董睿瀟 莫力聞 劉丹陽 施嘉明 史 記 元 野 馬獻(xiàn)發(fā)*

1 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院 哈爾濱 150030

2 中國煙草總公司黑龍江省分公司牡丹江煙草科學(xué)研究所 哈爾濱 150001

土壤微生物與酶活性是表征土壤肥力的重要指標(biāo)，兩者在土壤的物質(zhì)轉(zhuǎn)化和能量流動過程中起著極其重要的作用[1]。土壤微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成成分，參與并推動著土壤有機(jī)質(zhì)的分解和礦質(zhì)元素的轉(zhuǎn)化[2]。其中，微生物量碳、氮被認(rèn)為是土壤中植物有效養(yǎng)分的儲存庫和植物生長可利用養(yǎng)分的重要來源[3]。土壤酶是土壤生態(tài)系統(tǒng)新陳代謝的重要動力，也是土壤中各種生物化學(xué)反應(yīng)良好的催化劑[4]，其活性可以反映出不同土壤生物化學(xué)反應(yīng)的相對強(qiáng)度和土壤的養(yǎng)分狀況[5]。例如，土壤蔗糖酶、脲酶、磷酸酶等水解酶活性能夠表征土壤碳、氮、磷等養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化強(qiáng)度[6]。腐植酸是廣泛存在于自然界中的一類芳香族富含酸性基團(tuán)的高分子縮合物[7]，通常呈黑色或褐色的膠體狀態(tài)。由于腐植酸具有良好的吸收、絡(luò)合、交換、緩沖能力和生理活性，它在改良土壤結(jié)構(gòu)和提高土壤肥力等方面具有重要作用，同時也會直接或間接影響土壤微生物和酶活性。

雖然已有試驗證明，施用腐植酸能促進(jìn)土壤微生物的活動，顯著增加土壤細(xì)菌、真菌、放線菌的數(shù)量和提高土壤酶活性。但腐植酸與土壤微生物及土壤酶活性關(guān)系的研究還有待于進(jìn)一步完善[8]。本文在介紹施用腐植酸對土壤微生物數(shù)量、多樣性和參與碳、氮、磷轉(zhuǎn)化等關(guān)鍵酶活性影響的基礎(chǔ)上，對腐植酸改善土壤微生物和酶活性的作用機(jī)理進(jìn)行綜述，以期為腐植酸在提高土壤質(zhì)量等方面的應(yīng)用研究提供參考。

1 腐植酸對土壤微生物及酶活性的影響

1.1 腐植酸對土壤微生物的影響

1.1.1 腐植酸對土壤微生物量的影響

土壤微生物量是指土壤中除了活的植物體（如植物根系等）外，體積小于5×103μm3的生物總量[9]，是土壤有機(jī)質(zhì)中最活躍和最易變化的部分[10]。土壤微生物量代表了參與土壤中養(yǎng)分循環(huán)和有機(jī)物質(zhì)轉(zhuǎn)化的微生物數(shù)量[11]，是衡量土壤肥力水平和土壤質(zhì)量的重要生物學(xué)指標(biāo)[12]。

廣義的土壤微生物量包括微生物量碳、氮、磷、硫等。已有研究證實，施用褐煤腐植酸能顯著增加土壤微生物量碳、氮、磷含量，且連續(xù)施用年限越久，增強(qiáng)效果越好；但褐煤腐植酸對土壤微生物量碳、氮、磷含量影響程度不同，多年施用后對土壤微生物量磷的影響大于對土壤微生物量碳、氮[13]。此外，腐植酸與土壤改良劑結(jié)合起來施用更能充分發(fā)揮其增加土壤微生物量的潛力。現(xiàn)有研究證實腐植酸與生物炭配合使用具有累積效應(yīng)，對土壤微生物量碳、氮、磷的增長幅度更大[14]。

