTGAATTCG-3′，下游：5′-GGCTACAAGACTCTCCAAGTGG-3′[9]。PCR 反應(yīng)條件：90 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算TNS1mRNA相對表達量。根據(jù)NSCLC組織中TNS1mRNA相對表達量的中位數(shù)，將NSCLC 患者分為TNS1低表達組(≤中位數(shù))和高表達組(>中位數(shù))。

1.2.3 MTT比色法實驗檢測細胞抑制率 取“1.2.1”轉(zhuǎn)染后各組細胞，接種于96孔板，每孔2×103個，每組6個復(fù)孔，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h；每孔加MTT 10 μL，37 ℃孵育4 h；棄上清液，加DMSO 150 μL/孔，振蕩溶解10 min；待紫色結(jié)晶完全溶解后，于酶標(biāo)儀490 nm處檢測各孔光密度(D)值，計算細胞抑制率。細胞抑制率(%)=(1-實驗組D值/對照組D值)×100%。

1.2.4 細胞集落形成實驗檢測細胞增殖能力 取“1.2.1”細胞，按1×103個/孔接種于6孔板中，置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育10～14 d；純甲醇固定10 min；加入0.1%結(jié)晶紫染液，室溫染色10～15 min；孔板洗凈并干燥后，肉眼計數(shù)克隆數(shù)。

1.2.5 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力 取“1.2.1”轉(zhuǎn)染后細胞，接種于6孔板，每孔5×105個細胞，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)過夜；待細胞融合度為80%～90%時，棄培養(yǎng)基并用滅菌的200 μL加樣槍頭在單層細胞上中間縱向垂直劃痕；用PBS輕柔清洗細胞3次，去除劃下的細胞；每孔加入含10 %胎牛血清的1640培養(yǎng)液2 mL；分別于0、24和48 h在高倍鏡下(100×)隨機取6個視野劃痕處拍照。遷移率=(遷移前兩線間的長度-遷移后兩線間的長度)/遷移前兩線間的長度×100%。

1.2.6 Transwell實驗檢測細胞的侵襲能力 取“1.2.1”轉(zhuǎn)染后細胞，以無血清1640培養(yǎng)液重懸，Transwell培養(yǎng)板上室內(nèi)加入300 μL細胞懸液(5×104個)，下室加入1 mL含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液；培養(yǎng)48 h后取出小室，用濕棉簽擦去內(nèi)部基底膜上表面的細胞，預(yù)冷甲醇固定30 min，蘇木精染色1 min，在高倍鏡下(400×)隨機取6個視野計數(shù)，取平均數(shù)。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測細胞TNS1、E-鈣黏蛋白和波形蛋白表達 用全蛋白裂解液提取待測細胞總蛋白，冰浴30 min，離心后取上清液，BCA法行蛋白定量；分別取50 μg樣品行SDS-PAGE，60 mA電泳4 h；電壓80 V將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入相應(yīng)一抗TNS1 (1 ∶100)、E-鈣黏蛋白(1 ∶250)、波形蛋白(1 ∶200)、GAPDH(1 ∶1 000，內(nèi)參)，4 ℃孵育過夜；TBST漂洗4次，每次10 min；加入相應(yīng)二抗(1 ∶3 000)室溫孵育2 h；ECL敏感發(fā)光試劑(美國Invitrogen公司)，曝光顯影。采用Image J軟件處理結(jié)果圖像。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 TNS1 mRNA在NSCLC癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關(guān)系

如圖1所示，與癌旁組織相比，NSCLC癌組織中TNS1mRNA表達明顯下降(t=-2.195，P<0.05)。由表1可見，TNS1mRNA表達量與NSCLC 患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及術(shù)后遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)(χ2=4.45和7.42，P均<0.05)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及術(shù)后出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移的患者TNS1mRNA呈低表達，而性別、年齡、吸煙史、腫瘤直徑、病理分型、術(shù)后TNM分期與TNS1mRNA表達水平未見明顯相關(guān)(P均>0.05)。

