王 燕， 齊文杰， 曾亞薇， 谷培云， 苗 彬

1 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院 感染內(nèi)科， 北京 100050； 2 首都醫(yī)科大學(xué) 研究生院， 北京 100069

重癥急性胰腺炎(SAP)相關(guān)性肺損傷是SAP早期最常見、最嚴(yán)重的并發(fā)癥,急性胰腺炎(AP)患者約1/3伴發(fā)急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合征, 1周內(nèi)死亡AP患者大約60%伴有急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合征[1]，而SAP死亡病例中有50%發(fā)生重度肺損傷[2]。研究[3]發(fā)現(xiàn)，引流胸導(dǎo)管淋巴液能夠明顯減少SAP病程中炎癥因子釋放。臨床上通過(guò)大量補(bǔ)液以改善腸道缺血以及在疾病得到有效控制后及早進(jìn)食以促進(jìn)胃腸動(dòng)力恢復(fù)，從而達(dá)到“功能性阻斷”腸淋巴循環(huán)治療AP。厚樸酚具有抑制炎癥反應(yīng)、緩解炎性疼痛等作用[4]。研究[5]發(fā)現(xiàn)，厚樸酚能夠通過(guò)拮抗氧化應(yīng)激和調(diào)控Cajal細(xì)胞改善膿毒癥所致胃腸運(yùn)動(dòng)障礙。本實(shí)驗(yàn)從厚樸酚功能性阻斷腸淋巴循環(huán)方面研究厚樸酚對(duì) SAP并發(fā)急性肺損傷的治療作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑 主要試劑:3.75%?；悄懰徕c(美國(guó)Sigma公司)、戊巴比妥鈉(德國(guó)默克公司)、厚樸酚(北京環(huán)亞泰克生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司)、DMSO(北京環(huán)亞泰克生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司)、蛋白裂解液( 北京普利萊公司)、蛋白酶抑制劑( 北京普利萊公司)等。主要儀器：DHG9070B電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海安亭科學(xué)儀器有限公司)、Sigma3K-18高速低溫離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)、QL-901旋渦混合器(江蘇其林貝爾儀器制造有限公司)、XQ-04750-50勻漿機(jī)(美國(guó)Biospec公司)、BX43型光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)等。

1.2 動(dòng)物模型構(gòu)建與分組 雄性健康SD大鼠30只，體質(zhì)量(300±50)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2016-0006，使用許可證號(hào)：SYXK(京)2017-0019)]。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，術(shù)前12 h禁食，正常飲水。隨機(jī)分為假手術(shù)組、SAP組和厚樸酚治療組，每組各10只。假手術(shù)組為正常大鼠開腹翻動(dòng)胰腺后直接縫合；SAP組采用逆行胰膽管注射3.75%的?；悄懰徕c建立SAP大鼠模型；厚樸酚治療組：經(jīng)陰莖靜脈注射厚樸酚0.2 mg/kg，15 min后，采用逆行胰膽管注射3.75%的?；悄懰徕c建立SAP大鼠模型。SAP組及厚樸酚治療組于造模后4 h經(jīng)腸系膜淋巴管引流淋巴液、腹主靜脈采血，后處死大鼠留取肺組織、腸組織，并保存于-80 ℃冰箱。假手術(shù)組同樣時(shí)間點(diǎn)用上述方法留取腸系膜淋巴液、靜脈血、肺和腸組織。

1.3 標(biāo)本采集 自腸系膜淋巴管進(jìn)行淋巴液引流至EP管中，置于-80 ℃保存。打開腹腔使用靜脈采血針穿刺下腔靜脈抽取血液4～5 ml，取上部血清，-20 ℃條件下保存，用于后期ELISA檢測(cè)。取冷凍保存腸、肺組織約100 mg，每1 mg組織加入10 μl組織裂解液，置于冰上，進(jìn)行充分勻漿。均漿液轉(zhuǎn)移至1.5 ml無(wú)菌EP管中，12 000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清液至另一1.5 ml無(wú)菌EP管中，備用于ELISA和Western Blot檢測(cè)。