1.1.2 腐植酸對土壤微生物數(shù)量的影響

施用腐植酸能顯著提高土壤三大類群微生物（細(xì)菌、真菌和放線菌）的數(shù)量。首先，不同用量水平的腐植酸均可明顯增加土壤中三大類群微生物的數(shù)量[15]。其次，當(dāng)選取其他等養(yǎng)分的施肥處理作對比時，腐植酸肥處理的土壤中三大類群微生物的數(shù)量明顯高于這些施肥處理[16]，這進(jìn)一步明確了腐植酸對土壤微生物數(shù)量的促進(jìn)作用。

隨著腐植酸用量的增加，土壤微生物菌群數(shù)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。袁婉潼[17]和Sellamuthu等[18]試驗發(fā)現(xiàn)，雖然施用腐植酸會顯著增加土壤中各類微生物的數(shù)量，但隨著腐植酸投入量的增加，各種微生物的數(shù)量均表現(xiàn)出先增加后減少的變化規(guī)律。

不同用量的腐植酸對三大菌群數(shù)量的影響效果不同。研究表明，相較于不施肥處理，腐植酸處理的種群數(shù)量同比增長顯著，且提高幅度以細(xì)菌最高，真菌次之，放線菌最低[19]。

1.1.3 腐植酸對土壤微生物多樣性的影響

土壤微生物多樣性是指土壤生態(tài)系統(tǒng)中所有的微生物種類、它們擁有的基因以及這些微生物與環(huán)境之間相互作用的多樣化程度，可以從物種多樣性、功能多樣性、結(jié)構(gòu)多樣性及遺傳多樣性等不同層面分析[20]。

腐植酸對土壤微生物群落物種變化度、差異度和均一性具有一定影響。相關(guān)試驗證明，施用腐植酸的土壤微生物群落的Shannon指數(shù)（評估物種豐富度）和McIntosh指數(shù)（評估物種均勻度）均顯著增長，且在一定程度上隨腐植酸的施用量增加而增加。Yi等[21]也證實這一觀點，在土壤中加入不同質(zhì)量比的腐植酸（0.2%～1.5%）可增加微生物群落的豐度，低劑量的腐植酸（0.2%）對微生物群落沒有明顯影響，高劑量的腐植酸（0.5%～1.5%）對微生物群落有明顯影響，例如將甲烷桿菌的相對豐度從13.7%提高到23.7%，深古菌的相對豐度從8.9%提高到45.6%。由此可見，在一定的濃度范圍內(nèi)腐植酸能提高土壤微生物群落物種的豐度和均勻度[22]。高通量測序技術(shù)也證實了腐植酸可以顯著增加細(xì)菌和真菌的多樣性，在玉米抽雄期和生育期，用量為3.75 t/hm2腐植酸處理的細(xì)菌OTUs（定義為97%的序列相似性）數(shù)量相比不施肥處理提高7.44%和4.82%。在玉米六葉期、抽雄期和生育期，腐植酸處理的真菌OTUs數(shù)量相比不施肥處理提高28.92%、30.81%和8.73%[23]。

同樣，腐植酸可以通過改善土壤微生物的整體代謝活性影響其多樣性。通常選定平均顏色變化率（AWCD）反映土壤微生物的代謝活性和其對碳源的利用程度，其值越大，表示微生物密度越大，活性越高[24]。劉佳歡等[25]的試驗研究發(fā)現(xiàn)，施用腐植酸肥料可以顯著提高土壤微生物的AWCD，且施用量越多，AWCD越高。譚兆贊等[26]的試驗發(fā)現(xiàn)，生化腐植酸處理的AWCD較等養(yǎng)分無機(jī)肥對照最大提高39.3%。因此，可以認(rèn)為施用腐植酸肥料能促進(jìn)土壤微生物的整體代謝活性，增強(qiáng)微生物對碳源的利用能力。