表1 TNS1 mRNA表達與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系

圖1 qRT-PCR檢測NSCLC癌旁組織和癌組織中TNS1 mRNA表達

2.2 NSCLC癌組織中TNS1表達與患者預(yù)后的關(guān)系

在TCGA數(shù)據(jù)中，TNS1mRNA高表達肺腺癌患者的總體生存率顯著優(yōu)于TNS1mRNA低表達肺腺癌患者(P=0.019)，見圖2。

圖2 TCGA數(shù)據(jù)庫中TNS1 mRNA高表達與低表達肺腺癌患者的總體生存曲線

進一步對我院56例肺腺癌術(shù)后患者進行隨訪，隨訪時間為3.5～47.3個月，中位隨訪時間為21.3個月。TNS1mRNA高表達患者3年累積無病生存率和累積總體生存率明顯優(yōu)于TNS1mRNA低表達患者(χ2=5.770和3.950，P=0.016和0.047)。見圖3。

圖3 NSCLC癌組織中TNS1 mRNA高表達與低表達患者的累積無病生存曲線和累積總體生存曲線

2.3 TNS1在不同肺癌細胞中的表達

由圖4可見，A549和H1299細胞中TNS1mRNA和蛋白表達量明顯低于16HBE細胞(P均<0.01)。質(zhì)粒pcDNA3.1/TNS1轉(zhuǎn)染A549和H1299細胞48 h后，qRT-PCR檢測顯示，A549/pcDNA3.1/TNS1和H1299/pcDNA3.1/TNS1組細胞TNS1mRNA和蛋白表達量明顯高于相應(yīng)對照組 (P均<0.01)。

①：A549/pcDNA3.1;②：A549/pcDNA3.1/TNS1;③:H1299/pcDNA3.1;④:H1299/pcDNA3.1/TNS1圖4 qRT PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測不同細胞中TNS1 mRNA和蛋白表達

2.4 TNS1對A549和H1299細胞增殖能力的影響

由圖5可見，在48、72 h，A549/pcDNA3.1/TNS1和H1299/pcDNA3.1/TNS1組細胞增殖能力均明顯低于對照組(P<0.05和P<0.01)，表明pcDNA3.1/TNS1轉(zhuǎn)染組細胞生長受到抑制。克隆形成實驗顯示轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/TNS1組A549細胞和H1299細胞克隆形成能力均明顯低于對照組(t=-7.865和-8.877，P均<0.01)，見圖6。由此可見，TNS1可抑制A549和H1299細胞的增殖能力。

a：P<0.05，b：P<0.01，與同時間點A549/pcDNA3.1比較；c：P<0.05，d：P<0.01，與同時間點H1299/pcDNA3.1比較圖5 MTT法檢測A549和H1299細胞增殖能力

圖6 克隆形成實驗檢測A549和H1299細胞增殖能力

2.5 TNS1對A549和H1299細胞遷移能力的影響

細胞劃痕實驗結(jié)果顯示，在24、48 h，與對照組相比，A549/pcDNA3.1/TNS1和H1299/pcDNA3.1/TNS1組細胞遷移細胞數(shù)量明顯減少，遷移速度明顯減慢(P均<0.01) ，見圖7。由此說明，上調(diào)TNS1表達可明顯抑制A549和H1299細胞的遷移能力。

①：A549/pcDNA3.1；②：A549/pcDNA3.1/TNS1；③：H1299/pcDNA3.1；④：H1299/pcDNA3.1/TNS1圖7 劃痕實驗檢測A549和H1299細胞遷移能力

2.6 TNS1對A549和H1299細胞侵襲能力的影響

Transwell實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，A549/pcDNA3.1/TNS1和H1299/pcDNA3.1/TNS1組穿透基膜的細胞數(shù)明顯減少(t=-6.585和-7.637，P<均0.01)。由此說明，上調(diào)TNS1表達可明顯抑制A549和H1299細胞的侵襲能力。見圖8。

圖8 Transwell實驗檢測A549和H1299細胞的侵襲能力(×200)