1.4 檢測(cè)指標(biāo) ELISA檢查肺、腸組織內(nèi)二胺氧化酶(DAO)、D-乳酸(DLA)、IL-1β、IL-8、IL-10、TNFα、高遷移率族蛋白B1(HMGB1)、晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)水平變化。Westrrn Blot方法檢測(cè)淋巴液中Toll樣受體4(TLR4)水平。對(duì)肺臟、胰腺及回腸進(jìn)行組織學(xué)觀察及病理評(píng)分[3,6]。造模后4 h，分別稱取0.1 g肺組織放入培養(yǎng)皿中，將組織放入60 ℃干燥箱內(nèi)72 h，重新稱量組織干重。

1.5 倫理學(xué)審查 本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

2 結(jié)果

2.1 病理檢測(cè)結(jié)果

2.1.1 各組胰腺組織病理學(xué)改變 大鼠胰腺大體觀察以及鏡下觀察均無(wú)明顯異常；SAP 組大鼠胰腺大體觀察時(shí)可見出血、壞死部分，同時(shí)腹腔內(nèi)有大量血性積液(圖1)。鏡下觀察：SAP組大鼠胰腺組織小葉間有明顯水腫以及較大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，有出血及胰腺小葉結(jié)構(gòu)破壞的情況，同時(shí)腺泡細(xì)胞有明顯壞死(圖2)，證實(shí)SAP大鼠造模成功。

2.1.2 各組肺組織病理學(xué)改變 鏡下觀察(圖3)：假手術(shù)組肺組織病理無(wú)明顯改變，病理評(píng)分0.34±0.02；SAP組肺間質(zhì)可見充血、水腫、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、出血，病理評(píng)分2.67±0.52；厚樸酚治療組肺組織輕度出血和炎細(xì)胞浸潤(rùn)，病變程度較SAP組輕，病理評(píng)分1.50±0.55。3組間病理評(píng)分比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=29.5，P<0.001)，進(jìn)一步兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。根據(jù)大鼠肺組織病理可見SAP肺損傷模型制備成功。

2.1.3 各組腸組織病理學(xué)改變 假手術(shù)組腸組織大體形態(tài)未見明顯異常；SAP組腸管擴(kuò)張、充血、水腫，可見腸系膜皂化斑；厚樸酚治療組大鼠腸管擴(kuò)張、充血、水腫的程度減輕，腸系膜皂化斑范圍減少(圖4)。

鏡下觀察(圖5)：假手術(shù)組未見明顯異常，病理評(píng)分0.33±0.02。SAP組可見腸間質(zhì)水腫、充血、大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腸絨毛水腫增粗、高度縮短，絨毛上皮剝脫、上皮頂端片狀壞死及脫落，杯狀細(xì)胞排列紊亂、細(xì)胞數(shù)量減少；黏膜變薄，腺體排列稀疏，且數(shù)量減少，病理評(píng)分4.83±0.41。厚樸酚治療組較SAP組病理?yè)p傷均有不同程度減輕，病理評(píng)分3.50±0.55。3組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=131.136,P<0.001)，進(jìn)一步兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)。

2.2 各指標(biāo)ELISA檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 血清中各指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 3 組間IL-1β、IL-8、TNFα、DAO、DLA、HMGB1、RAGE水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，進(jìn)一步兩兩比較顯示，厚樸酚治療組血清中IL-1β、IL-8、TNFα、DAO、DLA、HMGB1、RAGE水平均低于SAP組(P值均<0.05);假手術(shù)組血清中IL-1β、IL-8、TNFα、DAO、DLA、HMGB1、RAGE水平均低于SAP組(P值均<0.05)(表1)。

2.2.2 淋巴液中各指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 3組間IL-1β、IL-8、TNFα、DAO、DLA、HMGB1、RAGE水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，進(jìn)一步兩兩比較顯示，厚樸酚治療組大鼠淋巴液中IL-1β、IL-8、TNFα、DAO、DLA、HMGB1、RAGE水平均低于SAP組(P值均<0.05);假手術(shù)組IL-1β、IL-8、TNFα、DAO、DLA、HMGB1、RAGE水平均低于SAP組(P值均<0.05)(表2)。