1.2 腐植酸對土壤酶活性的影響

1.2.1 腐植酸對土壤脲酶活性的影響

脲酶是一種作用于線型酰胺鍵的酶，它能催化尿素水解生成氨、二氧化碳等小分子無機(jī)化合物[27]，是參與土壤氮循環(huán)過程的一種重要的酶。整體來看，腐植酸對土壤脲酶活性具有一定的抑制作用。研究表明，在施肥區(qū)或無肥區(qū)的土壤上增施腐植酸都會對原有條件下的土壤脲酶活性起到抑制作用[27]。從作用時期來看，腐植酸一般在作物生育前期表現(xiàn)出對脲酶活性的抑制作用，而在后期卻無明顯的抑制作用或表現(xiàn)出對土壤脲酶活性的促進(jìn)作用。李作梅等[28]的研究證實了這一觀點，他們發(fā)現(xiàn)不同施肥處理下的土壤脲酶活性變化趨勢是相同的，但施用腐植酸肥料處理的土壤脲酶活性同比前期降低，后期提高。此外，3種不同來源的腐植酸對土壤脲酶活性的影響程度存在一定的差異。在培養(yǎng)前期均表現(xiàn)出對土壤脲酶活性的抑制作用，且以褐煤腐植酸表現(xiàn)最佳，泥炭腐植酸次之，風(fēng)化煤腐植酸再次之。這有利于抑制尿素的水解，延長尿素的肥效；而在培養(yǎng)后期，泥炭腐植酸對脲酶活性具有一定的促進(jìn)作用，這有利于后期尿素肥效的發(fā)揮[29]。

1.2.2 腐植酸對土壤過氧化氫酶活性的影響

土壤過氧化氫酶促進(jìn)過氧化氫分解生成水和氧氣，有利于防止過氧化氫對土壤和植物的毒害作用[30]。關(guān)于腐植酸對土壤過氧化氫酶的影響，科學(xué)界一直持有兩種觀點。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，腐植酸具有提高土壤過氧化氫酶活性的能力。腐植酸的施入促進(jìn)了土壤微生物的活動，加強(qiáng)了土壤氧化過程的強(qiáng)度[31]，且試驗證實，腐植酸通過降低鎘的有效性而增加過氧化氫酶的活性[32]。但也有人持有相反的觀點，認(rèn)為腐植酸具有抑制土壤過氧化氫酶活性的能力。一方面是在施用腐植酸多年后，某些用量水平下的腐植酸呈現(xiàn)出抑制土壤過氧化氫活性的效果[33]；另一方面，有試驗證實泥炭、褐煤和風(fēng)化煤來源的腐植酸處理均能夠?qū)^氧化氫酶活性起到抑制作用，使土壤去除土體內(nèi)過氧化氫的能力減弱，且以褐煤腐植酸的抑制作用最為突出，其次為風(fēng)化煤腐植酸，泥炭腐植酸的作用最弱[29]。這些研究結(jié)果的差異可能與施用腐植酸種類、施用量、時間、施用方式及試驗提供的土壤類型不同有關(guān)。因此，腐植酸對土壤過氧化氫酶活性的影響有待進(jìn)一步試驗驗證。

1.2.3 腐植酸對土壤磷酸酶活性的影響

磷酸酶能夠催化土壤有機(jī)磷化合物礦化，其活性高低直接影響著土壤中有機(jī)磷的分解、轉(zhuǎn)化及生物有效性，是評價土壤磷素轉(zhuǎn)化方向的重要指標(biāo)[34]。腐植酸能夠顯著提高土壤酸性磷酸酶的活性，腐植酸和無機(jī)肥配合施用具有累加效應(yīng)，其處理對改善酸性磷酸酶活性的效果更佳[35]。對于中性磷酸酶而言，不同來源的腐植酸對其活性具有不同程度的促進(jìn)作用。以褐煤腐植酸最佳，風(fēng)化煤腐植酸次之，最后為泥炭腐植酸。此外，不同來源的腐植酸對酶活性的作用時期也不同，褐煤腐植酸在整個培養(yǎng)期對中性磷酸酶活性起到較好的促進(jìn)作用；風(fēng)化煤腐植酸僅在培養(yǎng)前期對其活性表現(xiàn)出最佳效果；而泥炭腐植酸在培養(yǎng)期對中性磷酸酶的活性促進(jìn)作用不明顯[29]。此外，腐植酸的施入，同樣也能改善堿性磷酸酶的活性，使難溶態(tài)磷活化并轉(zhuǎn)變?yōu)橛行B(tài)磷，加速了土壤磷循環(huán)過程。Sellhmutlu等[18]的研究則進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，不同用量的腐植酸和無機(jī)肥料配合施用對堿性磷酸酶活性起到了一定程度的促進(jìn)作用，但隨著腐植酸施用量的增加，作用效果先加強(qiáng)后減弱。從改善磷酸酶活性的角度來看，腐植酸能夠適用于不同酸堿環(huán)境的土壤，并在一定用量范圍內(nèi)可以顯著增強(qiáng)土壤磷素的有效性。