2.7 TNS1 mRNA對E-鈣黏蛋白和波形蛋白的調(diào)控作用

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，與對照組相比，A549/pcDNA3.1/TNS1和H1299/pcDNA3.1/TNS1組細胞中E-鈣黏蛋白表達水平明顯增加(t=3.112和3.579，P均<0.01)，波形蛋白表達明顯降低(t=-4.757和-3.187，P均<0.01)。見圖9。

①：A549/pcDNA3.1;②:A549/pcDNA3.1/TNS1；③ H1299/pcDNA3.1;④ H1299/pcDNA3.1/TNS1圖9 蛋白質(zhì)印跡法檢測E-鈣黏蛋白和波形蛋白表達

3 討論

以往研究表明，TNS參與調(diào)節(jié)多種腫瘤細胞生物學(xué)活動，包括細胞黏附、遷移、增殖等，與腫瘤患者預(yù)后相關(guān)[10]。Zhan等[7]研究發(fā)現(xiàn)，TNS1在轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織中表達顯著降低，且TNS1高表達患者無轉(zhuǎn)移生存時間顯著長于低表達患者。曹一鑫等[8]報道胃癌腫瘤轉(zhuǎn)移患者TNS1蛋白表達率低于未發(fā)生轉(zhuǎn)移患者，是胃癌獨立的保護性預(yù)后因素。本研究發(fā)現(xiàn)，TNS1mRNA在NSCLC組織中的表達低于癌旁組織，且與NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及術(shù)后腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與遠處轉(zhuǎn)移是預(yù)后不良的表現(xiàn)，由此提示TNS1可能參與NSCLC細胞增殖與轉(zhuǎn)移。此外，TNS1mRNA高表達患者3年累積無病生存率和累積總體生存率均優(yōu)于低表達患者。由此表明，TNS1mRNA低表達促進肺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā),與患者不良預(yù)后有關(guān)。

此外，本研究體外實驗結(jié)果證實，上調(diào)TNS1表達可顯著抑制肺癌A549和H1299細胞增殖、遷移和侵襲能力。有研究發(fā)現(xiàn)，攜帶TNS1特定突變基因型的乳腺癌MDA-MB231細胞系遷移和侵襲能力增強[6]，提示TNS1可抑制乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移。Zhan等[7]研究亦證實，干擾TNS1表達可增強多種乳腺癌細胞系的侵襲能力，與乳腺癌細胞增殖及侵襲活性密切相關(guān)。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)與腫瘤細胞的原位侵襲和遠處轉(zhuǎn)移有著密切關(guān)系[11]。當(dāng)腫瘤細胞發(fā)生EMT，表現(xiàn)為上皮表型如角絲蛋白、E-鈣黏蛋白逐漸喪失，而間質(zhì)表型如波形蛋白、纖維連接蛋白、N-鈣黏蛋白的表達增加，與周圍細胞和基質(zhì)接觸減弱，導(dǎo)致腫瘤細胞遷移和運動能力增強[12]。EMT是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵機制，本研究結(jié)果顯示，TNS1高表達可引起NSCLC細胞E-鈣黏蛋白表達上調(diào)和波形蛋白表達下降，從而推測TNS1高表達可抑制EMT過程，負性調(diào)控NSCLC細胞侵襲和轉(zhuǎn)移。腫瘤細胞的增殖和遷移涉及多種細胞因子和多條信號傳導(dǎo)通路，Shinde 等[13]研究表明，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶-2和TNS1共同參與乳腺癌細胞EMT的過程。Zhan等[7]研究證實，乳腺癌細胞中TNS1表達下降促進Rho-GTP酶家族成員Cdc42基因活化，Cdc42可能是TNS1影響乳腺癌腫瘤細胞增殖能力的靶基因。關(guān)于TNS1對NSCLC細胞轉(zhuǎn)移具體的調(diào)控機制尚有待進一步研究。

綜上所述，TNS1在NSCLC組織中呈低表達，且與肺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)后遠處轉(zhuǎn)移及患者的不良預(yù)后有關(guān)，其可抑制肺癌細胞增殖和遷移，提示TNS1可作為NSCLC轉(zhuǎn)移發(fā)生的潛在指標(biāo)。