2.2.3 腸組織中各指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 3組間IL-1β、IL-8、TNFα、HMGB1、RAGE水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，進(jìn)一步兩兩比較顯示，厚樸酚治療組IL-1β、IL-8、TNFα、HMGB1、RAGE均低于SAP組(P值均<0.05);假手術(shù)組IL-1β、IL-8、TNFα、HMGB1、RAGE水平均低于SAP組(P值均<0.05)(表3)。

2.2.4 肺組織中各指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 3組間IL-1β、IL-8、TNFα、HMGB1、RAGE水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，進(jìn)一步兩兩比較顯示，厚樸酚治療組大鼠肺組織中IL-1β、IL-8、TNFα、HMGB1、RAGE均低于SAP組(P值均<0.05);假手術(shù)組IL-1β、IL-8、TNFα、HMGB1、RAGE水平均低于SAP組(P值均<0.05)(表4)。

表1 2組大鼠血清中相關(guān)成分比較

表2 2組大鼠淋巴液中相關(guān)成分比較

表3 2組大鼠腸組織中相關(guān)成分比較

表4 2組大鼠肺組織中相關(guān)成分比較

2.3 Western Blot檢測(cè)淋巴液中TLR4水平 3組大鼠淋巴液中TLR4蛋白表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(厚樸酚治療組 vs SAP組 vs 假手術(shù)組：0.405±0.022 vs 0.588±0.037 vs 0.302±0.194,F=170.536,P<0.01),進(jìn)一步兩兩比較，厚樸酚組及假手術(shù)組均低于SAP組(P值均<0.05)(圖6)。

2.4 肺濕/干重比 3組大鼠肺濕/干重比比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(厚樸酚組 vs SAP組 vs 假手術(shù)組:3.51±0.09 vs 4.64±0.15 vs 2.83±0.20,F=205.930，P<0.001)，進(jìn) 一步兩兩比較，SAP組高于厚樸酚治療組及假手術(shù)組(P值均<0.05)。

3 討論

SAP時(shí)由于體液的大量丟失，體內(nèi)循環(huán)血流量明顯減少，交感神經(jīng)興奮，使腸道血管發(fā)生強(qiáng)烈收縮，腸道缺血、缺氧，黏膜屏障功能破壞，細(xì)菌、內(nèi)毒素易位入血，形成腸源性感染，導(dǎo)致中毒性腸麻痹、腸衰竭[7-8]。腸衰竭導(dǎo)致細(xì)菌、毒素吸收入血，腸道菌群移位，引發(fā)其他臟器的功能障礙。SAP相關(guān)性肺損傷是SAP早期最常見、最嚴(yán)重的并發(fā)癥。

厚樸酚為厚樸提取物重要的單體成分之一，具有抗氧化、抗菌、抗內(nèi)毒素、抗炎、抗腫瘤等藥理作用，臨床上主要用于炎癥、細(xì)菌感染等疾病的治療[9-10]。段金旗等[11]發(fā)現(xiàn),厚樸酚能顯著改善膿毒癥大鼠肺組織結(jié)構(gòu)，減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，降低TNFα、IL-1β、IL-6，細(xì)胞間黏附分子1、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白2、丙二醛水平以及黃嘌呤氧化酶活性，提高超氧化物歧化酶及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性，最終抑制膿毒癥引起的大鼠急性肺損傷，其機(jī)制可能與阻斷NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。