1.2.4 腐植酸對土壤蔗糖酶活性的影響

蔗糖酶能促使蔗糖分解成葡萄糖和果糖，是參與土壤碳循環(huán)重要的酶。它不僅能夠表征土壤生物學(xué)活性強(qiáng)度，也能評價土壤熟化程度和土壤肥力水平[30]。通過大量試驗分析得出，常量或減量施肥的基礎(chǔ)上增施腐植酸可明顯增強(qiáng)土壤蔗糖酶活性，并從整體表現(xiàn)來看，腐植酸復(fù)合肥處理的蔗糖酶活性高于等養(yǎng)分復(fù)合肥和不施肥處理。此外，不同用量的腐植酸對土壤蔗糖酶的活性具有不同程度的增強(qiáng)作用。并不是用量水平越高，其對酶活性作用效果越好，在一定范圍內(nèi)，蔗糖酶活性隨著腐植酸用量的增加而增強(qiáng)[36]。有研究發(fā)現(xiàn)，相比不施腐植酸的處理，腐植酸用量為60、120和300 kg/hm2蔗糖酶活性分別同比增長6.03%～27.13%、25.86%～51.87%、21.12%～38.32%，以腐植酸用量為120 kg/hm2的作用效果最好，超出120 kg/hm2反而會降低其對蔗糖酶活性的促進(jìn)作用。在實際生產(chǎn)中，腐植酸的最適用量因各地區(qū)的土壤理化性質(zhì)和栽培方式的不同而有所差別，各地區(qū)要進(jìn)行田間試驗找出相適應(yīng)的腐植酸合理用量范圍，在所限條件下充分發(fā)揮腐植酸的最大效應(yīng)?？梢?，適宜的施用方式和用量的腐植酸能夠顯著提高土壤蔗糖酶活性。然而，不同來源的腐植酸對土壤蔗糖酶活性的作用效果不同。風(fēng)化煤腐植酸及泥炭腐植酸均能顯著提高土壤蔗糖酶的活性，且風(fēng)化煤腐植酸對蔗糖酶活性的影響更大，褐煤腐植酸對蔗糖酶活性的影響不明顯[29]。

2 腐植酸對土壤微生物及酶活性的作用機(jī)理

2.1 腐植酸對土壤微生物的作用機(jī)理

腐植酸直接影響土壤微生物的生理活動[37]，腐植酸對微生物膜透性的增強(qiáng)作用被認(rèn)為是刺激微生物生長和代謝的原因[38]。腐植酸為兩性膠體，表面活性大，易被微生物細(xì)胞膜吸附，可通過與營養(yǎng)元素的絡(luò)合、螯合或緊密吸附，增強(qiáng)微生物對營養(yǎng)元素的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，加快微生物細(xì)胞內(nèi)生理生化反應(yīng)速率。

腐植酸可作為微生物體內(nèi)呼吸作用的電子受體，促進(jìn)能量的合成，進(jìn)而促進(jìn)微生物生長和繁殖[39]。有研究表明[40]，一些土壤微生物可以利用腐植酸作為有機(jī)化合物和氫的厭氧氧化電子受體，在電子傳遞過程中產(chǎn)生支持微生物生長的能量。而且微生物還原腐植酸也增強(qiáng)了微生物還原其他不易反應(yīng)的電子受體的能力，如不溶性的鐵氧化物，腐植酸可以在微生物和鐵氧化物之間傳遞電子。

此外，腐植酸還可以通過改良土壤結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和營養(yǎng)狀況來間接影響微生物。①腐植酸為土壤微生物提供營養(yǎng)物質(zhì)和能量來源。土壤微生物營養(yǎng)主要包括碳、氧、氮等大量元素以及一些礦質(zhì)元素。腐植酸具有吸附、絡(luò)合、螯合、離子交換和氧化還原功能，能將NH3-N吸收固定轉(zhuǎn)化為有效的NH4

+-N，N2O轉(zhuǎn)化為NO3-，可減少土壤氮素以NH3-N和N2Ox形態(tài)的揮發(fā)損失；腐植酸與Al3+、Fe3+、Ca2+、Mg2+等金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，減少或避免它們對磷的固定作用[41]，也可與難溶性中微量元素發(fā)生螯合反應(yīng)，生成溶解度好且易被微生物吸收的腐植酸與微量元素螯合物[42]，能將土壤中難溶性磷、鉀、中微量元素轉(zhuǎn)化為有效態(tài)養(yǎng)分，提高土壤中無效態(tài)養(yǎng)分的有效性[43]，從而為土壤微生物提供更充足的營養(yǎng)。此外，腐植酸含有碳、氫、氧等元素，在分解過程中這些元素釋放出來為土壤微生物提供碳源和氮源，供微生物生長和繁殖。②腐植酸為土壤微生物提供了適宜的生存環(huán)境。土壤微生物生存需要適宜的溫度、水分、pH及通氣狀況等。腐植酸中活性官能團(tuán)羥基、羧基可與土壤中二價離子（如Ca2+）發(fā)生凝聚反應(yīng)，再經(jīng)過植物根系的生理作用促進(jìn)土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)的形成[44]，使土壤中分散的顆粒膠連在一起，有效降低土壤容重、增加土壤孔隙度和持水量，改善土壤團(tuán)聚體的穩(wěn)定性和大團(tuán)聚體的微觀結(jié)構(gòu)[45]，從而優(yōu)化土壤中的液相、氣相物質(zhì)及土壤熱狀況[42]。此外，腐植酸分子結(jié)構(gòu)中含有羥基和酚羥基等弱酸性官能團(tuán)，使其具有良好的緩沖性能，腐植酸與其鹽類形成一套緩沖體系，以此來調(diào)節(jié)和穩(wěn)定土壤pH，從而促進(jìn)土壤微生物的繁殖和活動，增加土壤微生物的數(shù)量和種類。

總的來說，凡是土層深厚、質(zhì)地疏松、理化性質(zhì)優(yōu)良、有效養(yǎng)分含量較高的土壤中微生物量比較高[46]。腐植酸不僅有效地改善了土壤的結(jié)構(gòu)特性，而且儲存和提供了豐富的有益元素和活性因子[47]，腐植酸是土壤肥力的核心物質(zhì)，對微生物具有明顯促進(jìn)作用。

2.2 腐植酸對酶活性的作用機(jī)理

眾所周知，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中腐植酸常常被用作脲酶抑制劑。而腐植酸之所以能夠抑制脲酶活性，一方面腐植酸中大量不飽和化學(xué)鍵具有提高土壤抗氧化的能力，可以有效避免脲酶的生物活性官能團(tuán)-巰基（–SH）被氧化，另一方面腐植酸還能螯合Cu2+和Hg2+，這2種重金屬是常見的土壤脲酶巰基的抑制劑[48]，它們與巰基結(jié)合后，使脲酶活性中心的性質(zhì)與結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[49]，最終使脲酶的活性受到抑制。近期相關(guān)研究認(rèn)為，脲酶活性位點通道的開啟和關(guān)閉是由2個半胱氨酸殘基（αCys322）負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)，αCys322可以調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)的底物和產(chǎn)物通過活性中心通道。αCys322的巰基基團(tuán)可以與苯醌或鄰苯二酚進(jìn)行加成反應(yīng)形成共價化合物，從而阻斷脲酶活性，由于腐植酸中含有醌基和酚羥基，當(dāng)腐植酸添加到脲酶中時，腐植酸中的醌基或酚羥基與脲酶αCys322上的巰基基團(tuán)發(fā)生氧化還原反應(yīng)，形成脲酶-腐植酸絡(luò)合物，由于產(chǎn)物粒徑較大，共價絡(luò)合物可能形成空間位阻封閉活性部位通道的入口，從而抑制脲酶的活性[50]。