Seely等[12]研究顯示，SAP患者IL-1 、IL-8血清水平顯著高于健康組。這些炎癥因子對(duì)炎癥反應(yīng)起正反饋?zhàn)饔? 可加重SAP。IL-8可與中性粒細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合, 導(dǎo)致白細(xì)胞發(fā)生變形反應(yīng)，脫顆粒，釋放蛋白溶解酶和活性氧, 從而引起組織損傷的發(fā)生。IL-1β能促進(jìn)白細(xì)胞在炎癥胰腺的聚集并能激活中性粒細(xì)胞，在SAP的多臟器功能衰竭的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。IL-1β可促使骨髓釋放中性粒細(xì)胞，并聚集在肺部釋放溶酶體酶2誘導(dǎo)TNFα、IL-6的生成[13]。IL-10是人體中發(fā)現(xiàn)的少數(shù)抗炎因子之一，主要由輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)產(chǎn)生，也可由B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和肥大細(xì)胞產(chǎn)生，能抑制Th1釋放細(xì)胞因子。內(nèi)源性和外源性的IL-10均能在轉(zhuǎn)錄水平上強(qiáng)烈抑制IL-1、IL-6、IL-8、TNFα、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、粒細(xì)胞集落刺激因子的合成。IL-10主要是通過(guò)NF-κB的DNA結(jié)合能力，抑制NF-κB啟動(dòng)相關(guān)前炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄。劉志勇等[14]發(fā)現(xiàn)，AP大鼠造模12 h后，血清中IL-10水平高于假手術(shù)組。宋潤(rùn)波等[15]發(fā)現(xiàn)，SAP大鼠造模6 h后血清中IL-10水平與假手術(shù)組的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，造模12 h后血清中IL-10水平高于假手術(shù)組，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)中3組IL-10水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮與實(shí)驗(yàn)造模時(shí)間短有關(guān)。TNFα主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生, 是SAP相關(guān)肺損傷重要的炎性細(xì)胞因子。30%～40%的AP患者TNFα水平增加[16]。在SAP被誘發(fā)1 h后，胰腺組織及血清TNFα即可被檢測(cè)到，并在其后的6 h內(nèi)迅速上升，其升高程度與胰腺損傷及炎癥程度直接相關(guān)[17]。陸海華等[18]研究發(fā)現(xiàn), AP相關(guān)肺損傷組TNFα表達(dá)水平明顯高于AP組, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。HMGB1廣泛分布于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，可在炎癥晚期發(fā)揮作用。HMGB1能通過(guò)激活機(jī)體單核/巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞，增加炎癥因子的釋放，參與全身炎癥反應(yīng)；它還能損傷內(nèi)皮功能，促使纖溶水平失衡，增加腸黏膜通透性[19]。SAP胰腺損傷與HMGB1的異常表達(dá)相關(guān)，SAP時(shí)血清及胰腺組織中HMGB1表達(dá)均可增強(qiáng)[20]。當(dāng)HMGB1主動(dòng)或者被釋放到細(xì)胞外時(shí)通過(guò)TLR4受體通路，刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生炎性介質(zhì)，形成惡性環(huán)路，使AP病情不斷加重。TLR4是發(fā)現(xiàn)最早的TLR亞型之一，TLR4的表達(dá)受IL-4、TLR4增強(qiáng)子、IL-1β等細(xì)胞因子的影響。RAGE與HMGB1具有高度親和力，HMGB1和RAGE進(jìn)行結(jié)合以后，使NF-κB因子向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，引起整條炎性信號(hào)通路的激活，并進(jìn)一步誘導(dǎo)分泌大量炎性因子、趨化因子，參與炎性細(xì)胞激活、遷移和趨化作用等[21]。

本研究發(fā)現(xiàn)，厚樸酚能夠改善腸屏障功能，降低淋巴液及血清中炎癥因子水平，抑制HMGB1-TLR4/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，減輕SAP肺損傷，這為中西醫(yī)結(jié)合治療SAP提供了的思路。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻(xiàn)聲明：王燕負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)采集及分析，實(shí)驗(yàn)實(shí)施，撰寫論文；齊文杰參與實(shí)驗(yàn)實(shí)施，修改論文；曾亞薇、谷培云參與實(shí)驗(yàn)實(shí)施；苗彬負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，修改論文，指導(dǎo)撰寫文章。