土壤蔗糖酶主要來源于植物根系分泌物，腐植酸能夠提高土壤蔗糖酶活性，恰恰是因為腐植酸施入土壤中，對植物根系產(chǎn)生一定的刺激作用，進(jìn)而提高根系的生理活性，增強(qiáng)其分泌物質(zhì)的能力，使得進(jìn)入到土壤中的蔗糖酶的量大大增加。隨后腐植酸和蔗糖酶形成了酶-腐植酸復(fù)合體，酶結(jié)構(gòu)得到穩(wěn)定，從而活性得以提高[51]。

土壤磷酸酶活性與土壤腐殖質(zhì)的含量呈正相關(guān)。腐植酸作為土壤腐殖質(zhì)的重要組分，必然增加土壤中腐殖質(zhì)含量，相應(yīng)地也能提高土壤磷酸酶的活性；此外，土壤中的磷酸酶也是來源于植物根系和微生物的分泌物，腐植酸能夠顯著增強(qiáng)植物和土壤微生物向外分泌多種有機(jī)物質(zhì)和酶類的能力[52]。所以說腐植酸對磷酸酶活性具有促進(jìn)作用。

除此之外，腐植酸對植物根系的刺激作用促使植物根系中三磷酸腺苷酶（ATP酶）相關(guān)基因的表達(dá)，腐植酸能夠促進(jìn)作物根系中H+-ATP酶編碼基因亞型MNA2的表達(dá)，能夠作為質(zhì)膜上H+-ATP酶誘導(dǎo)因子提高細(xì)胞活性，誘導(dǎo)質(zhì)膜表面H+-ATP酶數(shù)量的增加；同時，H+-ATP酶活性的增加也使電化學(xué)質(zhì)子梯度增加，從而影響酶的活性[53]。腐植酸也能夠?qū)ν寥乐衅渌傅幕钚援a(chǎn)生影響。有研究認(rèn)為，腐植酸與葡萄糖苷酶之間通過復(fù)合或者共價鍵結(jié)合的方式形成穩(wěn)定的復(fù)合物，改變了酶的構(gòu)象或阻礙底物與酶活性位點的結(jié)合，從而導(dǎo)致了酶活性的下降[54]。腐植酸施入土壤對酶二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋和無規(guī)則卷曲影響較小[55]，不會破壞酶的結(jié)構(gòu)。

總體而言，腐植酸與酶相互作用對酶的活性與穩(wěn)定性均有保護(hù)作用，而腐植酸對植物根系的刺激作用也是影響許多酶活性的重要原因。

3 研究展望

（1）不同種類的腐植酸對微生物和酶活性的具體影響效果和作用時期沒有準(zhǔn)確的試驗驗證，可以針對該方面進(jìn)一步研究，以期精確調(diào)控腐植酸對微生物和酶活性的影響，使腐植酸肥料利用率達(dá)到最大化，并在最佳的時間發(fā)揮其作用。

（2）雖然已有試驗證明，等碳的條件下，不同來源的腐植酸處理對中性磷酸酶活性的促進(jìn)作用存在一定差異，但并未說明對酶活性促進(jìn)程度的具體值，不同用量的腐植酸對酶活性的影響也未有報道，有待進(jìn)一步研究。

（3）同種腐植酸肥料在施用濃度和施用時間不同時，對微生物和酶活性的影響效果及作用機(jī)制有待深入研究。

（4）同種腐植酸施入理化性質(zhì)不同的土壤中，對微生物和酶活性的影響效果是否一致，對指導(dǎo)不同地區(qū)施用腐植酸具有重要意義，值得深入研究。

（5）腐植酸結(jié)構(gòu)對微生物和酶活性影響的作用機(jī)理還需完善，腐植酸結(jié)構(gòu)對微生物生長、蔗糖酶、磷酸酶的作用機(jī)理仍然需要進(jìn)行深入研究，以期更好地利用腐植酸改善土壤狀況，提高土壤質(zhì)量。